血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱在农药上的应用

1.本发明涉及血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱在农药上的应用，具体涉及抗植物病毒、杀植物源病菌和杀农业害虫方面的应用，属于农药技术领域。


背景技术：

2.天然源农用生物活性物质是生态农药的良好先导，对其针对性地改造可加快农用药剂研发进程。天然源农药较传统化学合成农药具有明显的优势：天然源农药在环境中一般较易降解；对靶标具有专一性，对非靶标生物相对安全；作用方式独特，害虫难以产生抗药性；比化学合成农药的作用方式更为广泛，某些天然源农药的作用方式是非毒杀性的，方式包括驱避、引诱、拒食、绝育、调节生长发育等。以上优势使得天然源农药越来越受到人们的关注。
3.白叶藤属植物分布于亚洲和非洲热带地区，我国有白叶藤(cryptolepis sinensis(lour.)merr)和古钩藤(cryptolepis buchananii roem.et schult)两种，产于我国南部和西南部。目前世界上对古钩藤、血红白叶藤(cryptolepis sanguinolenta)和cryptolepis triangularis 3种植物的研究最为广泛。白叶藤在西非传统医药中占有重要地位，它的根作为商品出售，叶子被用来治疗疟疾或者磨成粉来治疗皮肤划伤割伤，白叶藤的水提取物用来治疗黄疸及肝炎，根的浸液还用来治疗肠胃功能紊乱。在加纳，干燥白叶藤根的水煎液被用来治疗疟疾、尿道与上呼吸道感染、风湿病和性病等各种原因引起的发热，白叶藤水提取物在刚果传统药物中被用来治疗阿米巴痢疾及用作苦性健胃药。其根在尼日利亚用于治疗绞痛、类风湿及泌尿、生殖系统感染。《新华本草纲要》记载，白叶藤有清热解毒、散瘀止痛的功能，用于肺热咳血、胃溃疡出血等症，外用治跌打刀伤、疮疥和毒虫、蛇咬伤。加纳phyto-riker制药公司开发的白叶藤植物袋装药茶，用来治疗疟疾至少已有20年。
4.在白叶藤植物丰富的吲哚并喹啉生物碱中，最主要的成分为白叶藤碱(cryptolepine)。cryptolepine这个名字最早由clinquart提出，1929年，clinquart从比利时属刚果收集的植物cryptolepis triangularis中分离了一种紫色化合物，他给这种化合物命名为cryptolepine。研究表明白叶碱及其类似物有药物活性，包括显著抗疟活性，抗肿瘤、抗脑膜炎、抗微生物、抗菌、抗炎、治疗高血压、抑制去甲肾上腺素受体和抗血栓等活性。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱在农药上的应用，其应用涉及抗植物病毒、杀植物源病菌、杀农业害虫方面的应用。
6.本发明所述的血红白叶藤乙醇提取物及白叶藤碱提取方法如下：取血红白叶藤(cryptolepis sanguinolenta)干燥的根1.10kg，粉碎后在2.5l的乙醇中浸提7天，然后过滤，收集滤液。滤渣继续如上步方法浸提并重复两次或多次。把所有滤液收集真空浓缩，最终得到黑色膏状物即为血红白叶藤乙醇提取物。取血红白叶藤乙醇乙醇提取物10g，加入10ml稀盐酸(1mol/l)，超声波超声20分钟后用氯仿萃取(40ml)。所得的水相用氨水调节ph
至10，然后用氯仿(30ml
×
3)萃取。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，浓缩得血红白叶藤根生物总碱，以hcl3/meoh/nh3(8∶2∶0.5)为洗脱剂(r
f 0.47)进行柱层析得白叶藤碱。
7.本发明提供的血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱有较好的抗植物病毒活性、杀植物源病菌和杀农业害虫活性。
8.本发明提供的白叶藤碱在500mg/l的浓度下对烟草花叶病毒的抑制率＞40％，好于市售抗病毒剂病毒唑。
9.本发明提供的血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱对番茄早疫、小麦赤霉、水稻稻瘟、辣椒疫霉、油菜菌核、黄瓜灰霉、水稻纹枯、黄瓜枯萎、花生褐斑、苹果轮纹、小麦纹枯、玉米小斑、西瓜炭疽和水稻恶苗植物源病菌都有抑制作用。
10.本发明提供的血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱对蚜虫、小菜蛾、粘虫、玉米螟和棉铃虫有杀虫活性。
具体实施方式
11.下述的实施例和生物测试结果可以用来进一步说明本发明，但不意味着限制本发明。
12.实施例1：抗烟草花叶病毒活性
13.测定程序如下
14.病毒提纯及浓度测定：
15.病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
16.化合物溶液配制：
17.称量后，原药加入二甲基甲酰胺溶解，制得1
×
105mg/l母液，后用含1
‰
吐温80水溶液稀释至所需浓度；病毒唑制剂直接兑水稀释。
18.离体作用：
19.摩擦接种珊西烟适龄叶片，用流水冲洗，病毒浓度10mg/l。收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于1
‰
吐温水及药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次。3d后记录病斑数，计算防效。
20.活体保护作用：
21.选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1
‰
吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10mg/l，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
22.活体治疗作用：
23.选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10mg/l，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1
‰
吐温80水溶液对照。3d后，记录病斑数，计算防效。
24.活体钝化作用
25.选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20mg/l，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1
‰
吐温80水溶液对照。
3d后数病斑数，计算结果。
26.抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]
×
100％
[0027]
血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱的抗烟草花叶病毒活性测试结果如下：
[0028]
表1.血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱抗烟草花叶病毒活性
[0029][0030]
从表1可以看出白叶藤碱在500mg/l浓度下的抗烟草花叶病毒活性好于市售抗病毒剂病毒唑活性。
[0031]
实施例2：杀植物源病菌活性
[0032]
测定程序如下
[0033]
以番茄早疫病菌为例，可以换成其他菌离体测试方法：将番茄早疫病菌接到pda培养基上培养7天，用打孔器在菌落边缘制取直径4cm的菌碟接种到含有50mg/l和不含药剂的pda培养基上培养4天，量取菌落直径，与对照比较计算出药剂的抑制百分率。
[0034]
血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤生物总碱的杀菌活性测试结果如下：
[0035]
表2血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱的杀植物源病菌活性(50mg/l)
[0036][0037]
从表2可以看出血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤生物总碱在50mg/l对番茄早疫、小麦赤霉、水稻稻瘟、辣椒疫霉、油菜菌核、黄瓜灰霉、水稻纹枯、黄瓜枯萎、花生褐斑、苹果轮纹、小麦纹枯、玉米小斑、西瓜炭疽和水稻恶苗都有抑制作用，其中白叶藤碱在50mg/l对油菜菌核、黄瓜灰霉、花生褐斑、苹果轮纹和小麦纹枯的抑制率达大于80％。
[0038]
实施例3：杀农业害虫活性
[0039]
蚜虫的活性测试
[0040]
杀蚜虫活性测定步骤如下：
[0041]
试虫为蚜虫，实验室蚕豆叶饲养的正常群体。称取药品，加1ml二甲基甲酰胺溶解，加两滴吐温-80乳化剂，加入一定量的蒸馏水，搅拌均匀，配成所需浓度的药液。将带蚜虫(约60只)蚕豆叶片浸入药剂中5秒钟，拿出轻轻甩干，用滤纸吸干多余药剂，然后将蚕豆枝插入吸水海绵中，并用玻璃罩罩住枝条，用纱布封口，96小时检查结果，每个化合物重复3次。对照只向蒸馏水中加入乳化剂和溶剂，搅拌均匀。
[0042]
小菜蛾幼虫活性测试
[0043]
采用国际抗性行动委员会提出的浸叶法。在分析天平上称取2mg药样于10ml小烧杯中，加50μl二甲基甲酰胺(分析纯)溶解，加10ml水制成200ppm药液。用直头眼科镊子浸渍
甘蓝叶片，时间2-3秒，甩掉余液。每次1片，每个样品共3片。按样品标记顺序依次放在处理纸上。待药液干后，放入具有标记的10em长的直型管内，接入2龄小菜蛾幼虫，用纱布盖好管口。将实验处理置于标准处理室内，96h后检查结果。每个化合物重复3次。对照只向蒸馏水中加入乳化剂和溶剂，搅拌均匀。
[0044]
粘虫的活性测试
[0045]
粘虫的实验方法：浸叶法。配置所需浓度后，把直径约为5-6cm的叶片浸入药液中5-6秒，取出，放在吸水纸上晾干，放在指定的培养皿中，接入10头3龄幼虫，放入27
±
1℃的养虫室中观察3-4天后检查结果。
[0046]
玉米螟的活性测试
[0047]
玉米螟的实验方法：浸叶法，配置后所需浓度后，把直径约为5-6cm的叶片浸入药液中5-6秒，取出，放在吸水纸上晾干，放在指定的培养皿中，接入10头3龄幼虫，放入27
±
1℃的养虫室中观察3-4天后检查结果。
[0048]
棉铃虫的活性测试
[0049]
棉铃虫的实验方法：饲料混药法，从配置好的溶液中移取3ml加入约27g的刚配置好的饲料中，从而得到稀释十倍的所需浓度。药剂混匀后均匀地倒入干净的24孔板中，晾凉后接入24头三龄棉铃虫，观察3-4天后检查结果。
[0050]
血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱对蚜虫、小菜蛾、粘虫、玉米螟和棉铃虫活性测试结果如下：
[0051]
表3在不同浓度条件下试虫死亡率(％)
[0052][0053]
从表3可以看出血红白叶藤乙醇提取物和白叶藤碱对蚜虫、小菜蛾、粘虫、玉米螟和棉铃虫都有杀灭的作用，其中白叶藤碱在600mg/l浓度下对小菜蛾的杀灭活性为85％，血红白叶藤乙醇提取物在600mg/l浓度下对小菜蛾的杀灭活性为100％。