一种炭角菌科真菌sj18及其在松材线虫防治上的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及炭角菌科真菌sj18在松材线虫防治上的应用。


背景技术：

2.松材线虫病是由松树感染寄生虫——松材线虫引起松树萎蔫死亡的一种国际重大检疫性病害。1982年我国首次在南京市紫金山黑松上发现松材线虫病，死树265株，到2017年，35年时间内松材线虫病先后在18个省的300多个市县发生。在我国松材线虫病是一种典型的病原主导性病害，即病害的发生取决于有没有病原的感染，一旦感病，其结果就是死亡，因此，被称为松树的“癌症”。我国全国松林面积有5亿多亩，三十多年来的观察发现，我国所有乡土松树如马尾松、黑松、赤松、琉球松、华山松、云南松、思茅松、黄山松、华山松、红松等都是易感病树种。事实上，目前松材线虫病已经成了我国的头号森林病虫害。松材线虫病是一种相对比较复杂的病害，它由媒介昆虫-松墨天牛传播，所以这个病害既涉及到病，又涉及到虫，非常复杂。目前，防治媒介昆虫主要有以下几种做法：一是喷洒化学药剂；二是用引诱剂引诱媒介天牛；三是生物防治。在自然界中喷洒化学药剂，要求每隔几天大面积喷洒一次药剂，这个办法经济成本很高。引诱剂防治存在的问题是，无法回答防治后林间还有多少天牛数量，因此显然也不能把它做为松材线虫病防控的主要手段。生物防治措施方面当前主要有两个，一个是真菌—球孢白僵菌：寄生天牛幼虫使其死亡；第二个是天敌昆虫—管氏肿腿蜂、花绒寄甲：可寄生天牛幼虫使其死亡；但这些方法在林间的影响因素很多，防治效果很不稳定，也不确定。在控制松材线虫病方面，生产上用的比较多的是用生物杀线剂阿维菌素、甲维盐等进行树干注射，注药一次能防2-3年。但是这种树干注射剂价格高，注射全程由人工完成，因此仍然成本较高，通常只能应用在重要区域或古树名木上。全国大面积的松树，特别是马尾松，亿万年来随着进化的发展适应于我国的气候环境，是我国的乡土树种，也是造林先锋树种，具有很多的优点，不能把它彻底放弃掉。目前，我们国家也开始做马尾松抗松材线虫病的抗性育种，但这是一条长期的道路，无法在短期内实现。
3.利用真菌侵染使松木获得松材线虫病的抗性，这是一个值得尝试的新方法。事实上，这个方法已经在菌根的研究中有所证实，如中华美牛肝菌、黄豹斑鹅膏和彩色豆马勃等真菌，在接种到马尾松和黑松上后能够延缓或减轻其苗木的死亡。但是，目前尚未发掘出在驱虫和熏蒸方面有足够效力的侵染真菌，多年来这方面的进展不大，也未引起足够的重视。本发明即从这个角度，在筛选出具有驱虫和熏蒸等多重作用的炭团菌属真菌sj18（已授权发明201710795984.0）的基础上，进一步挖掘其作为松材线虫的生物农药功能。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明在原有发明“一种炭角菌科真菌及其应用”（专利号201710795984.0）的基础上，开发出一种利用该菌杀灭松材线虫的技术方案；所述的一种炭角菌科真菌（xylaria radix）sj18，其保藏号为cgmcc no.12780；
所述的炭角菌科真菌及其粗提取物作为松材线虫杀灭剂的应用；本发明的炭角菌科真菌源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对松材线虫有独特的控制作用，可作为无公害新型农药。
5.附图说明
6.图1为sj18菌在显微镜下的形态；图2为不同浓度的甲维盐下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图3为不同浓度的sj18的pdb培养发酵液上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图4为不同浓度的sj18的大麦发酵液上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图5为不同浓度的sj18菌的70℃水抽提物下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图6为不同浓度的sj18菌的70℃水抽提物加甲维盐下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图7为不同浓度的sj18菌的100℃水抽提物下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图8为不同浓度的sj18大麦发酵液70℃恒温30min后的上清液下线虫死亡率随时间变化的曲线图；图9为纯水对照。
7.具体实施方式
8.以下结合实施例来进一步说明本发明。下述的实施例并不对本发明作限定作用。
9.实施例1：炭角菌科真菌的分离从一株野生山核桃林木的根部取材，洗净，切成2cm左右小段，先经70%酒精表面消毒，再用50%安替福民（次氯酸钠溶液）浸泡消毒半小时，最后无菌水浸泡冲洗4-5次；将消毒好的材料在超净台上切开，接种到pda培养基（固体土豆培养基）平板上培养，待有菌长出时，分别划线纯化，并分别提取dna进行分子鉴定，从而获得并确认该菌株。确认该菌株的具体步骤如下：1）从pda平板上挑取待测菌加入至悬浮溶液a中，在菌液中加入经灭菌后的直径3-5mm碳化钨圆珠1颗，置于沸水浴中5min后，在液氮速冻下，用往复式粉碎机研磨，研磨粉碎后，待恢复至常温；2）准备高吸附力的柱子：取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液s，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；3）菌裂解和核酸吸附：加入裂解液l到步骤1）处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，舍弃滤液，收集管重新放回；4）清洗：取步骤3）得到的上清液加入清洗液w，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次离心15s后，吸附柱不再放回收集管；5）洗脱：将吸附柱转移到新离心管中，滴上10-15μl洗脱液e，盖紧盖子，保持60℃、5-10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液；6）its序列的pcr扩增：取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物its4（5
’-
tcctccgcttattgatatgc-3’）和its5（5
’-
ggaaggagaagtcgtaacaagg-3’）进行pcr扩增，pcr反应体积是60μl，10x taq buffer 6μl, 2.5 mm 的dntp mixture 5μl, taq 3u, 10μm的引物各2.5μl，模板体积为6μl，剩余用纯水补足；pcr反应程序为：95
°
c 300s；94℃ 15s，52
°
c 45s，72
°
c 45s，共35-40轮循环；72℃ 300s。其扩增产物约600bp，该产物以常规pcr产物切胶纯化方法纯化后，最后以its4为测序引物，测得其its序列为：ttctagctgagctgaggtcacctctagaatatataggggtttaacggctaccagccagggccaccacacgagcgagagagattactacgctgagagtgtaccctaactccgccactaactttgaggaactacgccgtagattcccaacgctaagcaacaagggcttaagggtcgaaatgacgctcgaataggcatgcccactataatactaatgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcgctgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttaacttatttaggtttacaattcatagaaacagtaataaaaaacaaaagtttggcggtccttcggcggaccataagccggctacagggtagctacagggtaactatagggtagctgcagggtaactacagggtaactatagggtaactacagggtagccgtagctcacgccgaggcaacgacggtaaggttcacaaagggtttggagttttaataactcagtaatgatccctccgctggctcaccaacggagaccttgttcgattttttaacttccaagga经blast比对，与现有的xylaria sp. ys-13菌株相似性为97%，可以认为是同一种菌的不同菌株，定名为sj18；作为优选：上述的溶液a为：100 mm tris-hcl，25 mm edta，2.0 m nac1，rnasea 10μg/ml，ph 8.0；上述的带过滤柱的离心管是由离心柱铺上1-3层孔径1-10μm的亲水微孔滤膜压紧得到；上述的吸附剂悬液s通过以下步骤制得：称取3g硅土至50ml三角瓶中，加20-30ml双蒸水，充分振荡，静置片刻，去上清，清洗3遍，加入双蒸水至2倍硅土体积，总体积约20ml，经高压灭菌后常温存放待用；上述的裂解液l由以下组分混合得到：异硫氰酸胍30g、无菌水40ml、ph5.2的灭菌naac 3ml、灭菌10% sds 2.5ml、灭菌甘油2.5ml，总体积为50ml；上述的清洗液w为浓度70%的酒精溶液；上述的洗脱液e为灭过菌的tris溶液，ph8.5； 该菌株可以接种入pdb培养基（液体土豆培养基）中振荡培养，然后加甘油等冷冻保护剂以菌丝形态在超低温冰箱作永久保存。炭角菌科真菌 （xylaria radix）sj18于 2016 年08 月08 日保存于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号是 ：cgmcc no.12780。
10.实施例2：菌株的形态学和生物学特征炭角菌科真菌 (metarhizium anisopliae) sj18在pda培养基上生长良好，最适温度为32-34℃，在32℃下0.5cm菌块4天可以长到8cm，在ph5-11均能正常生长，且生长速度不受影响。菌丝初生长时为白色，培养1周后菌呈深褐色，不产孢子。图1为sj18菌在显微镜下的形态。
11.实施例3：菌株发酵液杀灭松材线虫的效果
具体实施步骤如下：1．松材线虫收集1）取备用的pda平板，接种入灰葡萄孢菌，25℃培养，长满整个平板后，倒放于4℃保存备用；2）将松木块用纱布包裹，放于密封的塑料袋中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜后，浸泡液2000rpm离心3-5min，去上清，留1-5ml，即为虫液；3）取20-50μl虫液以划线的方式加入到步骤1）中长满菌丝的灰葡萄孢平板上，25℃生长至虫子面积达培养皿2/3以上，4度冰箱保存备用；2．线虫筛选1）提前一天把线虫平板从4度冰箱中取出， 22℃培养一晚，用移液器将无菌水加入到该线虫平板清洗，然后收集含虫清洗液；2）收集的虫液经10-20μm的尼龙滤膜过滤，滤液为幼虫，滤膜上粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，这样就得到了所需的虫液，一般采用成虫进行抑制剂的筛选；3）将虫液1000g低速离心5min，去掉部分上清，用千分之一的琼脂糖溶液调节虫液至千分之0.5琼脂糖浓度，这样便于线虫悬浮分散均匀，借助40倍显微镜观察，调节每ml线虫数目至2000-4000条；4）取96孔板，按每孔25μl加虫液，再分别加无菌水25μl，调整总体积为50μl，同时起到降低琼脂糖浓度的作用，便于显微镜观察；3．sj18发酵产物收集和提取1）sj18菌在pda平板上32℃培养3天，用0.5cm打孔器在菌落边缘打孔1-2个；2）取步骤1）的菌块1-2块，接种入200ml pdb培养基或大麦液体培养基，32℃振荡培养5天；作为优选大麦液体培养基为1l水含100g麦芽粉；3）菌丝发酵培养好后，用300目尼龙滤网抽滤，进行固液分离，得到的滤液4℃冷藏备用；菌丝50℃烘干，用粉碎机粉碎，4℃冷藏备用；4）将步骤3）的菌丝粉末进行水提，具体方法如下：水提取物：称取sj18粉末0.2g，加入10ml纯净水，混匀后在设定温度下保温30min，4000g离心，取上清0.22μm过滤灭菌，滤液分装后冰箱冻存备用；5）发酵液：sj18菌分别进行pdb培养基和大麦液体培养基的发酵，发酵液经300目尼龙滤布过滤，滤液经4000g离心，取上清液经0.22μm过滤灭菌，滤液分装后冰箱冻存备用；4．测试板制作1）上述步骤3中得到的发酵液和水提物分别稀释好并分装到96孔板中，每孔分别加25μl试剂和25μl无菌水，每孔的内容物具体见表1；表1：
表1中：a.阳性对照，不同浓度甲维盐（结果见图2所示）；b. sj18在pdb培养基里的发酵液上清液经0.22μm过滤（结果见图3所示）；c. sj18在大麦培养基里的发酵液上清液经0.22μm过滤（结果见图4所示）；d. sj18菌丝70℃水抽提物（结果见图5所示）；e. sj18菌丝70℃水抽提物加甲维盐（结果见图6所示）；f. sj18菌丝100℃水抽提物（结果见图7所示）；g. sj18的大麦发酵液70℃恒温30min，离心取上清液（结果见图8所示）；h.阴性对照，纯水（结果见图9所示）；2）在上述步骤1）的基础上，每孔加入步骤2的分步骤4）中获得的虫液50μl，混匀，每孔总体积100μl。每组各4个重复；3）将线虫培养在上述有药剂的96孔板中，控制环境温度25℃；5．数据处理1）用倒置显微镜在40倍放大下依次拍摄96孔板中的各孔，每隔2h拍摄一次所有孔的照片，追踪24h以上线虫的死活变化；2）利用软件和人工相结合的方法标识照片中线虫的状态，将线虫分为s形、g形、c形和j形。根据线虫死活的观察，s形、g形相加是活的线虫数，c形和j形相加是死的线虫数；3）将标识的状态进行电脑自动统计汇总，绘制每组线虫处理与时间的关系图，根据图形确定药物的抑制线虫效果；研究结果表明，与对照（图8）相比，sj18发酵液不论是pdb发酵（图2）还是大麦发酵（图3），其发酵液在稀释至8倍浓度下，均能在8h内彻底杀死松材线虫；更低浓度的效果就不太稳定（图4）；sj18菌丝不论经70℃（图5）、还是100℃（图6）热水抽提后都能在8h左右有效杀死线虫，但100℃下抽提的效果不太稳定，线虫容易复活。另外，甲维盐与sj18菌提取物有一定的协同作用，两者配合可以达到最好的效果，既迅速又持久有效，在0.2g菌丝粉末/10ml水的抽提液作用下，即使在1mg/l的甲维盐浓度下，也能在6h左右彻底杀灭松材线虫。由此证明sj18发酵液及其粗提物有杀灭松材线虫的重要作用。