一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法

本发明属于柑橘轮斑病抗性鉴定技术领域，尤其涉及一种柑橘轮斑病室内抗性的鉴定方法。

背景技术：

目前，世界上所有重要的甜橘经济品种都起源于南亚和印度。如今柑橘已经遍布世界各地，只要有充足的降雨量或者灌溉就可以维持柑橘植株生长，即使有冰冻发生，一般也不会严重到使柑橘树死亡。中国是世界柑橘生产大国，以种植宽皮柑橘为主，宽皮柑橘类约占60％，甜橙类占30％，其余为柚子、柠檬和金柑等。据文献记载，甜橘生长期具明显危害的真菌性病害已多达35种。这些已报到的真菌性病害一般都在温暖湿润的季节发生，侵染多种柑橘品种的叶片、枝干和果实。

柑橘轮斑病是柑橘产区出现的一种新的真菌性病害，是一种低温性侵染病害，通常在冬末春初爆发侵染，危害柑橘叶片、枝梢、果实。而2006年或更早，陕西省城固县温州蜜柑(citrusunshiumarcov.)及金橘(fortunellamargarita(lour.)swingle)上发生一种毁灭性病害，每年冬春季叶片提前脱落，枝干大量枯死，树势衰弱，严重时整株枯死，甚至毁园。该病害已呈现出逐年严重的趋势，极大地影响了当地相橘生产和经济效益。对于该病害的病因，尚未有严密程序的病原鉴定。根据症状，当地有关技术人员将之推断为炭疽病、树脂病、湿腐病、脚腐病等侵染性病害和周期性冻害，以及排水不良引起的湿害等非侵染性病害。尽管采取了一些相关的防治措施，但见效甚微，病害依然肆意，严重威胁其柑橘产业健康发展。

后浙江大学李红叶教授团队从城固釆集发病叶片、枝梢和枝干，通过分离培养，子实体的形态学和分子特征研究，以及致病性测定，确定病菌的分类地位，同时对病菌的生物学特性进行了研究。发现，个别症状严重的果园内叶片发病率可达100％。该病害只在晚冬和早春的时候流行。发病初期叶片上出现轮纹状的圆形病斑，具轮纹，将其称之为“轮斑病”(targetspot)。

据文献记载，甜橘生长期具明显危害的真菌性病害已多达35种。这些已报道的真菌性病害一般都在温暖湿润的季节发生，侵染多种柑橘品种的叶片、枝干和果实。与众不同的是，柑橘轮斑病属于低温型病害，在冬末春初发病最重，高温季节一般不发病。其在12月中旬开始出现症状，并逐渐加重，2月下旬至3月中旬为发病高峰，病叶在3月中下旬基本落光。由于它传播快、危害程度严重、危害柑橘品种较多、防治困难，给已发病地区柑橘种植户造成巨大的经济损失，成为一种新的毁灭性病害。2018年以前，在我国仅陕南温州蜜柑种植区发现此病大面积爆发危害，且没发现危害果实。2018年在万州发现该病危害，并首次在万州发现该病也侵染果实，造成果实出现直径0.2cm-2.2cm、黑褐色凹陷斑点，最终提前落果，导致全园失收或毁园。该病除危害温州蜜柑、金柑和尤力克柠檬外，冰糖桔、宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、北京柠檬、柚等多个柑橘类型均可发病。

对苹果和梨也有潜在的侵染风险。由此，给全国柑橘产业带来巨大威胁。

柑橘轮斑病发病初期叶片上出现轮纹状的圆形病斑，叶片病斑上可产生黑色的子实体，将其划定为拟隐壳孢属，病原菌命名为柑橘拟隐球壳孢菌cryptosporiopsiscitricarpar，后被重新鉴定为一个单型属pseudofabraeacitricarpar，并建立了分子检测方法。2018年3月，浙江大学李红叶教授，陕南柑橘综合试验站站长丁德宽、奉节柑橘综合试验站站长黄涛江、西南大学植保学院博士后杨宇衡副教授、浙江大学博士肖小娥组成的专家小组，来万现场考察病害田间表现症状，结合室内病原菌鉴定结果，初步确诊为柑橘轮斑病。并对防治给予了一定的措施建议，如可以在雨季之前，先喷洒一次波尔多液，再喷洒一次苯醚甲环唑或咪鲜胺。选择在温暖、干燥的季节修剪枝条。病害严重时，移除和烧毁病枝，并且在伤口处涂漆保护。2018年以前，在我国仅陕南温州蜜柑种植区发现此病大面积爆发危害，且没发现危害果实。2018年在万州发现该病危害，并首次在万州发现该病也侵染果实，造成果实出现直径0.2cm-2.2cm、黑褐色凹陷斑点，最终提前落果，导致全园失收或毁园。据报道，该病除危害温州蜜柑、金柑和尤力克柠檬外，宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、北京柠檬、柚等多个柑橘类型均可发病。对苹果和梨也有潜在的侵染风险。由此，给全国柑橘产业带来巨大潜在威胁。

柑橘轮斑病发病初期叶片上出现轮纹状的圆形病斑，病斑上可产生黑色的子实体。从受害叶片、嫩梢和枝干上可不断地分离得到拟隐壳孢属的一种真菌。通过在温州蜜柑的叶片上接种该菌的分生孢子悬浮液，完成科赫氏法则。基于构建系统进化树，显示该病原菌属于拟隐壳孢属有性型：明孢盘菌属，皮生科；分别基于lsu、its、ssu、tub基因构建系统进化树，显示分离得到的病原菌菌株单独聚成一个分枝。通过形态学的进一步鉴定，病原菌与拟隐壳孢属已报道的真菌都不尽一致，推测其可能为拟隐壳孢属的一个新种。将其命名为柑橘拟隐球壳孢菌cryptosporiopsiscitricarpar(lizhu,etal.,2011)，并对防治给予了一定的建议(朱丽,2012)。之后yang等人建立了柑橘拟隐球壳孢菌scar快速诊断法(yuhengyang,etal.,2018)。

柑橘轮斑病作为近几年在柑橘上新出现的一种病害，目前仅在陕西城固和重庆万州有报道，且仅仅针对其危害症状、病菌分离和分子鉴定有极少量的研究，万州的柠檬(citruslimon(l.)burm.f.)轮斑病还处于泛滥和无法有效防控的状态，人们对该病菌认识缺乏，危害情况、发病规律均无报道，绿色防控技术更少有研究。由于柑橘轮斑病具有传播途径广、速度快、危害大和防控难等特点，防控不当和不及时，可能导致轮斑病迅速蔓延，对全国柑橘产业都将造成重大影响。因此，急需进行柑橘轮斑病危害情况普查，开展发病规律及绿色防控技术研究和应用。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前对柑橘轮斑病还处于泛滥和无法有效防控的状态，人们对该病菌认识缺乏，危害情况、发病规律、室内抗性鉴定方法等均无报道，绿色防控技术更少有研究。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法。

本发明是这样实现的，一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，所述柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括以下步骤：

步骤一，全面系统调查全区柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律：轮斑病在万州柠檬上的发病面积9000亩，占柠檬种植面积的十分之一，危害程度重，造成树势衰弱，枯枝落叶，发病区域果实发病率100％。

调查柑橘轮斑病发病规律:柑橘轮斑病是柑橘产区出现的一种新的真菌类、低温性病害，危害柑橘叶片、枝梢、果实，一般于12月份开始出现症状，然后逐渐加重，到第二年2月份时达到顶峰，并开始陆续落叶，最后枝干干枯，造成严重落果，甚至整株枯死，给当地果农造成巨大的经济损失。当年新生叶片12月份前一般观察不到任何症状。

被调查的不同海拔的果园均有轮斑病发生，包括温州蜜柑、金橘、柠檬、宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、柚等多个柑橘类型均可发病。相比较而言，地势较低、郁闭潮湿、高海拔的果园发病较通风透气、有一定坡度、低海拔地区的果园严重；

步骤二，对万州柑橘(柠檬)轮斑病病原进行分离鉴定：观察菌落、分生孢子和分生孢子梗形态，分离菌株80个。在pda培养基，20℃环境下生长15天后，菌落致密，初期白色至灰色，后逐渐变蓝黑色，气生菌丝丰富，白色棉絮状，培养基背面奶黄色，并伴有黑褐色小点。显微镜观察分生孢子椭圆形、长椭圆形，向一侧略弯，顶端钝圆，基部略呈圆锥状，有明显的油球。培养基上不产生厚垣抱子和刚毛。培养2个月后，培养基表面或底部可产生黑色的菌核。

步骤三，对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定方法研究：叶片针刺10针接种直径5mm新鲜菌丝块，10℃环境下保湿培养13-16天，可明显观察到发病病斑；

步骤四，开展柑橘轮斑病遗传多样性分析和扩散流行风险性分析：万州自2018年12月中旬在柑橘上仅看见零星病斑后，2019年1-2月就突然出现大量落叶后枝干干枯现象，并造成大量落果，病情发展非常迅速(见图3-图5)。且该病菌能侵染部分柑橘枝干的木质部并造成大量枯枝(一般柑橘病原真菌只侵染叶、果等表皮组织，不危害枝干)，说明该病菌的致病力极强，病菌孢子容易随人为因素(果实销售或人为携带)和自然因素(气流、雨水等)等方式远距离、大面积传播，且该病菌除可侵染柑橘外，也可侵染红桔、脐橙和杂柑类等多种柑橘品种。该病扩散流行风险性极大，容易造成大面积为害损失，严重威胁全市柑橘产业发展安全。

步骤五，进行轮斑病防治药剂的筛选试验：咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑对柑橘轮斑病都有一定防效。咪鲜胺+矿物油复配，与多菌灵轮换使用，补充锌元素肥料，柑橘轮斑病防效达81.6％，单纯使用4次咪鲜胺防效达70.2％，苯醚甲环唑+矿物油防效64.7％。

步骤六，创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术。根据田间药效防治试验结果，建立10月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+0.3％硫酸锌，11月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+97％矿物油150-200倍液，12月初用25％多菌灵可湿性粉剂500倍+97％矿物油150-200倍液，1月初用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液喷施的用药方案，防效可达81.6％。结合实施冬季清园、清除落果和病残枝、做好果园排水、根系复壮，及时剪除病部，搞好树冠修剪和微生态改良，实施营养诊断配方施肥增强树势，果实及时套袋，建立一整套柑橘(柠檬)轮斑病绿色防控集成技术，发病率下降到20％，减少产量损失2000kg/亩，扣除防治成本，增加经济效益1500元/亩。

进一步，步骤一中，所述全面系统对柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律进行调查，包括：

对柑橘轮斑病发生情况进行全面调查，初步摸清柑橘轮斑病发生情况和发病规律，包括发病面积、发病品种、发病率，以及发病与海拔、品种和管理的关系；其中，所述病害发生规律的确定，包括：

(1)调查柑橘轮斑病田间为害的时空分布、病状表现和病原越冬越夏病害侵染循环，初步明确田间发病流行规律；

(2)借助田间小气候观测仪，了解气候与病害发生的关系，确定最佳防治时期，指导田间防控。

进一步，步骤二中，所述对万州柠檬轮斑病病原进行分离鉴定，包括：

(1)现场考察柠檬轮斑病田间症状，发病初期叶片正面出现针头大小的红褐色小点，后病斑扩大呈圆形、椭圆形，直径1-13毫米，在叶脉处有拖尾，病斑边缘油渍状，发病后期叶片正面病斑中央产生呈轮纹状分布的黑色子实体。病斑散生，有时2-3个病斑可愈合成大斑。枝梢发病初期病斑呈红褐色小点，略微四陷；病斑逐渐扩大成圆形、椭圆形或梭形，褐色，木质部也变褐，后枝条逐渐萎蔫枯死。果实受害后病斑1-22毫米，2-3个病斑可愈合成大斑，病斑深褐色，深度凹陷，病斑不扩展到果肉，病斑中间后期会产生轮纹状排列的黑色子实体(图3-图6)。

(2)采集疑似轮斑病的叶片、枝条和果实，进行室内病原菌分离，在pda培养基上，通过组织培养法培养，用75％酒精消毒1分钟，然后用1％次氯酸钠消毒30秒，灭菌超纯水冲洗3次，晾干，放入pda培养基中，20℃培养7-14天即可获得目的菌落。如果病斑上有明显的子实体，则先用灭菌蒸馏水清洗叶病斑表面，然后用手术刀或针刮取病斑表面的子实体，用灭菌蒸馏水稀释后，用移液枪移至pda上，20℃培养7-14天，待长出单个菌落后，挑取单个菌落至新鲜pda培养基纯化培养(图7)。经显微镜观察分生孢子及分生孢子梗特点后，初步诊断为柑橘轮斑病，并在pda斜面培养，保存于4℃备用。

(3)在分子鉴定方面，开展快速诊断技术研究，设计特异性引物，建立稳定的分子鉴定技术，可以在室内快速检测柑橘轮斑病(图8)。

进一步，步骤三中，柑橘轮斑病室内抗性鉴定接种方法研究试验：选取健康、平整的柠檬叶片，灭菌蒸馏水冲洗干净，超净工作台晾干，灭菌棉花蘸取灭菌蒸馏水，保果叶柄保湿，用直径5毫米的打孔器切取新鲜柑橘轮斑病菌落边缘部分，将有菌丝的一面紧贴叶片叶脉中部左右两侧对称位置，共接种15片叶30个点，并分别在0℃、5℃、10℃、15℃和20℃的环境下保湿培养，持续观察发病情况。试验设置4个处理。处理1：在叶脉正面两侧，直径5毫米范围内，各用灭菌大头针进行针刺10针(不穿透)，再接种直径5毫米新鲜菌丝块；处理2：在叶脉背面两侧，同样方法针刺后，再接种直径5毫米新鲜菌丝块；处理3：在叶脉正面两侧，不针刺，直接接种直径5毫米新鲜菌丝块；处理4：在叶脉背面两侧，不针刺，直接接种直径5毫米新鲜菌丝块。

结合不同温度的处理，共20组试验，每组试验重复3次。持续跟踪观察记录叶片病斑直径大小，筛选接种后，叶片发病最好的接种方法。

表2各处理针刺方式

进一步，步骤四中，所述开展柑橘轮斑病遗传多样性分析，包括：

(1)采集并分离来源于不同地区的柑橘轮斑病菌菌株，对来源于不同地区的不同柑橘轮斑病菌间的形态特征、生长速率以及致病力进行差异分析；

(2)通过对柑橘轮斑病菌的菌落形态、菌核分布的观察统计，生长速率及菌核产量测定，以及分子多态性分析方法，系统研究柑橘轮斑病菌的群体结构多样性。

进一步，步骤四中，所述柑橘轮斑病扩散流行风险性分析包括：发病时期、发病严重程度以及传播风险。

进一步，步骤四中，所述开展柑橘轮斑病扩散流行风险性分析，包括：

(1)针对柑橘轮斑病病害的发生危害特点，借鉴有害生物风险分析理论，按照有害生物风险分析程序，形成以有害生物风险分析理论为基础进行研究，以多指标评价综合评价方法，建立多层次多指标的柑橘轮斑病风险评估体系；

(2)通过对已发生该病的区域开展系统的调查研究，对柑橘轮斑病的病害风险进行定性分析及多指标评价因子的定量分析，最终计算出病害风险性r值，明确柑橘轮斑病可能的流行风险等级；

(3)将柑橘轮斑病菌生存的环境因子作为变量，分析环境因子与柑橘轮斑病现有分布区的关系，运用maxent3.3.3软件分析柑橘轮斑病发生环境条件，确立柑橘轮斑病在我国可能的分布区，并运用arcgis9.3地理信息系统软件分析，预测柑橘轮斑病的适生区。

进一步，步骤五中，所述药效筛选试验，对不同药剂防治效果进行评价，筛选出对柑橘轮斑病有效的防治药剂，包括：

初步选择25％苯醚甲环唑乳油(山东东泰农化有限公司)，97％矿物油(上海沪联生物药业(夏邑)股份有限公司)，80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液(利民化工股份有限公司)，25％多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)，25％咪鲜胺乳油(山东华阳农药化工集团)，硫酸锌(四川国光农化股份有限公司)作为试验药品，开展田间药效筛选试验，对不同药剂防治效果进行评价，筛选出对柑橘轮斑病有效的防治药剂。

2019年，选择万州区白羊镇双石村轮斑病重发区，柠檬树龄6年，长势一致，试验设置6个处理，每个处理重复3次，共计18个小区，每个小区5株树，小区随机区组排列，小区间及试验田四周设有保护行。采用电动喷雾器喷雾，先喷清水对照，然后喷试验药剂。喷施药剂时按照浓度由低到高的顺序进行，换药前清洗干净喷雾器。于2020年3月25日调查防效，dps软件处理数据。每树分东南西北4个方位,随机调查2个枝条全部叶片以及5个果实，调查叶片和果实上病斑情况，计算病情指数。

病情分级标准：0级：无病；1级：每叶(果)1～5个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积5％以下；3级：每叶(果)6～10个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积6％～10％；5级：每叶(果)11～15个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积11％～25％；7级：每叶(果)16～20个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积26％～50％；9级：每叶(果)21个病斑以上或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积51％以上。

病情指数＝〔∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)〕×100；防治效果(％)＝〔(空白对照区病情指数-处理区病情指数)/空白对照区病情指数〕×100。

表6柑橘轮斑病田间药效筛选试验不同处理

进一步，步骤六中，所述创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术，包括：

根据柑橘轮斑病发生情况和发病规律调查结果以及药效筛选情况，综合柑橘病虫害农业防治技术，创新建立一套柑橘轮斑病的绿色防控集成技术。

进一步，所述柑橘病虫害农业防治技术，包括：

(1)实施冬季清园、清除落果和病残枝措施：加强枯枝及病枝病叶修剪，摘掉病果，病枝、病叶和病果集中销毁，降低病原菌基数；深翻改土，增施有机肥，及时排水及进行抗冻锻炼或者防冻措施，增强树势，减轻发病；

(2)根据果园排水和根系复壮、树冠修剪和微生态改良、配方施肥和增强树势，果实套袋的对防病减损的效应，筛选出辅助于化学防治的有效防控技术。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：我国是世界柑橘重要起源中心，已发展成为世界第一大柑橘产业基地。重庆是我国最适宜栽培柑橘的地区之一，全市40个区(市、县)中有31个区(市、县)种植柑橘。特别是2004年重庆市提出，大力发展优势晚熟特色柑橘产业，不与两广争早，不与赣-湘争中，大力发展晚熟优质柑橘。截至2017年底，重庆市柑橘种植面积达到320万亩，产量突破300万吨，总产值达280亿元，其中晚熟柑橘接近100亿元(杨蕾，2018)。

全市大力发展晚熟柑橘的同时，三峡库区高温高湿的气候特点以及规模化发展引起的群体效应，使得部分病虫害频发，尤其是溃疡病、黄脉病、轮斑病等，来势汹涌，危害严重，造成产量巨大损失，严重的全园砍树，颗粒无收。柑橘轮斑病作为新病害，传播途径广、速度快、危害大，防控难。且人们对该病菌认识缺乏，仅仅针对其危害症状、病菌分离和分子鉴定有极少量的研究，具体危害情况、发病规律认识较少，绿色防控技术更少有研究。该病除危害温州蜜柑、金柑和尤力克柠檬外，宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、北京柠檬、柚等多个柑橘类型均可发病，重庆这些感病品种的种植面积达300万亩，柑橘轮斑病对苹果和梨也有潜在的侵染风险。如果防控不当和不及时，可能导致轮斑病迅速蔓延，对我市乃至全国柑橘产业都将造成重大影响。因此，急需进行柑橘轮斑病危害情况调查，开展发病规律及防控技术研究和应用。

本发明提供的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，分离鉴定了万州柑橘轮斑病病原，研究了室内柑橘轮斑病室内人工接种进行抗性鉴定的最佳条件，初步摸清其发病特点和规律，筛选有效防控药剂，初步建立一套绿色防控技术体系，能快速鉴定不同柑橘品种对轮斑病的抗性，有效降低发病率，提高产量和效益，降低环境污染，为全区柑橘安全生产提供技术方案，研究结果对其他柑橘品种和产区轮斑病防治同样具有参考价值。

本发明的社会经济效益如下：(1)经济效益研究的用药方案：

防效可达81.6％，结合实施冬季清园、清除落果和病残枝、修剪和营养补充，果实及时套袋，建立一整套柑橘(柠檬)轮斑病绿色防控集成技术，发病率下降到20％，减少产量损失2000kg/亩，扣除防治成本，增加经济效益1500元/亩。

(2)社会效益

通过项目实施，初步确定万州柑橘轮斑病的发生情况和病害流行规律，筛选出有效的药剂，初步建立一套有效防控柑橘轮斑病的技术体系，对有效控制减轻柑橘轮斑病发生面积和危害程度具有重要理论意义和实践意义，为轮斑病深入研究奠定基础，为周边柑橘轮斑病预防提供技术参考。

(3)生态效益

整个项目实施中，防控措施的探索建立，包括肥料以有机肥、农家肥为主，控制化肥施用；增加防冻措施，增强树势；减少化学农药投入，使用可降解低残留药品，不用国家明令禁止使用的农药等措施，做到绿色生态无污染，有效降低生产措施对环境的影响，同时恢复柑橘树势和果农种植信心，有效巩固长江沿岸森林覆盖率，具有显著的生态效益。

相比于现有技术，本发明公开了一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，所述柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括：全面系统对柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律进行调查；对万州柑橘轮斑病病原进行分离鉴定；设置试验组：分别在0℃、5℃、10℃、15℃和20℃的环境下，对感染有柠檬轮斑病的柠檬叶片正面或背面进行针刺处理，叶片正面或背面不针刺处理作为对照，验证室内接种发病最适宜的条件；开展柑橘轮斑病扩散流行风险性分析和遗传多样性分析；利用已经分离的菌种进行轮斑病防治药剂的筛选试验；创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术。初步摸清其发病特点和规律，建立了10度环境下，叶片进行背面针刺10针的室内接种抗性鉴定方法，接种后13天左右即可观察到较好病斑，评估了轮斑病扩散流行风险，筛选有效防控药剂，初步建立一套绿色防控技术体系，能快速鉴定不同柑橘品种对轮斑病的抗性，有效降低发病率，提高产量和效益，降低环境污染，为全区柑橘安全生产提供技术方案，研究结果对其他柑橘品种和产区轮斑病防治同样具有参考价值，经济效益、社会效益和生态效益显著。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法流程图。

图2是本发明实施例提供的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法技术路线图。

图3是本发明实施例提供的柑橘受轮斑病危害症状示意图。

图4是本发明实施例提供的柑橘受轮斑病危害落叶示意图。

图5(a)是本发明实施例提供的柑橘叶片受轮斑病危害症状示意图。

图5(b)是本发明实施例提供的柑橘(柠檬)果实受轮斑病危害症状示意图。

图5(c)是本发明实施例提供的柑橘枝梢受轮斑病危害症状示意图。

图6(a)和图6(b)是本发明实施例提供的柑橘轮斑病叶片病斑示意图。

图6(c)是本发明实施例提供的柑橘轮斑病果实病斑示意图。

图6(d)是本发明实施例提供的柑橘轮斑病枝梢病斑示意图。

图7(a)是本发明实施例提供的柑橘轮斑病正面菌落形态示意图。

图7(b)是本发明实施例提供的柑橘轮斑病背面菌落形态示意图。

图8是本发明实施例提供的柑橘轮斑病pcr鉴定结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。如图1所示，本发明实施例提供的柑橘轮斑病快速抗性鉴定方法包括以下步骤：

s101，全面系统调查全区柑橘轮斑病发生危害情况和发病规律：轮斑病在万州柠檬上的发病面积9000亩，占柠檬种植面积的十分之一，危害程度重，造成树势衰弱，枯枝落叶，发病区域果实发病率100％。

调查柑橘轮斑病发病规律:柑橘轮斑病是柑橘产区出现的一种新的真菌类、低温性病害，危害柑橘叶片、枝梢、果实，一般于12月份开始出现症状，然后逐渐加重，到第二年2月份时达到顶峰，并开始陆续落叶，最后枝干干枯，造成严重落果，甚至整株枯死，给当地果农造成巨大的经济损失。当年新生叶片12月份前一般观察不到任何症状。

被调查的不同海拔的果园均有轮斑病发生，包括温州蜜柑、金橘、柠檬、宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、柚等多个柑橘类型均可发病。相比较而言，地势较低、郁闭潮湿、高海拔的果园发病较通风透气、有一定坡度、低海拔地区的果园严重；

s102，对万州柑橘(柠檬)轮斑病病原进行分离鉴定：观察菌落、分生孢子和分生孢子梗形态，分离菌株80个。在pda培养基，20℃环境下生长15天后，菌落致密，初期白色至灰色，后逐渐变蓝黑色，气生菌丝丰富，白色棉絮状，培养基背面奶黄色，并伴有黑褐色小点。显微镜观察分生孢子椭圆形、长椭圆形，向一侧略弯，顶端钝圆，基部略呈圆锥状，有明显的油球。培养基上不产生厚垣抱子和刚毛。培养2个月后，培养基表面或底部可产生黑色的菌核。

s103，对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定方法研究：叶片背面针刺10针接种直径5mm新鲜菌丝块，10℃环境下保湿培养12-15天，可明显观察到发病症状；

s104，开展柑橘轮斑病遗传多样性分析和扩散流行风险性分析：万州自2018年12月中旬在柑橘上仅看见零星病斑后，2019年1-2月就突然出现大量落叶后枝干干枯现象，并造成大量落果，病情发展非常迅速(见图3-图5)。且该病菌能侵染部分柑橘枝干的木质部并造成大量枯枝(一般柑橘病原真菌只侵染叶、果等表皮组织，不危害枝干)，说明该病菌的致病力极强，病菌孢子容易随人为因素(果实销售或人为携带)和自然因素(气流、雨水等)等方式远距离、大面积传播，且该病菌除可侵染柑橘外，也可侵染红桔、脐橙和杂柑类等多种柑橘品种。该病扩散流行风险性极大，容易造成大面积为害损失，严重威胁全市柑橘产业发展安全。

s105，进行轮斑病防治药剂的筛选试验：咪鲜胺、多菌灵、苯醚甲环唑对柑橘轮斑病都有一定防效。咪鲜胺+矿物油复配，与多菌灵轮换使用，补充硫酸锌，柑橘轮斑病防效达81.6％，单纯使用4次咪鲜胺防效达70.2％，苯醚甲环唑+矿物油防效64.7％。

s106，创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术。根据田间药效防治试验结果，建立10月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+0.3％硫酸锌，11月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+97％矿物油150-200倍液，12月初用25％多菌灵可湿性粉剂500倍+97％矿物油150-200倍液，1月初用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液喷施的用药方案，防效可达81.6％。结合实施冬季清园、清除落果和病残枝、做好果园排水、根系复壮，及时剪除病部，搞好树冠修剪和微生态改良，实施营养诊断配方施肥增强树势，果实及时套袋，建立一整套柑橘(柠檬)轮斑病绿色防控集成技术，发病率下降到20％，减少产量损失2000kg/亩，扣除防治成本，增加经济效益1500元/亩。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1

1、发明内容

1.1发明思路

目前生产上，全国柑橘产区中，陕西城固、重庆万州和湖北宜昌等地均陆续出现柑橘轮斑病。此病一旦爆发，就是毁灭性的，会危害枝稍、果实、叶片，并且深入木质部，造成毁灭性打击，难以补救。目前万州柑橘上发病面积已达十分之一，并且危害程度严重，受到危害后常常导致果园绝收甚至死树。而针对此病尚未开展系统研究，受害果园还处于无能为力的状态。基于此，结合现有研究基础，开展柑橘轮斑病危害情况和发病规律调查，筛选有效的防治药剂，创新建立一套绿色防控技术并应用到柑橘生产实际中，对全国柑橘轮斑病防控技术水平提升均具有重要意义。

1.2发明路径(见图2)

1.3发明方案

针对柑橘轮斑病发生情况开展调查和分析，摸清其发病情况和发生规律，并针对性开展药效试验，筛选出有效的防治药剂，创新建立一套柑橘轮斑病的绿色防控集成技术，建立示范基地200亩，在周边辐射推广500-1000亩。具体如下：

(1)柑橘轮斑病发生情况和发病规律调查。对柑橘轮斑病发生情况进行全面调查，初步摸清柑橘轮斑病发生情况和发病规律，包括发病面积、发病品种、发病率，以及发病与海拔、品种、管理等的关系。

(2)病原分离鉴定。

(3)对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定方法研究。

(4)开展柑橘轮斑病遗传多样性分析和扩散流行风险性分析。

(5)药效筛选试验。针对生产上一些常用药剂，利用已经分离的菌种，进行药效筛选，对不同药剂防治效果进行评价，筛选出对柑橘轮斑病有效的防治药剂。

(6)创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术。根据以上研究结果，综合柑橘病虫害农业防治技术，创新建立一套柑橘轮斑病的绿色防控集成技术，建立示范基地200亩，在周边辐射推广500-1000亩。

2、推广应用方案

成果的推广应用是本项目的研究内容之一，也是创新之一。通过项目研究，选取试验中筛选出来的最优药剂，创新建立一套柑橘轮斑病的绿色防控集成技术。

(1)联合技术推广部门，通过前期已经建立的“协会+专家+社会化服务+基地”高效推广模式，在柑橘轮斑病高发区建立示范基地200亩，同时在周边辐射推广500-1000亩。

(2)制作柑橘轮斑病识别与防治宣传手册和视频，发送至各轮斑病发生区业主、合作社和农民手中，并组织技术培训2-3次共200人。

3、创新点

(1)首次全面系统对柑橘轮斑病发病规律进行全面调查；

(2)对轮斑病防治药剂进行筛选；

(3)创新建立柑橘轮斑病绿色防控集成技术。

4、与本发明相关的前期技术研发工作基础

4.1对万州区柑橘轮斑病发生危害情况开展了初步调查

(1)症状明显。2019年3月-2020年4月，项目组在万州柑橘轮斑病严重发生区域开展了实地调查，结果显示感染此病的柑橘(柠檬)叶片和枝干有典型的柑橘轮斑病症状，室内体式显微镜观察，子实体呈轮纹状排列，造成大量落叶及枯枝(见图3-图4)。

(2)果实染病。首次发现柑橘轮斑病危害柑橘(柠檬)果实，造成柑橘果实有严重的斑点，最后黄化落果。受害重的柑橘(柠檬)树几乎无花无果，少量挂果也干枯易落，危害损失严重(见图3-图4)。

(3)发病面积大。目前万州种植柠檬10万亩，发病面积9000亩，树叶基本掉光、出现大量枯枝(见表1)。

表12019年重庆万州柑橘轮斑病发病面积统计表

4.2调查柑橘轮斑病发病规律

对柑橘轮斑病发生情况进行全面调查，初步摸清柑橘轮斑病发生情况和发病规律，包括发病面积、发病品种、发病率，以及发病与海拔、品种和管理的关系；其中，所述病害发生规律的确定，包括：

(1)调查柑橘轮斑病田间为害的时空分布、病状表现和病原越冬越夏病害侵染循环，初步明确田间发病流行规律；

(2)借助田间小气候观测仪，了解气候与病害发生的关系，确定最佳防治时期，指导田间防控。

结果：柑橘轮斑病一般于12月份开始出现症状，然后逐渐加重，到第二年2月份时达到顶峰，并开始陆续落叶，许多发病植株叶片所剩无几，并整株枯死。当年新生叶片12月份前一般观察不到任何症状。

被调查的不同海拔的果园均有轮斑病发生，包括温州蜜柑、金橘、柠檬、宽皮柑橘(朱红桔、椪柑、杂柑等)、脐橙、柚等多个柑橘类型均可发病。相比较而言，地势较低、郁闭潮湿、高海拔的果园发病较通风透气、有一定坡度、低海拔地区的果园严重；

4.3对万州轮斑病病原进行了分离鉴定

与国家现代柑橘产业技术体系岗位科学家、浙江大学李红叶教授，陕南柑橘综合试验站站长丁德宽、奉节柑橘综合试验站站长黄涛江、西南大学植保学院博士后杨宇衡副教授、浙江大学博士肖小娥组成的专家小组，现场考察柑橘病害田间表现症状，并进行了室内病原菌鉴定。

(1)现场考察柠檬轮斑病田间症状，发病初期叶片正面出现针头大小的红褐色小点，后病斑扩大呈圆形、椭圆形，直径1-13毫米，在叶脉处有拖尾，病斑边缘油渍状，发病后期叶片正面病斑中央产生呈轮纹状分布的黑色子实体。病斑散生，有时2-3个病斑可愈合成大斑。枝梢发病初期病斑呈红褐色小点，略微四陷；病斑逐渐扩大成圆形、椭圆形或梭形，褐色，木质部也变褐，后枝条逐渐萎蔫枯死。果实受害后病斑1-22毫米，2-3个病斑可愈合成大斑，病斑深褐色，深度凹陷，病斑不扩展到果肉，病斑中间后期会产生轮纹状排列的黑色子实体(图3-图6)。

(2)采集疑似轮斑病的叶片、枝条和果实，进行室内病原菌分离，在pda培养基上，通过组织培养法培养，用75％酒精消毒1分钟，然后用1％次氯酸钠消毒30秒，灭菌超纯水冲洗3次，晾干，放入pda培养基中，20℃培养7-14天即可获得目的菌落。如果病斑上有明显的子实体，则先用灭菌蒸馏水清洗叶病斑表面，然后用手术刀或针刮取病斑表面的子实体，用灭菌蒸馏水稀释后，用移液枪移至pda上，20℃培养7-14天，待长出单个菌落后，挑取单个菌落至新鲜pda培养基纯化培养(图7)。经显微镜观察分生孢子及分生孢子梗特点后，初步诊断为柑橘轮斑病，并在pda斜面培养，保存于4℃备用。

(3)在分子鉴定方面，开展快速诊断技术研究，设计特异性引物，建立稳定的分子鉴定技术，可以在室内快速检测柑橘轮斑病(图8)。

通过田间观察发病症状，室内观察菌落、分生孢子和分生孢子梗形态，初步确诊为柑橘轮斑病(见图6-图8)。在pda培养基生长15天后，菌落致密，初期白色至灰色，后逐渐变蓝黑色，气生菌丝丰富，白色棉絮状，培养基背面奶黄色，并伴有黑褐色小点。显微镜观察分生孢子椭圆形、长椭圆形，向一侧略弯，顶端钝圆，基部略呈圆锥状，有明显的油球。培养基上不产生厚垣抱子和刚毛。培养2个月后，培养基表面或底部可产生黑色的菌核。

分离保存了不同品种的柑橘轮斑病菌种80余个。病菌来源于温州蜜柑、金柑、柠檬和脐橙的枝条、叶片和果实。在分子鉴定方面，与西南大学合作，开展了快速诊断技术研究，已取得初步结果，建立了稳定的分子鉴定技术(见图8)。

4.4对柑橘轮斑病进行室内抗性鉴定方法研究

选取健康、平整的柠檬叶片，灭菌蒸馏水冲洗干净，超净工作台晾干，灭菌棉花蘸取灭菌蒸馏水，保果叶柄保湿，用直径5毫米的打孔器切取新鲜柑橘轮斑病菌落边缘部分，将有菌丝的一面紧贴叶片叶脉中部左右两侧对称位置，接种15片叶30个点，并分别在0℃、5℃、10℃、15℃和20℃的环境下保湿培养，持续观察发病情况。试验设置4个处理。处理1：在叶脉正面两侧，直径5毫米范围内，各用灭菌大头针进行针刺10针(不穿透)，再接种直径5毫米新鲜菌丝块；处理2：在叶脉背面两侧，同样方法针刺后，再接种直径5毫米新鲜菌丝块；处理3：在叶脉正面两侧，不针刺，直接接种直径5毫米新鲜菌丝块；处理4：在叶脉背面两侧，不针刺，直接接种直径5毫米新鲜菌丝块。

结合不同温度的处理，共20组试验，每组试验重复3次。持续跟踪观察记录试验结果，筛选接种后，叶片发病最好的接种方法。

表2各处理针刺方式

调查结果如下：

表3柑橘轮斑病室内接种发病情况调查表

表4不同处理调查数据f检验

对调查的数据进行f检验，发现在接种后的四次调查中，5℃、10℃、15℃、20℃四个温度处理之间差异不显著，而不同的接种方式如正面针刺、反面针刺、正面不针刺、反面不针刺四种处理的差异极显著。因此，对不同接种方式开展lsd多重比较分析。结果如下：

表5不同接种方式病斑直径的多重比较

注：表中数据为同一处理不同温度的80个数据的平均值。

结果显示，正面针刺和背面针刺差异不显著，但和不针刺差异极显著。说明，在接种轮斑病时，要采用针刺接种办法，发病更明显。

综上，根据不同处理实验调查结果显示，轮斑病室内快速接种柑橘叶片进行抗性鉴定试验时，应选用正面或背面针刺10针，在10-20℃环境下，最好是10℃为最优，保湿培养11天以上，可以选择13天-16天，可以观察到很好的发病病斑，可以作为轮斑病在室内接种进行不同柑橘品种进行抗性鉴定试验的方法。

4.5药效筛选试验

选用生产上一些常用药剂，开展药剂筛选，建立药剂筛选模型：

2019年，选择万州区白羊镇双石村轮斑病重发区，柠檬树龄6年，长势一致，试验设置6个处理，每个处理重复3次，共计18个小区，每个小区5株树，小区随机区组排列，小区间及试验田四周设有保护行。采用电动喷雾器喷雾，先喷清水对照，然后喷试验药剂。喷施药剂时按照浓度由低到高的顺序进行，换药前清洗干净喷雾器。于2020年3月25日调查防效，dps软件处理数据。每树分东南西北4个方位,随机调查2个枝条全部叶片以及5个果实，调查叶片和果实上病斑情况，计算病情指数。

病情分级标准：0级：无病；1级：每叶(果)1～5个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积5％以下；3级：每叶(果)6～10个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积6％～10％；5级：每叶(果)11～15个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积11％～25％；7级：每叶(果)16～20个病斑或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积26％～50％；9级：每叶(果)21个病斑以上或每叶(果)病斑面积占叶(果)面积51％以上。

病情指数＝〔∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)〕×100；防治效果(％)＝〔(空白对照区病情指数-处理区病情指数)/空白对照区病情指数〕×100。

试验药品：25％苯醚甲环唑乳油(山东东泰农化有限公司)，97％矿物油(上海沪联生物药业(夏邑)股份有限公司)，80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液(利民化工股份有限公司)，25％多菌灵可湿性粉剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)，25％咪鲜胺乳油(山东华阳农药化工集团)，硫酸锌(四川国光农化股份有限公司)。

表6柑橘轮斑病田间药效筛选试验不同处理

表7不同药剂处理对柑橘轮斑病田间防效调查数据

叶片、果实病情调查在2020年3月25日进行,这时叶片果实病情已经稳定,轮斑病症状明显,对树势和果实外观品质的影响容易判断。由调查数据可知,试验所选用的药剂对柑橘轮斑病均有一定防效，表现为处理3>处理5>处理1>处理2>处理4>处理6，其中以咪鲜胺和苯醚甲环唑2种药剂在10月12日、11月15日、12月6日、1月7日连续喷雾4次表现较好防治效果,其中以处理3的咪鲜胺和矿物油复配，与多菌灵轮换使用的效果最佳,其防效达81.6％,极显著高于其他处理，处理5用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液的防效其次；处理2用25％苯醚甲环唑乳油防效为54.1％，处理1用同样的药剂复配矿物油，防效提升近10％，达到64.7％；处理4用80％代森锰锌可湿性粉剂800倍液处理防效最低。以上结果说明，10月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+0.3％硫酸锌，11月中旬用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液+97％矿物油150-200倍液，12月初用25％多菌灵可湿性粉剂500倍+97％矿物油150-200倍液，1月初用25％咪鲜胺乳油2000-3000倍液喷施树冠，防效可达81.6％，是理想方案。因此，在柑橘轮斑病的防控中，首先要使用防效好的药剂，其次可搭配矿物油或植物油等助剂类药物，还要注意药剂轮换使用和营养的补充，方可达到较好的防治效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。