支持先天免疫功能的转基因小鼠模型的制作方法

支持先天免疫功能的转基因小鼠模型
1.政府许可权
2.本发明是在美国国立卫生研究院授予的编号为1r01132963的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
3.相关申请
4.本技术要求于2019年2月13日根据35 u.s.c.
§
119(e)提交的美国临时申请号62/805257的权益，其全部内容通过引用并入本文。


背景技术：

5.通过fms相关酪氨酸激酶3(flt3)受体的信号传导支持造血祖细胞和树突细胞(dc)的存活、增殖和分化(1，2)。人dc是将抗原呈递给人t细胞所必需的，并且是发展强大的人免疫应答所必需的(4)。成熟的人dc还产生白细胞介素15和支持自然杀伤(nk)细胞和人先天免疫系统的其他成分的发育的其他因子(5)。


技术实现要素：

6.在一些实施方式中，本文提供了免疫缺陷型nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nsg
tm
)小鼠(“nod scid gamma”小鼠)，其包含编码人flt3l的核酸(例如，包含人flt3l转基因)和失活的小鼠flt3等位基因。尽管nsg
tm
小鼠支持人造血干细胞(hsc)移植，但它表现出人hsc向树突细胞(dc)群体的发育受损(3)。为了提供支持人hsc发育成dc群体的小鼠模型，产生了表达人flt3l(nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l))的转基因nsg
tm
小鼠。然而，预料不到的是，与nsg
tm
对照相比，nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人hsc的移植显著降低。为了理解在nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中观察到的表型，flt3l的小鼠内源性受体
–
flt3
–
被敲除。令人惊讶的是，用这种转基因品系进行的人hsc移植，在本文中称为nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)，其导致(1)人cd3
+
t细胞和人cd33
+
骨髓细胞的百分比显著增加，(2)人cd123
+
浆细胞样树突细胞、cd56
+
人自然杀伤(nk)细胞、cd14
+
人单核巨噬细胞和cd11c
+
hla
‑
dr
+
人髓样树突细胞的百分比增加，以及(3)支持小肠中人cd45
+
细胞的粘膜移植。不受理论束缚，人hsc移植减少的nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)可能是人flt3l通过宿主小鼠flt3受体激活宿主小鼠dc和可能的其他先天免疫小鼠成分的结果。
7.因此，本公开的一些方面提供了包含编码人flt3l的核酸和失活的小鼠flt3等位基因(nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l))的nsg
tm
小鼠。这种小鼠模型支持将hsc发育成人先天免疫系统的许多不同细胞类型，包括树突细胞。
8.在一些实施方式中，小鼠包含使小鼠flt3等位基因失活的基因组修饰。在一些实施方式中，基因组修饰在选自编码区、非编码区和调控区的小鼠flt3等位基因的至少一个区域。在一些实施方式中，基因组修饰在小鼠flt3等位基因的至少一个编码区。例如，基因组修饰可以在外显子6、外显子7和/或外显子8中。在一些实施方式中，基因组修饰选自基因组缺失、基因组插入、基因组置换及其组合。例如，基因组修饰可以是基因组缺失。小鼠flt3等位基因可包含例如外显子6、外显子7和外显子8中核苷酸序列的基因组缺失。
9.在一些实施方式中，seq id no:5的核酸序列已从小鼠flt3等位基因中缺失。
10.在一些实施方式中，修饰的小鼠flt3等位基因包含seq id no:6的核酸序列。
11.在一些实施方式中，编码人flt3l的核酸包含人flt3l转基因。在一些实施方式中，人flt3l转基因包含seq id no:7的核酸序列。在一些实施方式中，小鼠表达人flt3l。人flt3l可以例如以至少10,000pg/ml的水平表达。在一些实施方式中，人flt3l以10,000pg/ml至30,000pg/ml的水平表达。例如，人flt3l可以以15,000
+
/
‑
1000pg/ml至17,000
+
/
‑
100pg/ml的水平表达。
12.在一些实施方式中，所述小鼠表达小鼠flt3l。在一些实施方式中，小鼠flt3l以至少2,000pg/ml的水平表达。例如，小鼠flt3l可以以5,000pg/ml至10,000pg/ml的水平表达。在一些实施方式中，小鼠flt3l以6,000pg/ml至8,000ml的水平表达。
13.在一些实施方式中，所述小鼠不表达可检测水平的小鼠flt3。在一些实施方式中，由所述小鼠表达的小鼠flt3的可检测水平低于1,000pg/ml。。
14.在一些实施方式中，小鼠缺乏可检测数量的cd135
+
多能祖细胞。
15.在一些实施方式中，小鼠进一步包含人cd34
+
造血干细胞。在一些实施方式中，人cd34
+
造血干细胞来自人脐带血、骨髓或动员的外周血。
16.在一些实施方式中，小鼠包含人cd45
+
细胞群。在一些实施方式中，人cd45
+
细胞群包含人cd45
+
/cd3
+
t细胞和/或人cd45
+
/cd33
+
骨髓细胞。
17.在一些实施方式中，相对于nod scid gamma对照小鼠或nod scid gamma
‑
hu
‑
flt3l对照小鼠，所述人cd45
+
细胞群包含增加的百分比的人cd45
+
/cd3
+
t细胞。例如，所述小鼠中人cd45
+
/cd3
+
t细胞的百分比增加至少25％、至少50％或至少100％。
18.在一些实施方式中，相对于nod scid gamma对照小鼠或nod scid gamma
‑
hu
‑
flt3l对照小鼠，所述人cd45
+
细胞群包含增加的百分比的人cd45
+
/cd33
+
骨髓细胞。例如，所述小鼠中人cd45
+
/cd33
+
骨髓细胞的百分比可增加至少25％、至少50％或至少100％。
19.在一些实施方式中，相对于nod scid gamma对照小鼠或nod scid gamma
‑
hu
‑
flt3l对照小鼠，所述小鼠包含增加的百分比的人cd123
+
浆细胞样树突细胞。例如，所述小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞的百分比可增加至少25％、至少50％或至少100％。
20.在一些实施方式中，相对于nod scid gamma对照小鼠或nod scid gamma
‑
hu
‑
flt3l对照小鼠，所述小鼠包含增加的百分比的人cd56
+
自然杀伤细胞。例如，所述小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞的百分比可增加至少25％、至少50％或至少100％。
21.在一些实施方式中，相对于nod scid gamma对照小鼠或nod scid gamma
‑
hu
‑
flt3l对照小鼠，所述小鼠包含增加的百分比的人cd14
+
单核巨噬细胞。例如，所述小鼠中人cd14
+
单核巨噬细胞的百分比可增加至少25％、至少50％或至少100％。
22.在一些实施方式中，相对于nod scid gamma对照小鼠或nod scid gamma
‑
hu
‑
flt3l对照小鼠，所述小鼠包含增加的百分比的人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞。所述小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞的百分比增加至少25％、至少50％或至少100％。
23.在一些实施方式中，所述小鼠在小鼠的小肠中表现出人cd45
+
细胞的粘膜移植。
24.本公开的其他方面提供了一种方法，对权利要求1
‑
23中任一项的小鼠进行亚致死辐照，并用人cd34
+
造血干细胞注射所述小鼠。
25.在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述小鼠施用感兴趣的试剂。在一些
实施方式中，所述方法进一步包括评估所述试剂对小鼠中的人体免疫细胞的影响。
26.在一些实施方式中，所述方法进一步包括选自t细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的人免疫细胞。
27.本公开的又一个方面提供了一种方法，其包括用编码人flt3l的核酸注射nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nod scid gamma)小鼠的前核，产生nsg tg(hu
‑
flt3l)小鼠，并使nsg tg(hu
‑
flt3l)小鼠中的小鼠flt3等位基因失活。
28.本公开的其他方面提供了一种方法，其包括使nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nod scid gamma)小鼠中的小鼠flt3等位基因失活以产生nsg flt3
null
小鼠，并用编码人flt3l的核酸注射nsg flt3
null
小鼠的前核。
29.本公开的其他方面提供了一种方法，其包括将prkdc
scid
纯合子、il2rg
tm1wjl
纯合子、flt3
null
纯合子和人flt3l转基因纯合子的雌性小鼠与prkdc
scid
纯合子、x
‑
连锁il2rg
tm1wjl
半合子，flt3
null
纯合子，人flt3l转基因纯合子的雄性小鼠进行繁殖，以产生后代小鼠。
30.此外，本公开的一些方面提供了包含编码人flt3l的核酸和失活的内源性flt3等位基因的nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj细胞。
31.本公开的其他方面包括包含编码人flt3l的核酸和失活的内源性flt3等位基因的细胞的转基因啮齿动物。在一些实施方式中，转基因啮齿动物是转基因小鼠。
32.本公开的一些方面提供了靶向小鼠flt3的grna，任选地其中所述grna靶向外显子6或外显子8或小鼠flt3。在一些实施方式中，所述grna包含seq id no:1的序列。在一些实施方式中，所述grna包含seq id no:2的序列。
33.本文还提供了包含本文所述的任一种grna的小鼠卵母细胞。在一些实施方式中，所述小鼠卵母细胞是受精的。
34.一些方面还提供了一种小鼠卵母细胞，其包含靶向小鼠flt3的外显子6的第一grna和靶向小鼠flt3的外显子8的第二grna，任选地其中所述小鼠卵母细胞是受精的。
35.在一些实施方式中，所述小鼠卵母细胞进一步包含cas9 mrna和/或cas9蛋白。
36.在一些实施方式中，小鼠卵母细胞进一步包含人flt3l转基因。
附图说明
37.图1显示来自nsg
tm
‑
转基因小鼠的血清中的人flt3l水平，所述nsg
tm
‑
转基因小鼠表达人flt3l(nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)，其对于来自首建鼠(founder)品系7和8的人flt3l是半合子(标记为het)或纯合子(标记为hom)。每个柱状图代表5至15周龄的3
‑
4只雌性或雄性小鼠的值。
38.图2显示纯合nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人造血干细胞(hsc)移植水平降低，其以血液中人cd45
+
细胞的百分比表示。每个数据点代表在移植后6
‑
15周测试的单个小鼠中人cd45
+
细胞的百分比。雄性和雌性小鼠均被使用。
39.图3显示nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠骨髓中不存在小鼠cd135
+
骨髓多能(mmp3)祖细胞。每个柱状图代表十(10)周龄时三(3)只雌性小鼠的值。
40.图4a显示nsg
tm
flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)和nsg
tm
对照小鼠中小鼠flt3l的水平。图4b显示nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)和nsg
tm
对照小鼠中人flt3l的水平。
41.图5a显示移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中的人cd45
+
t细胞的发育和nsg
tm
对照小鼠中的cd45
+
t细胞的发育。在8
‑
12周龄时注射八(8)只nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠和十(10)只nsg
tm
对照小鼠。雄性和雌性小鼠均被使用。图5b显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd3
+
t细胞的发育的百分比增加。图5c显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd20
+
b细胞的发育的百分比降低。这可能是由于hsc分化为先天免疫系统细胞(例如，树突状细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞)而不是适应性免疫系统细胞(例如，t细胞和b细胞)的百分比增加。图5d显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd33
+
骨髓细胞的发育的百分比增加。
42.图6a显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞(dc)的发育增加。在8
‑
12周龄时注射八(8)只nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠和十(10)只nsg
tm
对照小鼠。雄性和雌性小鼠均被使用。图6b显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞(nk)的发育增加。图6c显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞/巨噬细胞的发育增加。图6d显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c/hla
‑
dr
+
髓样dc细胞的发育增加。
43.图7显示来自nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠和nsg
tm
对照小鼠的小肠，显示了hsc的粘膜移植。在8
‑
12周龄时注射八(8)只nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠和十(10)只nsg
tm
对照小鼠。雄性和雌性小鼠均被使用。
44.图8a显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中可比较的人cd45
+
细胞的发育。图8b显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd33
+
骨髓细胞的发育增加。图8c显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd3
+
t细胞的发育增加。图8d显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞的发育增加。图8e显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞发育增加。图8f显示与nsg
tm
对照小鼠相比，在移植了人hsc的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤(nk)细胞的发育增加。
具体实施方式
45.nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠
46.本公开提供了包含编码人flt3l的核酸和失活的小鼠flt3等位基因的nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nsg
tm
)小鼠。所述小鼠在本文中称为nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠。
47.nsg
tm
小鼠是一种免疫缺陷小鼠，缺乏成熟的t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞，多种细胞因子信号通路存在缺陷，并且先天免疫存在许多缺陷(参见，例如，shultz ld et al.nat.rev.immunol.2007；7(2):118
–
130；shultz ld et al.2005；j.immunol.174(10):
6477
–
89；and shultz ld et al.j.immunol.1995；154(1):180
–
91)。nsg
tm
小鼠源自非肥胖糖尿病(nod)小鼠品系nod/shiltj(参见，例如，makino s et al.jikken dobutsu 1980；29(1):1
–
13)，包括prkdc
scid
突变(也称为“严重联合免疫缺陷”突变或“scid”突变)和il2rg
tm1wjl
靶向突变。prkdc
scid
突变是人prkdc基因小鼠同源物的功能缺失突变—这种突变基本上消除了适应性免疫(参见，例如，greiner dl et al.1998；stem cells 16(3):166
–
177；and blunt t et al.1995；cell 80(5):813
–
23)。il2rg
tm1wjl
突变是编码白细胞介素2受体gamma链(il2rγ，与人il2rg同源)的基因的无效突变，可阻断nk细胞分化，从而消除阻止原代人细胞有效移植的障碍(shultz ld et al.2005；greiner et al.1998；and cao x.et al.immunity 1995；2(3):223
–
38)。如本领域已知的，功能缺失突变导致基因产物具有很少的功能或没有功能。相比之下，无效突变会导致基因产物没有功能。失活的等位基因可以是功能缺失的等位基因或无效的等位基因。
48.本文提供的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠包含编码人flt3l的核酸。flt3l(例如，nc_000019.10；染色体：grch38:19:49473607:49486831:1)是一种细胞因子和生长因子，通过结合和激活flt3受体来刺激免疫细胞(例如b细胞和t细胞)的产生(例如：参见klein o.et al.eur j immunol.2013；43(2):533
‑
539)。flt3l对于稳态树突细胞的发育很重要。在一些实施方式中，编码人flt3l的核酸包含人flt3l转基因。令人惊讶的是，本文描述的数据显示人flt3l能够结合小鼠flt3，不受理论约束，可以激活先天小鼠免疫。因此，在一些实施方式中，本文提供的nsg
tm
小鼠包含编码人flt3l的核酸(例如，dna)和失活的小鼠flt3等位基因。
49.核酸可以是dna、rna或dna和rna的嵌合体。在一些实施方式中，编码人flt3l的核酸(例如，dna)包含编码flt3l的基因。基因是编码具有功能的分子(例如蛋白质)的核苷酸序列(dna或rna)。基因可以是内源性的(天然存在于宿主生物体中)或外源性的(自然地或通过基因工程转移到宿主生物体中)。等位基因是基因的两种或多种替代形式之一，由突变产生并位于染色体上的相同基因座(locus)上。在一些实施方式中，基因包括启动子序列、编码区(例如外显子)、非编码区(例如内含子)和调控区(也称为调控序列)。如本领域已知的，启动子序列是基因转录开始处的dna序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游(在5'端)。外显子是编码氨基酸的基因区域。内含子(和其他非编码dna)是不编码氨基酸的基因区域。
50.包含人基因的小鼠被认为包含人转基因。转基因是宿主生物的外源基因。也就是说，转基因是已经自然地或通过基因工程转移到宿主生物体的基因。转基因不会天然存在于宿主生物体(包含转基因的生物体，例如小鼠)中。在一些实施方式中，本文提供的小鼠包含flt3l转基因，如人flt3l转基因。在一些实施方式中，人flt3l转基因被整合到小鼠基因组中。在一些实施方式中，人flt3l转基因包含seq id no:7的核酸序列。
51.失活的等位基因是不产生可检测水平的功能性基因产物(例如，功能性蛋白)的等位基因。在一些实施方式中，失活的等位基因不被转录。在一些实施方式中，失活的等位基因不编码功能性蛋白质。因此，包含失活的小鼠flt3等位基因的小鼠不会产生可检测水平的功能性flt3。在一些实施方式中，包含失活的小鼠flt3等位基因的小鼠不产生任何功能性flt3。
52.在一些实施方式中，小鼠(例如，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠)包含使小鼠
flt3等位基因失活的基因组修饰。就核酸而言，修饰是对相对于相应的野生型核酸(例如，天然存在的核酸)的核酸的任何操作。因此，基因组修饰是对相对于基因组中相应的野生型核酸(例如，天然存在的核酸)的基因组中的核酸进行的任何操作。核酸(例如，基因组)修饰的非限制性例子包括缺失、插入、“indels”(缺失和插入)和置换(例如，点突变)。在一些实施方式中，基因中的缺失、插入、indel或其他修饰导致移码突变，使得基因不再编码功能性产物(例如蛋白质)。修饰还包括化学修饰，例如至少一种核碱基的化学修饰。核酸修饰的方法，例如导致基因失活的那些，是已知的并且包括但不限于rna干扰、化学修饰和基因编辑(例如，使用重组酶或其他可编程核酸酶系统，例如crispr/cas、talen和/或zfn)。在一些实施方式中，crispr/cas基因编辑用于失活小鼠flt3等位基因，如本文别处所述。
53.在一些实施方式中，基因组修饰(例如，缺失或indel)在小鼠flt3等位基因的选自编码区、非编码区和调控区的至少一个区域中。在一些实施方式中，基因组修饰(例如，缺失或indel)是小鼠flt3等位基因的编码区。例如，基因组修饰(例如，缺失或indel)可以在外显子6、外显子7、外显子8中，或者它可以跨越小鼠flt3等位基因的外显子6
‑
8。在一些实施方式中，基因组修饰是基因组缺失。例如，小鼠flt3等位基因可能包含外显子6、外显子7和外显子8中核苷酸序列的基因组缺失。在一些实施方式中，seq id no:5的核苷酸序列已从失活的小鼠flt3等位基因中缺失。在一些实施方式中，失活的小鼠flt3等位基因包含seq id no:6的核苷酸序列。
54.在一些实施方式中，本文提供的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠表达人flt3l。在一些实施方式中，人flt3l以至少5,000pg/ml或至少10,000pg/ml的水平表达。例如，人flt3l可以以至少5,000pg/ml、7,500pg/ml、10,000pg/ml、12,500pg/ml、15,000pg/ml、17,500pg/ml、20,000pg/ml、22,500pg/ml、25,000pg/ml、27,500pg/ml、30,000pg/ml、32,500pg/ml、35,000pg/ml、37,500pg/ml、40,000pg/ml、42,500pg/ml、45,000pg/ml、47,500pg/ml或者50,000pg/ml的水平表达。在一些实施方式中，人flt3l以10,000pg/ml至30,000pg/ml的水平表达。在一些实施方式中，人flt3l以15,000
+
/
‑
1000pg/ml至17,000
+
/
‑
100pg/ml的水平表达。检测flt3l蛋白表达的方法是已知的并且可以如本文提供的那样使用。例如，流式细胞术和/或使用抗flt3l抗体的elisa(酶联免疫吸附试验)可用于检测小鼠组织和/或血液中存在的人fltl3蛋白的水平。
55.在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠也可以表达小鼠fltl3。在一些实施方式中，小鼠flt3l以至少1,000pg/ml或至少2,000pg/ml的水平表达。例如，小鼠flt3l可以以3,000pg/ml、4,000pg/ml、5,000pg/ml、6,000pg/ml、7,000pg/ml、8,000pg/ml、9,000pg/ml或10,000pg/ml的水平表达。在一些实施方式中，小鼠flt3l以5,000pg/ml至10,000pg/ml的水平表达。在一些实施方式中，小鼠flt3l以6,000pg/ml至8,000ml的水平表达。
56.在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠不表达可检测水平的小鼠flt3。可检测水平的小鼠flt3是使用标准蛋白质检测测定法(例如流式细胞术和/或elisa)检测到的任何水平的flt3蛋白质。在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠表达不可检测水平或低水平的小鼠flt3。例如，小鼠可表达低于1,000pg/ml的小鼠flt3。在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠表达小于500pg/ml的小鼠flt3或小于100pg/ml的小鼠flt3。小鼠flt3受体也称为抗原分化簇cd135。因此，在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠不包含(不存在)cd135
+
多能祖(mpp3)细胞。
57.人先天免疫系统模型
58.在一些实施方式中，本公开的nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠用于支持人cd34
+
hsc的移植和人先天免疫系统的发育。人体免疫系统包括先天免疫系统和适应性免疫系统。先天免疫系统负责将免疫细胞募集到感染部位，激活补体级联，通过白细胞识别和清除体内外来物质，激活适应性免疫系统，并作为传染源的物理和化学屏障。
59.在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠被亚致死辐照(例如，100
–
300cgy)以杀死固有的(resident)小鼠hsc，然后用人cd34
+
hsc(例如，50,000到200,000个hsc)移植被辐照的小鼠以启动人先天免疫系统的发育。因此，在一些实施方式中，小鼠进一步包含人cd34
+
hsc。人cd34
+
hsc可以来自任何来源，包括但不限于人脐带血、动员的外周血和骨髓。在一些实施方式中，人cd34
+
hsc来自人脐带血。
60.人cd34
+
hsc分化为不同的免疫细胞(例如t细胞、b细胞、树突细胞)是一个复杂的过程，其中连续的发育步骤受多种细胞因子的调控。这个过程可以通过细胞表面抗原进行监测，例如抗原分化簇(cd)。例如，cd45在hsc、巨噬细胞、单核细胞、t细胞、b细胞、自然杀伤细胞和树突细胞的表面表达，因此可用作指示移植的标志物。在t细胞上，cd45调节t细胞受体信号、细胞生长和细胞分化。在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠包含人cd45
+
细胞。预料不到的是，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠在小肠中表现出人cd45
+
细胞的粘膜移植。在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠还表现出人cd45
+
细胞向肺、胸腺、脾和/或淋巴结中的组织的移植。
61.随着cd45
+
细胞成熟，它们开始表达另外的生物标志物，指示不同的发育阶段和分化的细胞类型。例如，发育中的t细胞也表达cd3、cd4和cd8。作为另一个例子，发育中的骨髓细胞表达cd33
+
。本公开的nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠有利地不仅包含人cd45
+
细胞而且包含双阳性人cd45
+
/cd3
+
t细胞以及双阳性人cd45
+
/cd33
+
骨髓细胞。
62.因此，在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中的人cd45
+
细胞群包含人cd45
+
/cd3
+
t细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，人cd45
+
细胞群包含增加的百分比的人cd45
+
/cd3
+
t细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd3
+
t细胞的百分比增加至少25％。例如，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd3
+
t细胞的百分比可以增加至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd3
+
t细胞的百分比增加至少50％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd3
+
t细胞的百分比增加至少100％。在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd3
+
t细胞的百分比相对于nsg
tm
对照小鼠增加25％
‑
100％、25％
‑
75％、25％
‑
50％、50％
‑
100％、50％
‑
75％或75％
‑
100％。
63.在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中的人cd45
+
细胞群包含人cd45
+
/cd33
+
t细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，人cd45
+
细胞群包含增加的百分比的人cd45
+
/cd33
+
t细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd33
+
t细胞的百分比增加至少25％。例如，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd33
+
t细胞的百分比可以增加至少30％、至
少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd33
+
t细胞的百分比增加至少50％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd33
+
t细胞的百分比增加至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
/cd33
+
t细胞的百分比增加25％
‑
100％、25％
‑
75％、25％
‑
50％、50％
‑
100％、50％
‑
75％或75％
‑
100％。
64.令人惊讶的是，本文提供的nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠还能够支持树突细胞(例如浆细胞样树突细胞和髓样树突细胞)、自然杀伤细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞(单核巨噬细胞)的移植。浆细胞样树突细胞(pdc)分泌高水平的干扰素alpha；髓样树突细胞(mdc)分泌白介素12、白介素6、肿瘤坏死因子和趋化因子；自然杀伤细胞破坏受损的宿主细胞，如肿瘤细胞和病毒感染细胞；以及巨噬细胞消耗大量细菌或其他细胞或微生物。
65.在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠包含增加的百分比的人cd123
+
浆细胞样树突细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞的百分比增加至少25％。例如，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞的百分比可以增加至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞的百分比增加至少50％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞的百分比增加至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd123
+
浆细胞样树突细胞的百分比增加25％
‑
100％、25％
‑
75％、25％
‑
50％、50％
‑
100％、50％
‑
75％或75％
‑
100％。
66.在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠包含增加的百分比的人cd56
+
自然杀伤细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞的百分比增加至少25％。例如，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞的百分比可增加至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞的百分比增加至少50％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞的百分比增加至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd56
+
自然杀伤细胞的百分比增加25％
‑
100％、25％
‑
75％、25％
‑
50％、50％
‑
100％、50％
‑
75％或75％
‑
100％。
67.在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠包含增加的百分比的人cd14
+
单核细胞巨噬细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞巨噬细胞的百分比增加至少25％。例如，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞巨噬细胞的
百分比可增加至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞巨噬细胞的百分比增加至少50％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞巨噬细胞的百分比增加至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd14
+
单核细胞巨噬细胞的百分比增加25％
‑
100％、25％
‑
75％、25％
‑
50％、50％
‑
100％、50％
‑
75％或75％
‑
100％。
68.在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠包含增加的百分比的人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞的百分比增加至少25％。例如，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞的百分比可增加至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞的百分比增加至少50％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞的百分比增加至少100％。在一些实施方式中，相对于nsg
tm
对照小鼠，nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd11c
+
hla
‑
dr
+
髓样树突细胞的百分比增加25％
‑
100％、25％
‑
75％、25％
‑
50％、50％
‑
100％、50％
‑
75％或75％
‑
100％。
69.生产转基因动物的方法
70.在一些方面，本文提供了产生表达人flt3l的转基因动物的方法。转基因动物在本文中是指具有插入(整合到)其基因组中的外来(外源)核酸(例如转基因)的动物。在一些实施方式中，转基因动物是转基因啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方式中，转基因动物是小鼠。例如，产生转基因小鼠的方法是众所周知的。用于产生转基因动物的三种常规方法包括dna显微注射(gordon and ruddle,science 1981:214:1244
‑
124，以引用方式并入本文)、胚胎干细胞介导的基因转移(gordon and ruddle,science 1981:214:1244
‑
124，以引用方式并入本文)和逆转录病毒介导的基因转移(jaenisch,proc.natl.acad.sci.1976；73:1260
‑
1264，以引用方式并入本文)，其中任何一种都可以如本文提供的那样使用。
71.在一些实施方式中，编码人flt3l的核酸包含人flt3l转基因，其包含与编码人flt3l的核苷酸序列可操作地连接的启动子(例如，组成型活性启动子)。在一些实施方式中，用于产生转基因动物的编码人flt3l的核酸存在于载体(如质粒、细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yac))，其被递送至例如受精胚胎的前核/核，其中该核酸随机整合到动物基因组中。在一些实施方式中，将核酸(例如，携带在bac上)递送至nsg
tm
小鼠的受精胚胎以产生nsg
tm tg(hu
‑
flt3l)小鼠。注射受精胚胎后，将受精胚胎转移到假孕雌性，随后产下包含编码人fltl3的核酸的后代。例如，可以使用任何数量的基因分型(genotyping)方法(例如测序和/或基因组pcr)来确认编码人fltl3的核酸的存在或不存在。
72.本文还提供了失活内源性flt3等位基因的方法。在一些实施方式中，内源性flt3等位基因在转基因动物中失活。在一些实施方式中，转基因动物是nsg
tm tg(hu
‑
flt3l)小
鼠。因此，在一些实施方式中，该方法包括失活nsg
tm tg(hu
‑
flt3l)小鼠中的小鼠flt3等位基因以产生nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠。基因(等位基因)失活的方法是已知的，其中任何一种都可以如本文所提供的那样使用。在一些实施方式中，基因/基因组编辑方法被使用。可以如本文提供的那样使用的基于工程核酸酶的基因编辑系统包括，例如，成簇的规则间隔短回文重复(crispr)系统、锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应核酸酶(talen)。参见，例如，carroll d genetics.2011；188(4):773
–
782；joung jk et al.nat rev mol cell biol.2013；14(1):49
–
55；以及gaj t et al.trends biotechnol.2013jul；31(7):397
–
405，每一个都通过引用并入本文。
73.在一些实施方式中，crispr系统用于失活内源性flt3等位基因，例如以产生nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠。参见，例如，harms dw et al.,curr protoc hum genet.2014；83:15.7.1
–
15.7.27；以及inui m et al.,sci rep.2014；4:5396，各自通过引用并入本文。例如，可以将cas9 mrna或蛋白质以及一种或多种指导rna(grna)直接注射到小鼠胚胎中，以对flt3基因进行精确的基因组编辑。对这些胚胎发育的小鼠进行基因分型或测序以确定它们是否携带所需的突变，而那些携带突变的小鼠则进行繁殖以确认种系传递(germline transmission)。
74.crispr/cas系统是原核生物中天然存在的防御机制，已被重新用作rna引导的dna靶向平台的基因编辑。工程化的crispr系统包含两个主要成分：指导rna(grna)和crispr相关核酸内切酶(例如cas蛋白)。grna是一种短的合成的rna，由用于核酸酶结合的支架序列和用户定义的核苷酸间隔(例如，～15
‑
25个核苷酸或～20个核苷酸)组成，用于定义要修饰的基因组靶标。因此，可以通过简单地改变grna中存在的目标序列来改变cas蛋白的基因组靶标。在一些实施方式中，crispr相关核酸内切酶选自cas9、cpf1、c2c1和c2c3。在一些实施方式中，cas核酸酶是cas9。
75.指导rna至少包含与靶核酸序列(例如，flt3等位基因的区域，例如启动子序列、编码序列或非编码序列)杂交(结合)的间隔序列，以及结合核酸内切酶并将核酸内切酶引导至靶核酸序列的crispr重复序列。如本领域普通技术人员所理解的，每个grna被设计为包括与其基因组靶序列(例如，flt3等位基因的区域)互补的间隔区序列。参见，例如，jinek et al.,science,2012；337:816
‑
821以及deltcheva et al.nature,2100；471:602
‑
607，各自通过引用并入本文。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的grna结合小鼠flt3等位基因的外显子6。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的grna结合小鼠flt3等位基因的外显子7。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的grna结合小鼠flt3等位基因的外显子8。在一些实施方式中，多个grna用于靶向flt3等位基因的多个区域。在一些实施方式中，使用两种grna，一种结合flt3等位基因的外显子6和一种结合flt3等位基因的外显子8。在一些实施方式中，本公开的grna包含seq id no:1的核苷酸序列。在一些实施方式中，本公开的grna包含seq id no:2的核苷酸序列。
76.使用方法
77.本文提供的小鼠模型可用于任何数量的应用。例如，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠可用于测试特定试剂(例如治疗剂)或医疗程序(例如组织移植)如何影响人先天免疫系统(例如，人先天免疫细胞反应)。
78.在一些实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠用于评估试剂对人先天免
疫系统发育的影响。因此，本文提供的方法包括向nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠施用试剂，并评估试剂对小鼠人先天免疫系统发育的影响。可以通过，例如，测量人先天免疫细胞(例如，t细胞和/或树突细胞)反应(例如，细胞死亡、细胞信号传导、细胞增殖等)来评估试剂的作用。试剂的非限制性例子包括治疗剂，例如抗癌剂和抗炎剂，以及预防剂，例如免疫原性组合物(例如疫苗)。
79.在其他实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠用于评估对人肿瘤的免疫治疗反应。因此，本文提供的方法包括向患有人肿瘤的nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠施用试剂，并评估试剂对人先天免疫系统和/或对小鼠肿瘤的影响。可以通过测量人先天免疫细胞(例如，t细胞和/或树突细胞)反应和/或肿瘤细胞反应(例如，细胞死亡、细胞信号传导、细胞增殖等)来评估试剂的作用。在一些实施方式中，试剂是抗癌剂。
80.在其他实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠用于评估人对传染性微生物的先天免疫应答。因此，本文提供的方法包括将nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠暴露于传染性微生物(例如，细菌和/或病毒)，并评估传染性微生物对人先天免疫应答的影响。可通过测量人先天免疫细胞(例如，t细胞和/或树突细胞)反应(例如，细胞死亡、细胞信号传导、细胞增殖等)来评估传染性微生物的影响。这些方法还可以包括向小鼠施用药物或抗微生物剂(例如，抗细菌剂或抗病毒剂)，并评估药物或抗微生物剂对传染性微生物的作用。
81.在更进一步的实施方式中，nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠用于评估人对组织移植的免疫应答。因此，本文提供的方法包括将组织(例如，同种异体组织)移植到nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠，并评估移植的组织对人先天免疫应答的影响。可以通过测量人先天免疫细胞(例如，t细胞和/或树突细胞)对移植组织的反应(例如，细胞死亡、细胞信号传导、细胞增殖等)来评估移植组织的效果。
82.实施例
83.实施例1：nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠的产生
84.为了支持人dc发育和先天免疫功能，生产了一组表达人flt3配体(flt3l)的转基因nsg
tm
小鼠品系。为了产生这些转基因小鼠品系，将来自chori bacpak的细菌人工染色体(bac)克隆rp11
‑
360g9的13.8kb bamhi限制性片段亚克隆(subclone)到pbluescript中，以消除bac中的其他基因。然后将纯化的、线性化的dna注射到nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nsg
tm
)受精卵的前核中。
85.通过pcr鉴定了11只首建鼠(founder)。在这些首建鼠中，当通过酶联免疫吸附试验(elisa)进行测试时，4只首建鼠品系(第3、7、8和10品系)具有可检测水平的循环的人flt3l。这些首建鼠与nsg非转基因小鼠交配。通过elisa测试该杂交的转基因后代的循环的人flt3l水平。人flt3l转基因是半合子或纯合子的转基因nsg小鼠(第7品系和第8品系)的flt3l水平范围为400至600pg/ml(图1)。
86.实施例2：nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠表现出人hsc发育受损
87.然后用人脐带血cd34
+
hsc去移植表达人flt3l(nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l))的转基因nsg
tm
小鼠。对nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠和nsg
tm
非转基因对照小鼠进行亚致死辐照(200cgy)并静脉注射100,000人脐带血hsc。在移植后6、9、12和15周对移植小鼠的外周血进行流式细胞术。预料不到的是，在所有测试时间点，nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人cd45
+
细胞的百分比显著低于nsg
tm
对照(图2)。
88.实施例3：nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠的产生
89.为了测试nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠中人hsc移植的减少是否是人flt3l激活宿主小鼠dc和可能的其他先天免疫小鼠成分的结果，编码小鼠flt3受体(flt3)的基因被敲除(以防止人flt3l与小鼠flt3受体结合并激活小鼠先天免疫)。不受理论束缚，没有小鼠flt3受体，人flt3l和小鼠flt3l均可用于结合人flt3受体。
90.编码flt3受体的小鼠flt3基因在表达人flt3配体的nsg
tm
‑
tg(hu
‑
flt3l)纯合品系中被直接敲除。为了敲除小鼠flt3基因，设计了两个单指导rna(sgrna，见下表1)以靶向外显子6和8，这应该消除了免疫球蛋白样结构域(即使转录本被保留并产生了亚型)。sgrna是使用breaking cas(6)和zifit(7)软件设计的，以最大限度地减少脱靶切割的可能性，并且还针对人序列进行了检查，以确保不会靶向人flt3l转基因。两种sgrna都被设计为tru
‑
guides(“截断的”)，每个都只有19个碱基识别位点，以进一步降低脱靶切割的可能性(8)。sgrna的制备如前所述(9)。
91.使用位于感兴趣区域(例如外显子6
‑
8)两侧的pcr引物(见下表1)对敲除flt3的小鼠进行筛选。pcr引物产生1942碱基对(bp)的野生型扩增子，突变体丢失(“do”)等位基因的预测大小为670bp。pcr后，使用相同的引物通过sanger测序筛选样品。携带敲除的等位基因的三个首建鼠通过pcr鉴定并随后进行测序。三个敲除品系(第1、2和4品系)通过与来自具有最大缺失的首建鼠n2小鼠交叉杂交(intercross)。通过pcr对基因敲除鼠进行分型，并最终扩增、验证并表征了单个基因敲除品系(npd.cg
‑
flt3
em1mvw
prkdc
scid
il2rg
tm1wjl
tg(hu
‑
flt3l)7sz，缩写为nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠)。
92.修饰的flt3
null
等位基因在外显子6之前开始丢失1500bp，并在外显子8结束之前终止。缺失的基因序列显示为seq id no:5(nsg
tm flt3
null
‑
tg(hu
‑
flt3l)小鼠的小鼠flt3受体基因中缺失1500个碱基对)。修饰的flt3
null
等位基因的pcr产物为442bp。该pcr产物序列如seq id no:6所示(由被靶向的小鼠flt3基因缺失产生的pcr产物)。小鼠flt3受体称为抗原分化簇cd135。通过对骨髓树突细胞进行流式细胞术并通过cd135
+
多能祖细胞(mpp3)的缺乏，来验证nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠的小鼠flt3的缺乏(图3)。
93.表1：用于产生和筛选flt3敲除小鼠的序列
94.序列名称seq id no:5
’‑
gaacagcuuggugcauucgsgrna
‑
外显子615
’‑
gauggucaccaacgcugacsgrna
‑
外显子825
’‑
ccaacctgaactgtatggagatagpcr
‑
正向35
’‑
ccacagggaaagccactaaapcr
‑
反向4
95.实施例4：nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)小鼠支持树突细胞的发育
96.表达人flt3l转基因但缺乏小鼠flt3受体的nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠的血清的elisa测定显示人flt3l的水平范围从15,175
+
/
‑
1,137pg/ml至17,120
+
/
‑
92.7pg/ml。来自nsg
tm
非转基因对照小鼠的血清显示没有可检测的flt3l水平(图4a
‑
4b)。nsg
tm flt3
null
tg(hu
‑
flt3l)中小鼠flt3l的水平范围为6,000至8,000pg/ml，而nsg
tm
对照中小鼠flt3l的水平为～1,000pg/ml。
97.为了确定nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠支持人cd34
+
hsc移植和人免疫系统发育的能力，对8
‑
12周龄的nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠(n＝8)和nsg
tm
对照小鼠(n＝10)
进行亚致死辐照(200cgy)，并静脉注射(iv)100,000人脐带血cd34
+
hsc。移植后6、9、12、15和18周对移植小鼠外周血的流式细胞术分析表明，nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)和nsg
tm
对照小鼠的人cd45
+
白细胞百分比相似。然而，在人cd45
+
细胞群中，nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠具有显著增加的人cd3
+
t细胞和人cd33
+
骨髓细胞的百分比(图5a
‑
5d和图8a
‑
8c)。
98.nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠还显示出人cd123
+
浆细胞样树突细胞、cd56
+
人自然杀伤(nk)细胞、cd14
+
人单核细胞巨噬细胞和cd11c
+
hla
‑
dr
+
人髓样树突细胞的百分比增加(图6a
‑
6d、8d
‑
8f)。此外，对移植小鼠组织的组织化学分析预料不到地显示，nsg
tm flt3
null tg(hu
‑
flt3l)小鼠的小肠中存在人cd45
+
细胞的粘膜移植。
99.序列
100.atcccccagtgctggtgaccttgaacacagggtctgccctgagcagtgctgacagcctgttagctgtcattttgaagcatttcctgaaggaaacttaccttatcattgcagctgtaaagaagaaggccctgctgttgtcagaaaggaggaaaaggtacttcatgagttgttcggaacagacatcagatgctgtgctagaaatgcactgggccgcgaatgcaccaagctgttcaccataggtaatgggggactgtcggctatgtgtccttagtgacggttcctaagggaccggtgatagcttctgtgtgggtaatcattccacttcagaaagatgatggaaagttatactgaaatccgaatctagatcgaatagtccacattctgacataaaagcaattgaacacacaggtatggccaagcttggtggcccgggcttttaatccttctttcataggactttgatttgattcaatttgatttgatttgatttgacttaggtgctgggctcaaacccagggactcagagcatctgctttgccactgagttccactccagatcttttgcaccactttatttatttatttattgtgtgtgtgtatacacacattaaatacacacacatacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacgctacagcatgtaatgtggatgtcaggttctcttcttgtcatatggggcccctggatcaaattcaggtcagtctggcagcggcaggcacctccacccactgagccatcttgatgccccgttcataccatttacaatgtaacactgtagattctgtaagggaggatttctgcaacaaagggtattccatctcgagtgggtggttttactctgtcgcttttttttttttagttttgtgctgctctgtgactccaggtcttctccaggccagcctcttttaccctgatcttctcagctctgcattgtttggcttgattagtgatggcagggatgctgacaccattgcttttcaaaacgtttgcgacacttctgagctgaggcaaaagtttttaaaaaaaagatgtgcttttttttttttttttttgtcttctttgggatatttttatcttctagatctaaaccaggctcctcagagcacactgccccagttattcctgaaagtgggggaacccttgtggatcaggtgtaaggccatccatgtgaaccatggattcgggctcacctgggagctggaagacaaagccctggaggaggtaacagcgcccacccgtggtgtttaccgtaagctctcagcgtgggctggaaacccggaatacagactcccctttcattaatactcagggcagctactttgagatgagtacctactccacaaacaggaccatgattcggattctcttggcctttgtgtcttccgtgggaaggaacgacaccggatattacacctgctcttcctcaaagcaccccagccagtcagcgttggtgacca(seq id no:5)
101.ccaacctgaactgtatggagatagcttgtctatggggaaaaaaaatcaccaaataaaataaaatctaaaatattaaataataaagtaatactgtaacattatcctaattagatacagagtagctagctggtccctgcagattccaggctggatacagttgagttaatttttcatctgctcttttcttccatccctaaaaatatactttgtaacttcatcccctaaacatactgggtccccccaccccatcctaggtaacgggctcacgaaatttggggttggttggtttgtttgtttttaatgctgtcctggaactcgctgtgtagattggttggccttgaactcacagaaatctaccagcatctgcctccccagtgctgggattaaaggcacaggccaccaagcttgactctgcttgtgtctttagtggctttccctgtgg(seq id no:6)
102.gatccctgtgctcctccgagtggcacaggaaacttggctgatagaggcgctctctccatgcatcctccaccatccactccccggtcccttagacttccattcagaagtgacacctgtcacctccaccctcatgtgactggccaa
agtgagtgtggccatgtccgagttccccaggatgggacctcgaatcctcctgctgggggggtgggggcagcagatgtttcaggacagtctgccacggatcagatgggtgagcaagagattcaggatgggcgtgatgggtcacacctgtaatcccagcattttgggaggccgaggcaggctgatcacctgaggtcaggagttcgagatcagcctggccaacatagtgaaacctcgtctctactaaaaatacaaaaattagccgggcatggtggcacgcacctgcaattccagctacttgggagcctgaggcacaagaattgcttaagcccaggaggcggaggttgccgtgagccgagactgtgccactgcactccagcctgggcaacagagtgagaccccatctaaaaaaaaaaaatgcttcagagattcagagatccacagatgtggaagagagcttctattttgtctcatgtaccacctcacccctcagtttggagttggagaagccgaggcttagagaggtcaaggggctggccaagctcccacagtgataaagctagtgctagggcgacacctgccaggcccaatgtgacaagatgcatcctgagtcctgtgtgccaagccttggcggggcaaagttggggcccggaggacggtaagacacagcaactgcgagttcccagagacagatccgggttccagccccagctcaccatgcactgggcgtgccacccagggagtcagccccactgcagcccccgctgcggggcgtccggagaacgcgccatctgcggcgtgagcggccgcctctcaccaccagggggcgcgctccgcctgggcccagattccaccccttgactgtctccccccaaaaatttcctttcactttcggtctctggctgtcacccggcttggccccttccacacccaactggggcaagcctggtgcgtgaggagacttggactctaggtccccaaggggcggagccagggtccccactcctggggcagggggagcagagggtggggggctgggttcccgggtccctaacctggggagggttctggggaccagacgtcgaggttcttagaagtggagatgaagagttttcaccgtaactggggcagacgcaggaagcctgggggaggaaggggcggaaactcagccacatcaatgggacgcgggaggggcggggaggcaaaggggcgggcagggcaggggctggggcatgagggtccgagacttgttcttctgtcccttccaagacccggcgacaggaggcatgaggggcccccggccgaaatgacagtgctggcgccagcctggagcccaacagtgcgtaaaccccagggacaagatcaggggagaggggaggcacaatgtcaggatggggcagagatgaggggagatggacgggagaacagatggacagatgacgaggaaataggaggggagatggacagatgtgaggggagatggataggagaggagacggacagaggagggggagatggacagaggatggggagatggacagaggagggggagatagaggagagggagatagagaggagtgggagatggacaggagcggggagatggacagaggagggggagatggacagaggagagggcagatgaacagaggagagggagataaagaggagggaggtggacaggaggagggagatggacagagaagggggagatggacagaggtgggggagatggacaggagggaagatggagaggagggggtatggacagaggagaggggagatggacaggagggggagatggacagaggagagggagatgaagaggagggggaggtggacaggaggagggagacggacagaggagaggaagagagacagaggaggggggagatggacagaggagggggagatggacagaaaaggggggagatggacagaggagagggaaggtggacagagccaagaacaaatgaagaggacgtggaccaagatcaagagagaagcaggcaacagtggtgtagaaggcagagggagggacagagctggaggaacccgggcgaggaaaccagacgtgaagatgaggtggttggagagagaccagcagagtgggggagatggggagagagaggggtggggcagagggggatgcaaactggacagcattggaccagaggcagagagaaaccgggaaagacaggcagagatggggccatgtctccagaaagtgtggaagaggcagaaggacacccagggaaggaggagcggggaagacagaacagtacaggtgggaagcccggaggagggggctgtgtgtggaacagcagagggctcccccagcacccgctcccctgcagacctatctcctcctgctgctgctgctgagctcgggactcagtgggacccaggactgctccttccaacacagccccatctcctccgacttcgctgtcaaaatccgtgagctggtgagcggcgctgccccggaccccctcatgtgatcccccttccccccacttttttttttaagtagagatggggtctctctccctgtgtttcccagggtggtcttgaactcctgggctcaagcgatcctcccaccttggcctcccaaagtgctggaattacaggcgtgagccactgtgcttaggggtgtcatccctttttaagggcaaggttctgtggcttcttctgggctccccctctcttggtcttgtccctctctctctggatctctgctgccacctctgggtccccacagttctgtttctcgctgttttcagccaggcctgatcctgttttctcccgcagtctgactacctgcttcaagattacccagtcaccgtggcctccaacctgcaggacgtaagtcatgttgggagggacctgggatggaggtggggaccacagactcaagatgctccaccgaggcgagtggataaccaggccctcccctccccaaaccca
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113,6361
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cas
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interactive design of guide rnas for crispr
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cas experiments for ensembl genomes.nucleic acids research 44,w267
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guided cas9 nucleases.nature biotechnology 31,827
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cas9
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mediated gene editing in mice:strategies and methods.methods mol biol 1438,19
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53(2016).
113.本文公开的所有参考文献、专利和专利申请的被引用主题(在一些情况下，其可以涵盖整个文件)都通过引用并入。
114.在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个/一种(a/an)”，除非明确指出相反情况，否则应理解为“至少一个/一种”。
115.还应当理解，除非明确指出相反情况，在本文要求保护的任何包括一个以上的步骤或动作的方法，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。
116.在权利要求以及上述说明书中，所有过渡性短语，如“包含/包括(comprising)”、“包含/包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“包含(composed of)”等应被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡性短语“由
……
组成(consisting of)”和“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”应分别是封闭或半封闭的过渡性短语。
117.数值前面的术语“约(about)”和“基本上(substantially)”是指所述数值的
±
10％。
118.在提供值范围的情况下，该范围的上限和下限之间的每个值在本文中被具体考虑和描述。