新的食品防腐剂及其制备方法和应用

新的食品防腐剂及其制备方法和应用
1.本申请是申请日为2019年6月24日、申请号为201910549117.8、发明名称为“新的食品防腐剂及其制备方法和应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及食品防腐剂，具体是涉及含有月桂酰精氨酸乙酯衍生物(离子对化合物)的食品防腐剂，该月桂酰精氨酸乙酯离子对具有抗菌效果，能防止由微生物引起的腐败变质、延长食品保质期。


背景技术：

3.食品防腐剂是能防止由微生物引起的腐败变质、延长食品保质期的添加剂。因兼有防止微生物繁殖引起食物中毒的作用，又称抗微生物剂(antimicrobial)。它的主要作用是抑制食品中微生物的繁殖。
4.我国批准的食品防腐剂包括苯甲酸\苯甲酸钠、山梨酸\山梨酸钾、丙酸钙、丙酸钠、对羚基苯甲酸乙脂、对羚基苯甲酸丁脂、脱氢乙酸、双乙酸钠、富马酸二甲酯、乳酸链球菌素、二氧化碳、过氧化氢、霉灵。其中，其中最常用的有苯甲酸钠、山梨酸钾等。苯甲酸钠的毒性比山梨酸钾强，而且在相同的酸度值下抑菌效力仅为山梨酸的1/3，因此许多国家逐渐用山梨酸钾。但因苯甲酸钠价格低廉，在我国仍普遍使用，主要用于碳酸饮料和果汁饮料。山梨酸钾抗菌力强，毒性小，可参与人体的正常代谢，转化为co2和水。从防腐剂的发展趋势上看，以生物发酵而成的生物防腐剂，将成为未来的发展趋势。
5.随着现代人们对养生和健康饮食意识的增加，研制天然无毒型防腐剂成为包括化妆品、食品在内的众多领域中研究热点。
6.月桂酰精氨酸乙酯(ethyl lauroylarginate，lae)是一种由脂肪酸和二元氨基酸缩合而成的有机物，为白色吸湿性固体，在ph3～7范围内化学性质稳定，熔点50～58℃，该温度下247g的lae可分散于1kg的水中，它在水和油中的分配系数大于10，即主要存在于水相中。研究发现，月桂酰精氨酸乙酯lae具有抗菌能力强、生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高的特点。而其中最具代表性的特点是月桂酰精氨酸乙酯代谢无残留，相关研究显示月桂酰精氨酸乙酯在人体与动物体内可快速进行自然代谢，生成月桂酸和精氨酸，进一步被代谢为鸟氨酸、尿素、二氧化碳和水。月桂酰精氨酸乙酯代谢过程中所产生的所有初级代谢产物及终产物都是无毒无害的，与人和动物日常摄取的食物在体内的代谢产物相同。
7.2005年，美国fda批准lae为gras(一般公认安全)类食品添加剂，2007年通过了欧洲食品安全管理局(efsa)的安全食品认证，2011年国际食品法典委员会将lae列入食品添加剂通用法典标准中，许可lae作为防腐剂用于20多种食品及生鲜农产品中。
8.中国发明专利200980104596.7、“使用阳离子表面活性剂防护牙齿侵蚀”公开了以lae作为阳离子表面活性剂作为经口使用的组合物形式施用，所述经口使用的化妆品组合物例如为甜食、糖果、片剂、糖锭、棒棒糖、求斯糖、果冻、胶糖、滴剂或打算用于溶解的饮料
粉的干粉混合物，其中该lae化合物以按重量计0.001％到5％、优选为按重量计0.001％到2％的浓度存在于组合物中。该组合物中，由于lae的存在而产生微生物效应，并提供了中和菌斑酸的来源，取得良好的效果。
9.中国发明专利201480081262.3、“包含过氧化物源和n
‑
乙酰
‑
l
‑
精氨酸烷基酯盐的漱口水组合物”公开了lae及其盐与过氧化氢(h2o2)配比的漱口水，其中该lae及其盐以按重量计0.05％到0.4％、优选为按重量计0.1％到0.3％的浓度存在于组合物中，能够具有有效增白活性和抗微生物活性的双重效果，并且该效果能随时间的推移维持所述增白活性和抗微生物活性。
10.然而，涉及lae及其盐的食品防腐剂的发明研究，主要集中在国外申请人。面对全球最大的食品市场，我国需要一种新的高效、无毒、稳定的食品防腐剂。


技术实现要素：

11.本发明原理之一在于，根据月桂酰精氨酸乙酯lae具有抗菌能力强、生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高且常温下与其他化合物不发生反应的特点，进一步对lae进行改进，获得一种新型衍生物，即将lae与有机酸盐发生缩合反应，从而获得lae离子对化合物。该离子对化合物作为化妆品中的抑菌剂和防腐剂成分，相对于lae具有抑菌效果更好、且使用剂量更低的优点，从而更利于制备天然无毒环保型的食品防腐剂。
12.因此，本发明第一个发明目的是提供lae离子对化合物作为食品防腐剂的用途，其中，所述lae离子对化合物具有如下式(iii)所示结构式：
[0013][0014]
其中，所述rcoo
‑
有机酸或盐选自具有抗菌活性的水杨酸、甲酸、甲酸铵、甲酸钙、乙酸、双乙酸钠、丙酸、丙酸铵、丙酸钠、丙酸钙、丁酸、丁酸钠、乳酸、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸钾、富马酸、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙、酒石酸、苹果酸、磷酸、碳酸钠、草酸或碳酸。在一个优选实施方案中，所述有机酸选自烟酸、酒石酸、草酸、水杨酸。
[0015]
在上述任一实施方案中，所述食品是固体食品、液体食品、流质食品、粉末食品等。
[0016]
其中，所述lae离子对化合物在食品中的质量百分比浓度为0.001
‑
1％；优选地，为0.001
‑
0.01％、0.01
‑
0.05％、0.05
‑
0.1％、0.1
‑
0.5％、0.5
‑
1％进一步优选地，为0.01
‑
0.05％、0.05
‑
0.1％。
[0017]
本发明第三个发明目的是提供制备含有上述lae离子对化合物的防腐剂的方法，步骤包括：
[0018]
(1)加热溶解式(ii)所示的化合物，而后加入有机酸盐溶液；
[0019]
(2)充分搅拌混匀，并在加热的条件下，反应生成lae离子度化合物，所述反应如下反应式所示：
[0020][0021]
其中，所述rcoo
‑
有机酸或盐选自具有抗菌活性的水杨酸、甲酸、甲酸铵、甲酸钙、乙酸、双乙酸钠、丙酸、丙酸铵、丙酸钠、丙酸钙、丁酸、丁酸钠、乳酸、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸钾、富马酸、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙、酒石酸、苹果酸、磷酸、碳酸钠、草酸或碳酸。在一个优选实施方案中，所述有机酸选自烟酸、酒石酸、草酸、水杨酸。
[0022]
(3)充分反应后，冷却室温，纯化后真空干燥，从而制备式(iii)所示的月桂酰精氨酸乙酯有机酸离子对化合物；
[0023]
(4)在容器中，将lae离子对化合物溶于有机溶剂中，获得离子对化合物母液；
[0024]
(5)室温下，取上述母液加入防腐剂的基质中，充分搅拌，从而获得防腐剂。
[0025]
步骤(1)中，所述加热溶解的温度为50℃
‑
100℃；优选地，为90℃。
[0026]
步骤(2)中，所述反应的温度为50℃
‑
100℃；优选地，为90℃。
[0027]
步骤(2)中，所述反应的时间为50℃
‑
100℃；优选地，为90℃。
[0028]
步骤(3)中，所述真空干燥的条件为50℃
‑
100℃；优选地，为60℃。
[0029]
步骤(4)中，所述容器优选为不锈钢制或惰性材质的容器。
[0030]
步骤(4)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇等。
[0031]
在一个实施方案中，其中，所述rcoo
‑
有机酸或盐选自具有抗菌活性的水杨酸、甲酸、甲酸铵、甲酸钙、乙酸、双乙酸钠、丙酸、丙酸铵、丙酸钠、丙酸钙、丁酸、丁酸钠、乳酸、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸钾、富马酸、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钙、酒石酸、苹果酸、磷酸、碳酸钠、草酸或碳酸。在一个优选实施方案中，所述有机酸选自烟酸、酒石酸、草酸、水杨酸。
[0032]
在另一实施方案中，所述rcoo
‑
有机酸盐的制备方法如下：将所述有机酸加入甲醇溶液中，并加入适量的naoh，室温搅拌直至析出白色固体，抽滤并用甲醇分洗涤，得到有机酸盐。
[0033]
本发明第四个目的是提供含有上述lae离子对化合物或通过上述方法所制备的防腐剂。
[0034]
术语和定义
[0035]
月桂酰精氨酸乙酯(ethyl lauroylarginate，lae)是一种由脂肪酸和二元氨基酸缩合而成的有机物，为白色吸湿性固体，在ph3～7范围内化学性质稳定，熔点50～58℃，该温度下247g的lae可分散于1kg的水中，它在水和油中的分配系数大于10，即主要存在于水相中。研究发现，月桂酰精氨酸乙酯lae具有抗菌能力强、生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高的特点。而其中最具代表性的特点是月桂酰精氨酸乙酯代谢无残留，相关研究显示月桂酰精氨酸乙酯在人体与动物体内可快速进行自然代谢，生成月桂酸和精氨酸，进一步被代谢为鸟氨酸、尿素、二氧化碳和水。月桂酰精氨酸乙酯代谢过程中所产生的所有初级代谢产物及终产物都是无毒无害的，与人和动物日常摄取的食物在体内的代谢产物相同。
[0036]
本发明对lae的衍生物进行改进，突破对于衍生物开发的传统思路，即不再局限于选择传统上适于lae的酸、碱、盐/酯的合适形态，或对lea进行酸、碱、盐或酯化基团的处理，而是创造性的选择一种能够增强lae的抑菌协同效应的酸根基团，并将二者非常规地通过分子间强烈的离子键结合成新的衍生物，即离子对化合物，从而显著地提高了lae衍生物在食品防腐剂中的用途。
[0037]
技术效果
[0038]
本发明化妆品组合物的优点是：
[0039]
创造性使用lae离子对化合物代替食品中的抑菌剂和防腐剂，在保留传统食品防腐剂的成本低廉、制作工艺简单、稳定性好的优点的同时，还具有抑菌效果显著，成分单一且制备简单，对人体无伤害，易于分解代谢，易于长期保存等优点。
附图说明
[0040]
图1：lae离子对化合物的阳离子b+分子离子峰的esi质谱图；
[0041]
图2：lae烟酸离子对化合物的阴离子a
‑
分子离子峰的esi质谱图；
[0042]
图3：lae的1h
‑
nmr的峰形和化学位移图；
[0043]
图4：烟酸的1h
‑
nmr的峰形和化学位移图；
[0044]
图5：lae烟酸离子对的1h
‑
nmr的峰形和化学位移图；
[0045]
图6：lae酒石酸离子对化合物的阴离子a
‑
分子离子峰的esi质谱图。
具体实施方式
[0046]
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0047]
实施例一：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与烟酸合成离子对化合物的制备方法
[0048]
将烟酸钠(购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)2.0g溶于50ml水中，配制成烟酸钠盐水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐6.8g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下
将烟酸钠盐水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得烟酸离子对化合物7.6g。
[0049]
实施例二 月桂酰精氨酸乙酯烟酸离子对化合物分子式、分子量的分析
[0050]
通过质谱、1h
‑
nmr、
13
c
‑
nmr波谱分析所得到的化合物分子式为：
[0051]
1.质谱(esi)分析
[0052]
阳离子b
+
分子离子峰的m/z＝385.3，参见图1；
[0053]
阴离子a
‑
分子离子峰的m/z＝122.1，参见图2。
[0054]
烟酸离子对化合物中阳离子的理论计算值为507.4，实测值与理论值吻合。
[0055]
2.nmr分析
[0056]
将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(参见图3)、烟酸的1h
‑
nmr(参见图4)和lae烟酸离子对化合物的1h
‑
nmr(参见图5)相比较。由于lae离子对化合物在成盐过程中，在该离子对化合物中月桂酰精氨酸乙酯的峰形及化学位移变化不大，但烟酸上的所有氢都有位移变化，其波谱特征与原无机酸盐(即lae盐酸盐)相比，酸碱两部分空间距离更加接近，产生影响，因此其与原lae及其盐酸盐相比，产生相应变化，并不是简单的酸碱两部分的迭加，例如在纯净水洗涤沉淀时，溶解性已发生改变，这说明月桂酰精氨酸乙酯的所有氢核与烟酸之间产生了强相互作用，并通过强烈的离子键形成了稳定的单一化合物结构。
[0057]
实施例三：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与酒石酸合成离子对化合物的制备方法
[0058]
将酒石酸(购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)2.0g溶于50ml甲醇中，加入当量的naoh，室温搅拌直至析出白色固体，抽滤并用30ml甲醇分三次洗涤，得到酒石酸钠盐。酒石酸钠盐溶于50ml水中，配制成酒石酸钠盐水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐5.6g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将酒石酸钠盐水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得酒石酸离子对化合物6.3g。
[0059]
实施例四 月桂酰精氨酸乙酯酒石酸离子对化合物分子量的分析
[0060]
质谱(esi)分析阳离子b
+
分子离子峰的m/z＝385.3(参见图1)
[0061]
阴离子a
‑
分子离子峰的m/z＝149.0(参见图6)
[0062]
烟酸离子对化合物中阳离子的理论计算值为534.3，实测值与理论值吻合。
[0063]
实施例五：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与草酸合成离子对化合物的制备方法
[0064]
将草酸(购于探索有限公司)1.0g溶于50ml甲醇中，加入当量的naoh，室温搅拌直至析出白色固体，抽滤并用30ml甲醇分三次洗涤，得到草酸钠盐。草酸钠盐溶于50ml水中，配制成草酸钠盐水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐4.7g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将草酸钠盐水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得草酸离子对化合物5.0g。
[0065]
按照实施例二的方法，进行nmr分析和esi分析，结果表明该离子对化合物的波谱特征不是简单的酸碱两部分的迭加，酸碱两部分空间距离接近，产生影响，其波谱数据与原
lae及其盐酸盐相比，产生相应变化，例如在纯净水洗涤沉淀时，溶解性已发生改变，这说明月桂酰精氨酸乙酯的所有氢核与草酸之间产生了强相互作用，并通过强烈的离子键形成了稳定的单一化合物结构。
[0066]
实施例六：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与碳酸合成离子对化合物的制备方法
[0067]
将碳酸钠(购于探索有限公司)1.0g溶于50ml水中，配制成碳酸钠水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐4.0g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将碳酸钠水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得碳酸离子对化合物4.0g。
[0068]
按照实施例二的方法，进行nmr分析和esi分析，结果表明该离子对化合物的波谱特征不是简单的酸碱两部分的迭加，酸碱两部分空间距离接近，产生影响，其波谱数据与原lae及其盐酸盐相比，产生相应变化，这说明月桂酰精氨酸乙酯的所有氢核与碳酸之间产生了强相互作用，并通过强烈的离子键形成了稳定的单一化合物结构。
[0069]
实施例七：月桂酰精氨酸乙酯离子对化合物体外最小抑菌浓度(mic)的测定
[0070]
原理与目的：根据clsi规定的微量肉汤稀释法，药物与细菌在96孔板内共孵育24h后，细菌生长被抑制的最小药物浓度为该药的最小抑菌浓度。
[0071]
方法：将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(lae)及上述所制备的月桂酰精氨酸乙酯有机酸离子对分别用胰酪胨大豆肉汤培养基(tsb)二倍稀释成不同浓度，药物与细菌在96孔板里混合孵育，另设无细菌的空白对照培养基ck1和添加lae(1000μg/ml)的培养基ck2以及不含药物的细菌正常生长对照培养基ck3。将96孔板放入37℃温箱中孵育24h后测定各孔625nm处的吸光光度值。与空白对照od
625
值一致的孔视为细菌无明显生长。细菌无明显生长的药物最低浓度为lae对细菌的最小抑菌浓度mic(minimal inhibitory concentration)。
[0072]
所制备的多种lae衍生物(离子对化合物)相对于原lae化合物的抗菌活性的比较结果如下表1所示，其中，括号()中的百分数值代表反应体系中各添加物的质量百分比。
[0073]
表1 lae及其离子对化合物对二种细菌的体外抗菌效果
[0074]
比较大肠杆菌金黄色葡萄球菌lae16(0.0016％)8(0.0008％)lae烟酸离子对16(0.0016％)4(0.0004％)lae酒石酸离子对16(0.0016％)8(0.0008％)lae草酸离子对8(0.0008％)8(0.0008％)lae碳酸离子对16(0.0016％)16(0.0016％)
[0075]
结果分析：
[0076]
(1)lae离子对化合物大部分对大肠杆菌保持相同的抗菌活性，尤其是lae草酸离子对化合物的抗菌活性上升；
[0077]
(2)lae离子对化合物大部分对金黄色葡萄球菌保持相同的抗菌活性，lae碳酸离子对化合物的抗菌活性下降，lae烟酸离子对化合物的抗菌活性显著上升；
[0078]
结论：lae衍生物的离子对化合物，不会对单一成分的原lae的抗菌活性产生抑制作用，相反有益于抗菌活性。其中，烟酸离子对化合物对金黄色葡萄球菌产生了显著的抑菌效果。
[0079]
实施例八：月桂酰精氨酸乙酯离子对化合物对食品致霉微生物的抑制活性测定
[0080]
原理与目的：
[0081]
青霉菌、曲霉菌是引起食物霉变的主要微生物，本实验用抑菌圈法检测了月桂酰精氨酸乙酯(lae)离子对化合物的保鲜膜对青霉菌、曲霉菌的抑制效果，从而评估月桂酰精氨酸乙酯离子对的防霉作用。
[0082]
本实验用抑菌圈法检测了月桂酰精氨酸乙酯(lae)离子对化合物对青霉菌、曲霉菌的抑制效果，从而评估月桂酰精氨酸乙酯离子对的防霉作用。
[0083]
方法：将青霉菌或曲霉菌孢子分别放入lb液体培养基、挑真菌单菌落放入pdb液体培养基于室温培养24h，将扩增的菌液均匀地涂布在lb固体培养基的表面。用0.8mm打孔器在培养基上打孔，将不同浓度的月桂酰精氨酸乙酯离子对或阳性水果防腐剂对羟基苯甲酸甲酯钠加入到孔中，每孔约100μl，盖好盖子，置于37℃培养箱培养48h。测量并统计每孔抑菌圈的直径。
[0084]
结果分析：表2、3分别为lae离子对化合物对青霉属、曲霉属的抑菌圈结果。lae及lae离子对均可以抑制青霉属的生长，lae、lae
‑
甲酸离子对、lae
‑
水杨酸离子对在大于或等于256μg/ml浓度下出现了抑制效果，lae
‑
烟酸离子对在大于或等于512μg/ml浓度下抑制微杆菌属的生长。lae及lae离子对均可以抑制曲霉属的生长，lae、lae
‑
甲酸离子对、lae
‑
水杨酸离子对在大于或等于128μg/ml浓度下出现了抑制效果，lae
‑
烟酸离子对在大于或等于256μg/ml浓度下抑制微杆菌属的生长。
[0085]
结论：lae可以抑制致霉微生物的生长，并且lae离子对并没有使其抑制致腐微生物的能力丧失，且lae
‑
烟酸离子对化合物对青霉菌、曲霉菌的抑制作用最强。
[0086]
表2 lae及其离子对化合物对青霉属的抑菌圈结果
[0087][0088][0089]
表3 lae及其离子对化合物对曲霉属的抑菌圈结果
[0090][0091]
虽然上述几组试验中，0.2％剂量组的抑菌效果最高，并且从申请人在先提交的专利申请来看(发明名称：“月桂酰精氨酸乙酯衍生物和作为动物用抗菌剂的用途”、申请号：201810648982.3)的体外细胞试验数据来看，0.0032％浓度即已产生抑菌效果，并且lae及其衍生物一定范围内的剂量加大可提高抑菌效果，但相对于0.1％剂量组的抑菌效果并没有显著的提高，说明0.02％
‑
0.1％的剂量范围已经满足生产需要。
[0092]
如果提高lae及其衍生物的添加量，虽然抑菌率相应提高，但过高抑菌率意味着较多的残留，并不有利于人体健康。即使如此，由于本发明的lae及其衍生物的抑菌剂成分属于天然环保无毒的成分，因此高剂量的添加使用仍然比传统的化学品抑菌剂具有对人体友好亲和的优点。
[0093]
因此，考虑到生产成本和实际生产需要，因此lae及其离子对作为抗微生物组合物的活性成分的质量百分比浓度为0.001
‑
0.01％或0.01
‑
0.05％、0.05
‑
0.1％、0.1
‑
0.5％能有效防治细菌或真菌类危害，符合生产的需要。