鹿角蕨的组培快繁方法

1.本发明涉及植物组培技术领域，具体地说，涉及鹿角蕨(platycerium)的组培快繁方法。


背景技术：

2.绿孢鹿角蕨(platycerium wallichii hooker)是水龙骨科(polypodiaceae)鹿角蕨属(platycerium)植物，为典型的热带雨林附生蕨类，该属约有15种，分布于非洲、热带亚洲和热带美的热带雨林中。中国仅有一种，即绿孢鹿角蕨，野外分布于云南省德宏州盈江县、陇川县和瑞丽市。绿孢鹿角蕨姿态优美，作为观叶植物中的珍稀物种，具有较高的观赏价值；作为热带雨林的标志物种，可为热带雨林的生态恢复提供依据，具有较高的生态价值；作为蕨类植物中的进化类群，对研究植物种间协同进化关系具有重要意义，具有较高的科学价值；此外具有药用价值，被当地人用作跌打药。目前绿孢鹿角蕨赖以生存的森林环境由于热区开发而遭到严重破坏，使其野生资源日益减少。加之绿孢鹿角蕨叶形奇特，观赏期长、易于管护，作为室内观叶植物中珍贵稀有的精品，一株株型优美的绿孢鹿角蕨在市场上可售卖数百元至上千元，野外残存的绿孢鹿角蕨资源因人为采挖获取暴利而进一步流失。绿孢鹿角蕨现已被列为国家二级保护植物，并有学者建议应将其列入一级保护并尽早进行人工有性繁殖研究。鹿角蕨属植物的栽培品种中，开发利用较好的有荷兰、美国加州圣迭戈、罗伯特和齐森亨尼等。然而市场上的绿孢鹿角蕨绝大部分来源于直接进口，国内缺乏规模化的繁殖与栽培，有关其市场开发在国内还属于空白阶段。因此，有必要开展绿孢鹿角蕨的繁殖技术研究，有效保护我国野生绿孢鹿角蕨资源的同时，促进其野生居群的扩大和可持续开发利用。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种鹿角蕨的组培快繁方法。
4.为了实现本发明目的，本发明提供一种鹿角蕨(platycerium)的组培快繁方法，包括以下步骤：
5.1)采集的鹿角蕨孢子经消毒后，接种在1/2ms或改良knops培养基上进行孢子萌发及孢子体诱导；
6.2)待孢子体生长至叶宽0.5
‑
1.0cm(优选0.5cm)，转接至ms培养基上进行孢子体增殖，或者，转接至培养基i上进行ggb诱导。
7.所述培养基i为ms+6
‑
ba 0.5
‑
1.0mg
·
l
‑1+naa 1.0
‑
1.5mg
·
l
‑1+ac 0.1
‑
0.3g
·
l
‑1；优选ms+6
‑
ba0.5 mg
·
l
‑1+naa 1.0mg
·
l
‑1+ac 0.1g
·
l
‑1。
8.上述各步骤使用的培养基中琼脂含量为4
‑
6g
·
l
‑1，ph 5.8
‑
6.0(优选ph 5.8)。
9.前述方法还包括步骤3)：待孢子体生长至叶宽1
‑
2cm，转接于含有200
‑
300mg
·
l
‑1(优选200mg
·
l
‑1)磷酸二氢钾的1/2ms培养基中进行组培苗的培养。磷酸二氢钾能增强植株持水力。
10.进一步地，待孢子体生长至叶宽3
‑
4cm(移栽炼苗的最佳时机，成活率较高)，移栽于培养基质(如泥炭藓)中进行培养。
11.所述培养基质还可以是泥炭藓与蛭石的混合物，其中泥炭藓与蛭石的体积比为3:1。
12.培养过程中，可辅以0.1
‑
0.3mg
·
l
‑1乙烯利(优选0.1mg
·
l
‑1)和/或400
‑
600mg
·
l
‑1(优选500mg
·
l
‑1)多效唑对组培苗进行叶面喷施。喷施乙烯利能有效提高组培苗木质化；喷施多效唑能有效抑制植株失水，提高木质化程度。
13.前述的方法，培养条件均为温度23
±
2℃，光照强度150
‑
200μmol
·
m
‑2·
s
‑1，光周期12h
·
d
‑1。
14.步骤1)中消毒的方法为：将鹿角蕨孢子用0.1或0.2％氯化汞溶液消毒4
‑
6min(优选5min)后，用无菌水冲洗3
‑
5次。
15.优选地，所述鹿角蕨为绿孢鹿角蕨(platycerium wallichii)、二歧鹿角蕨(platycerium bifurcatum)。
16.本发明以绿孢鹿角蕨的孢子为材料，从孢子萌发、孢子体诱导、孢子体带根增殖，以及外源物质处理生根苗以提高其适应性等方面进行了试验比较，并建立了绿孢鹿角蕨的组培快繁体系，优化其组培工艺、提高移栽炼苗成活率，实现了绿孢鹿角蕨的组培苗批量化繁育。本发明为绿孢鹿角蕨的产业化开发及利用提供了技术支撑，同时也为绿孢鹿角蕨的种群恢复、野生资源保护提供了保障。该方法同样适用于二歧鹿角蕨的组培快繁。
附图说明
17.图1为本发明较佳实施例中绿孢鹿角蕨配子体状态及诱导孢子体情况(60d)。a：从左到右依次为ms、1/2ms、1/4ms、knops；b：1/2ms上诱导出孢子体。
18.图2为本发明较佳实施例中不同培养基中绿孢鹿角蕨孢子体长势。a：处理1(60d)；b：处理2(60d)；c：处理3(60d)；d：处理4(40d)；e：处理4(60d)。
19.图3为本发明较佳实施例中组培苗持水力。a：组培苗含水量变化；b：组培苗失水速率变化。
20.图4为本发明较佳实施例中组培苗持水力。a：组培苗含水量变化；b：组培苗失水速率变化。
21.图5为本发明较佳实施例中组培苗生长情况(30d)。a：处理ck(对照)；b：处理1(喷施脱落酸)；c：处理2(喷施磷酸二氢钾)；d：处理3(喷施乙烯利)；e：处理4(喷施多效唑)。
22.图6为本发明较佳实施例中组培苗长势图。a：规格为＜1cm(左)、1
‑
2cm(右)；b：规格为3
‑
4cm；c：规格为＞4cm的生长状态。
具体实施方式
23.本发明涉及的术语：
[0024]6‑
ba：6
‑
苄基腺嘌呤；
[0025]
naa：萘乙酸；
[0026]
ac：活性炭；
[0027]
ms培养基和改良knops培养基配方如下：
[0028][0029][0030]
1/2ms培养基：在ms培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/2；
[0031]
1/4ms培养基：在ms培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/4。
[0032]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0033]
以下实施例中涉及的指标测定及数据分析
[0034]
1、相对含水量和水分饱和亏
[0035]
相对含水量(rwc)(％)＝(组织鲜重－组织干重)/(组织被水充分饱和后的重量－组织干重)
×
100
[0036]
水分饱和亏(wsd)(％)＝(饱和后鲜重－原鲜重)/(饱和后鲜重－干重)
×
100
[0037]
2、持水力测定
[0038]
试验以含水率和失水速率为依据，对持水力的大小做出判断。用自然干燥法测定：称取植株鲜重后浸于自来水中，吸水12h后称取植株饱和重。然后在室内正常条件下进行自然脱水。脱水0.5h时称重一次，之后每隔1h称重一次，直至恒重。最后将叶片烘干，称取干重。根据所得数据，计算出每次称重时的植株含水率(占干重)和失水速率，计算公式如下：
[0039]
含水率(％)＝(失水前植株重
‑
植株干重)/植株干重
×
100
[0040]
失水速率(％)＝(失水前植株重
‑
失水后植株重)/植株干重
×
100
[0041]
3、木质化程度的测定
[0042]
将鹿角蕨植株进行称重，记录其鲜重、干重，利用公式：植株干重/植株鲜重，计算鹿角蕨植株的木质化程度。
[0043]
4、数据分析
[0044]
试验相关数据采用originpro 8.5、excel2010等软件进行统计分析。
[0045]
实施例1绿孢鹿角蕨组培快繁方法的建立
[0046]
1材料与方法
[0047]
1.1试验材料
[0048]
绿孢鹿角蕨孢子采自西南林业大学温室。将孢子叶置于硫酸纸袋中，待孢子自然散落后收集在离心管内，置于4℃种子柜里备用。
[0049]
1.2试验方法
[0050]
1.2.1孢子萌发及孢子体诱导
[0051]
将孢子用0.1％的氯化汞溶液消毒5min，再用无菌水冲洗3次后，接种在1/2ms培养基上。待孢子萌发至出现深绿色的心形配子体后，将其转接至ms、1/2ms、1/4ms、改良knops 4种培养基上，琼脂4g
·
l
‑1，ph 5.8。每瓶接种5个配子体团，每个处理5瓶，重复3次。接种后每周观察配子体长势及孢子体诱导情况，2个月后通过比较筛选出最适于诱导孢子体的培养基。
[0052]
不同培养基对诱导孢子体的影响：
[0053]
试验结果显示，4种培养基中配子体生长状况呈现出明显差别，配子体生长状态由优到差的培养基配方依次为ms、1/4ms、1/2ms、改良knops(图1a)。其中ms和1/4ms培养基上配子体长势虽好但并未诱导出孢子体，而1/2ms培养基上诱导出少量孢子体(图1b)，改良knops培养基上配子体长势最差，但也有少量孢子体产生。综上，ms、1/4ms培养基利于配子体的营养生长，1/2ms、改良knops培养基可用于诱导绿孢鹿角蕨孢子体产生。
[0054]
1.2.2孢子体带根增殖培养基筛选
[0055]
选取同一规格(叶宽约0.5cm)孢子体，分别接种在以下培养基中：ms、1/2ms、1/4ms、ms+6
‑
ba0.5 mg
·
l
‑1+naa 1.0mg
·
l
‑1+ac 0.1g
·
l
‑1、1/2ms+6
‑
ba0.5 mg
·
l
‑1+naa 1.0mg
·
l
‑1+ac 0.1g
·
l
‑1、1/4ms+6
‑
ba0.5 mg
·
l
‑1+naa 1.0mg
·
l
‑1+ac 0.1g
·
l
‑1。每瓶接种5株，每个处理5瓶，重复3次。接种后每周观察一次，2个月后统计孢子体增殖和生长状况，筛选出最适于孢子体带根增殖的培养基。
[0056]
不同培养基对孢子体带根增殖的影响：
[0057]
如表1所示，处理1中孢子体生长健壮，小苗增殖较多，长势较好(图2a)；处理2和3中存在玻璃化现象，且处理3小苗多数褐化，生长状况较差(图2b、c)；处理4、5、6的孢子体经培养后，叶片逐渐萎蔫，孢子体中央生长点开始膨大，培养25天后形成较多ggb。其中，处理4的ggb诱导率达100％，并在培养40天后开始分化小苗(图2d)，60天时生成较多丛生苗(图2e)。综上，ms培养基为绿孢鹿角蕨孢子体带根增殖的最适培养基，ms+6
‑
ba0.5 mg
·
l
‑1+naa 1.0mg
·
l
‑1+ac 0.1g
·
l
‑1的培养基配方能有效诱导ggb，且适合ggb分化小苗。
[0058]
表1不同培养基对孢子体生长的影响
[0059][0060]
1.2.3不同浓度的磷酸二氢钾对绿孢鹿角蕨组培苗持水力的影响
[0061]
以1/2ms为基本培养基，加入不同浓度磷酸二氢钾(0、100、200、300、400、500mg
·
l
‑1)。琼脂6g
·
l
‑1，ph 5.8。试验选取叶宽约2cm的健壮组培苗，转接于培养基中。每瓶3株苗，每个处理5瓶，重复3次。培养1个月后，进行各项指标测定。
[0062]
不同浓度磷酸二氢钾处理对组培苗持水力的影响：
[0063]
本试验以脱水6h过程中的含水量和失水速率为依据，对持水力的强弱做出判断。由图3可知，组培苗含水量随失水时间逐级递减，失水速率均呈现“由快到慢”的趋势。失水30min内含水量下降最快，5h后含水量曲线趋于平缓。失水前后含水量变化幅度从大到小依次是：ck(89.72％)>处理1(79.60％)>处理2(78.72％)>处理3(77.43％)>处理4(76.80％)>处理5(73.36％)(图3a)，可见磷酸二氢钾处理能有效抑制植株失水。整体失水速率从高到低呈现为处理3>处理1>ck>处理4>处理5>处理2(图3b)，可见处理2(添加磷酸二氢钾200mg)能在维持植株含水量的同时，有效抑制植株失水，增强持水力及植株对环境的适应性。
[0064]
1.2.4喷施不同外源物质对绿孢鹿角蕨叶片木质化的影响
[0065]
以泥炭藓为培养基质，选取叶宽约2cm的组培苗移栽于基质中。选取脱落酸(4mg
·
l
‑1)，磷酸二氢钾(1000mg
·
l
‑1)，乙烯利(0.1mg
·
l
‑1)、多效唑(500mg
·
l
‑1)及喷施水(对照)，对组培苗进行叶面喷施(1次/天，喷适量20ml/次)。每盆16株组培苗，每个处理1盆，重复3次。处理1个月后，进行各项指标测定。
[0066]
(1)喷施不同外源物质对绿孢鹿角蕨叶片木质化的影响：
[0067]
表2结果显示，木质化程度由高到低依次是：处理3>处理4>ck>处理2>处理1；植株相对含水量由高到低依次是：处理1>处理3>处理4>处理2>ck，水分饱和亏则与此相反。各处理相对含水量均显著高于对照，由此说明各处理均能有效增强植株保水性。移栽后除ck处理的植株有多数发黄萎蔫现象外，其他处理只有少数萎蔫。综上，该试验中外源物质的喷施能显著提高组培苗的保水性，其中乙烯利、多效唑能有效增强组培苗木质化，有利于提高幼苗对环境的适应能力。
[0068]
表2不同外源物质处理的组培苗生长状况
[0069][0070]
注：同列不同小写字母表示在p≤0.05水平差异显著；“+”、“++”和“+++”分别代表
整体状况“一般”、“良好”和“较好”。
[0071]
(2)喷施不同外源物质对组培苗持水力的影响
[0072]
本试验以脱水6h过程中的含水量和失水速率为依据，对持水力的强弱做出判断。由图4可知，组培苗含水量随失水时间逐级递减，失水速率均呈现“由快到慢”的趋势。失水1h内含水量下降最快，5h后含水量曲线趋于平缓。其中失水前后含水量下降幅度从大到小依次是：ck(88.39％)>处理3(84.59％)>处理1(82.72％)>处理4(72.20％)>处理2(70.67％)，处理2和处理4含水量的下降幅度接近，且失水2h后明显高于其他处理(图4a)。失水过程中，处理ck的失水速率在半小时内达最高值，此后逐级递减；其余处理失水速率变化趋势相似，均在1h内失水最快，之后逐渐降低，总体呈现出“慢—快—慢”的趋势。失水速率由高到低依次是：ck>处理1>处理3>处理2>处理4。综上，该试验中喷施四种外源物质都有助于降低植株失水速率，其中处理4(多效唑)、处理2(磷酸二氢钾)对增强植株保水性的作用更明显(图4b)。组培苗生长情况(30d)见图5。
[0073]
1.2.5组培苗规格大小对移栽成活的影响
[0074]
以泥炭藓为培养基质，选取4个规格的组培苗：叶宽0.5
‑
1cm、1
‑
2cm、3
‑
4cm、4
‑
5cm。将不同大小的组培苗分别移栽到基质上，浇水后覆盖保湿。每盆30株，每个处理1盆，重复3次。处理3个月后统计组培苗成活率和生长情况。
[0075]
由于组培苗生长环境相对于外界是无菌、恒温的，转移到室外时需先开盖适应，待小苗稳定生长后进行移栽。经3个月炼苗后，四种规格的小苗呈现出的生长状况有了明显差异。其中处理3的幼苗成活率最高，且状态较好，陆续长出新叶；处理2的幼苗成活率次之，但长势一般，生长状况稍差；处理4的幼苗新生的叶片数最多，但移植成活率、长势一般；处理1的幼苗在炼苗过程中成活率较低，仅占一半的存活量。综上，幼苗生长至叶宽3
‑
4cm时最适合用于出瓶移栽(表3)。
[0076]
表3不同规格组培苗的炼苗效果
[0077][0078]
注：成活率＝成活株数/总株数
×
100％
[0079]
组培苗长势图见图6。
[0080]
1.2.6培养条件
[0081]
以上试验培养条件均为温度23℃，光照强度150μmol
·
m
‑2·
s
‑1，光周期12h
·
d
‑1，ph 5.8。
[0082]
诱导孢子体是蕨类植物组织培养中的重要过程，除了受到糖类、无机盐含量、外源激素等因素影响外，还与环境中光照、水分、群体密度、性器官发育有关。有研究指出，群体密度会影响配子体的性别分化，miller也认为高培养密度下的配子体通常发育成无性或雄性的狭长丝状体，而低培养密度下的配子体则通常发育为雌性或两性配子体。本发明研究结果也显示，在诱导孢子体阶段，配子体长势较好较密集的培养基中，配子体仅进行营养生长而不产生孢子体；而配子体生长状态相对差、分布较稀疏的培养基中，能产生孢子体，推
测该现象可能与配子体群体密度有关。通过诱导获得的孢子体数量有限，所以孢子体的增殖过程尤为关键。常规的增殖须经历诱导愈伤组织、丛生芽，分化成苗以及生根培养等阶段，具有增殖缓慢、生根率较低等缺点。本发明采取“带根增殖”的方式，利用绿孢鹿角蕨根源型克隆生长(root derived clonal growth)的特性，达到孢子体增殖的目的，同时提高孢子体成活率。这与白芳芳等的无性繁殖试验中，发现带根繁殖的成活率要高于不带根的结果相同。目前尚未有关绿孢鹿角蕨带根增殖的研究，该试验结果可为后期繁育研究提供实验基础。此外，该试验通过添加激素成功诱导出大量ggb，且该ggb仅在原培养基上便可正常分化成苗，该ggb途径能显著提高增殖率，也是孢子体增殖的有效途径。
[0083]
植物组织培养是一个系统工程，各个环节相互衔接，只有各阶段达到相互统一的状态，其培育出的组培苗才会更加优质。移栽炼苗作为组培过程中的最后一个环节，它的成功与否，将会直接决定着整个组培快繁体系的成败。在组培苗移栽炼苗过程中，由于试管苗长期处于无菌、稳定的环境中，在生根初期还无法具备完全自养的能力。特别是生理特性和组织结构与自然环境下的植株差别较大，如叶片组织发育不完善，输导系统作用弱，易失水。因而在移栽时极易出现水分失去平衡，使细胞失去膨压，造成组培苗萎蔫或死亡。提高组培苗移栽成活率的一个有效办法是提高植株木质化程度，木质化不仅有利于维持植物正常生命活动，而且能够增强植物适应外界生物和非生物胁迫的能力。有研究表明，磷酸二氢钾和多效唑能有效提高植株的木质化程度。本发明中，磷酸二氢钾和多效唑处理均未能有效增强木质化，但在维持绿孢鹿角蕨组培苗水分平衡和持水力方面有明显作用，或许是由于材料不同以及浓度过低所致。此外，植物生长调节剂是调控木质化发育的重要信号分子。其中，脱落酸在植物逆境胁迫，如干旱、高盐、低温和病虫害中有着功不可没的作用。有研究表明，外源脱落酸能显著提高抗氧化酶活性，使气孔快速关闭，提高叶片保水能力，是一种理想的抗蒸腾剂。本发明中，喷施外源脱落酸的植株相对含水量最高，可见该处理能显著促进保水，增强植株的抗旱性；在木质化方面未有明显作用，说明脱落酸处理不能有效增强植株木质化。本发明中，乙烯利处理的组培苗木质化程度和相对含水量最高，移栽成活率也最高，可将其作为首选外源物质而广泛应用于炼苗阶段。
[0084]
此外，试验过程中发现移栽成活率高低与组培苗大小有较大关系，组培苗叶片较小则营养积累少且适应能力差，易受环境变化而影响成活率；组培苗叶片较大，营养物质的储存较多，虽有利于产生新叶，但炼苗过程中容易造成在新根产生之前失水过多的问题，从而导致叶片褐化萎蔫，成活率较低。通过筛选得出，叶宽3
‑
4cm的绿孢鹿角蕨组培苗最适宜于出瓶移栽。
[0085]
本发明采用孢子繁殖的方法，通过组织培养，筛选出适合绿孢鹿角蕨孢子萌发到成苗的培养基，通过“带根增殖”和ggb途径，缩减并优化了组培工序；找到促进组培苗木质化和增强其持水力的外源物质，以及适合出瓶移栽的组培苗规格，从而提高组培苗质量和炼苗成活率。为绿孢鹿角蕨组培过程复杂和炼苗困难提供了解决方案，也为种苗的规模化生产提供技术支持。
[0086]
实施例2二歧鹿角蕨组培快繁技术的优化
[0087]
1材料与方法
[0088]
1.1试验材料
[0089]
二歧鹿角蕨孢子采自西南林业大学温室。将孢子叶置于硫酸纸袋中，待孢子自然
散落后收集在离心管内，置于4℃种子柜里备用。
[0090]
1.2试验方法
[0091]
1.2.1孢子萌发及诱导ggb
[0092]
将孢子用5％的次氯酸钠溶液消毒5min，再用无菌水冲洗5次后，接种在1/2ms培养基上。待孢子萌发至出现深绿色的心形配子体后，将其进行继代培养，直至诱导长出少量孢子体。将孢子体转接在1/2ms+蔗糖15g/l+琼脂4g/l，ph5.8的培养基中。分别添加不同种类和浓度的激素，以及不同浓度的活性炭。采用l9(33)正交设计进行试验(表4)，共9个处理组合，每个处理5瓶，每瓶接种5株孢子体，重复3次。培养条件均为温度23
±
2℃，光照强度150
‑
200μmol
·
m
‑2·
s
‑1，光周期12h
·
d
‑1。接种后每周观察一次，2个月后统计ggb诱导率和生长状况。
[0093]
表4试验的因素水平表
[0094][0095]
不同激素组合对诱导ggb的影响如表5所示，处理5和9中的ggb诱导率较高，且ggb生长健壮，长势较好，无褐化现象；处理6和8中ggb诱导率高，但少数ggb有褐化的现象出现；处理2和3中ggb诱导率一般，ggb生长健康；处理4和7中ggb诱导率较低，ggb长势略差，体积较小；其中处理1(对照)中，孢子体正常生长，但未成功诱导出ggb。综上，处理5和9最适宜用于诱导ggb。
[0096]
表5不同激素组合对诱导ggb的影响
[0097][0098]
注：同列不同小写字母表示在p≤0.05水平差异显著；“+”、“++”和“+++”分别代表整体状况“一般”、“良好”和“较好”。
[0099]
1.2.2ggb分化成苗及移栽炼苗
[0100]
将诱导得到的ggb在原配方培养基中进行继代培养，ggb能正常分化成苗。将小苗转接于1/2ms培养基上，小苗能正常生长。选取其中叶宽3
‑
4cm的小苗，在室温下开盖适应7天后，进行移栽炼苗试验。选取泥炭藓、泥炭藓:蛭石＝3:1(体积比)和泥炭藓:蛭石:沙＝2:1:1(体积比)三种基质，去除小苗根部的培养基残留物后，将其移栽至基质上，每盆30株，每个处理1盆，重复3次。浇水后覆盖保湿，在室温下进行炼苗。处理1个月后统计组培苗成活率
和生长情况。
[0101]
不同栽培基质的炼苗效果：
[0102]
经培养后，三种处理的小苗生长状况有了明显差异。如表6所示，处理1的小苗成活率最高，达86.67％，且小苗状态较好，陆续长出新叶；处理2的幼苗成活率次之，少数小苗萎蔫外其他生长状况均较好；处理3的小苗移栽成活率最差，较多小苗萎蔫。综上，小苗适合移栽于泥炭藓、泥炭藓:蛭石＝3:1两种基质中。
[0103]
表6不同栽培基质的炼苗效果
[0104][0105]
注：成活率＝成活株数/总株数
×
100％
[0106]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0107]
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