一种细胞植冰冻存方法及装置

本发明涉及细胞冻存技术领域，特别涉及一种细胞植冰冻存方法及装置。

背景技术：

低温保存是实验室和样本库保存细胞和组织的常规操作，但是细胞和组织在降温过程中常常会发生损伤。而造成细胞和组织损伤的主要因素有冷冻保护剂的毒性损伤和冷冻过程中胞内冰形成的胞内冰损伤。

其中，关于胞内冰损伤的原因在于：程序冷冻过程中，溶液温度低于共晶温度但仍然没有结晶时，则造成细胞溶液过冷，过冷度较大的时候会突然成核，进而造成细胞大冰晶损伤。

解决胞内冰损伤的一个关键是在细胞溶液共晶点附近恒温一定时间，然后通过加入冰核、用冷冻的金属触碰冻存管外壁、施加超声波等方法进行植冰，使胞外溶液首先形成共晶体，共晶体在该温度下生长过程中，优先结晶稀溶液，造成未冻保护液浓度的上升，而由于渗透压的作用，细胞逐渐脱水，从而可以防止/减少胞内冰的形成，避免胞内冰损伤。

但是，现有技术中，在植冰操作过程中植冰是一次性进行的，因此无法确定植冰是否成功，从而使细胞出现脱水过度或者脱水不足的现象，进而影响细胞活性。

技术实现要素：

针对现有技术存在的细胞植冰冻存过程中无法有效确定植冰成败以及效果的问题，本发明的目的在于提供一种细胞植冰冻存方法及装置。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，本发明提供一种细胞植冰冻存方法，所述方法包括以下步骤，

s1、按照预设的降温速率，通过制冷系统对装载有待冻存细胞的冻存管进行降温，并在降温过程中对冻存管的温度进行检测；

s2、判断冻存管的温度是否达到预设的植冰温度，是则执行s3，否则继续执行s1；

s3、制冷系统在所述预设的植冰温度下对冻存管进行保温；

s4、通过超声波振子对冻存管施加超声波以进行植冰操作，并持续预设的阈值时间；

s5、通过分析植冰操作前后冻存管的温度判断冻存管是否植冰成功，是则执行s6，否则继续执行s4；

s6、通过制冷系统继续对冻存管进行降温，并在降温到预设的冻存温度后停止降温并保温。

优选的，步骤s5中，所述判断冻存管是否植冰成功的步骤包括，

s51、获取植冰操作开始前t1时段内冻存管的平均温度t1，以及获取植冰操作结束后t2时段内冻存管的平均温度t2；

s52、判断t2＞t1+2是否成立，是则判断冻存管植冰成功，否则判断为失败。

优选的，步骤s51中，t1＝t2。

优选的，步骤s51中，t1＝t2＝1s。

优选的，步骤s4中，所述预设的阈值时间为0.2s。

另一方面，本发明还提供一种细胞植冰冻存装置，包括，

制冷系统，所述制冷系统包括冷端，所述冷端设置有冷冻台，所述冷冻台上设置有冷冻槽，所述冷冻槽内设置有冻存管，其中，所述冷冻台上和/或所述冻存管内设置有测温元件；

超声波植冰系统，所述超声波植冰系统包括超声波发生器和超声波振子，所述超声波振子安装在所述冷冻台上以通过所述冷冻台向所述冻存管发射超声波；

以及控制系统，所述控制系统与所述制冷系统、所述测温元件以及所述超声波发生器电性连接。

进一步的，还包括保温层和上盖；所述保温层设置在所述冷冻台上，且所述保温层围绕所述冷冻槽布置；所述上盖覆盖在所述保温层的顶部。

优选的，所述超声波振子有多个，多个所述超声波振子形成至少两个工作频率。

优选的，所述制冷系统为斯特林制冷机。

优选的，所述控制系统包括存储有可执行程序代码的存储器以及与所述存储器耦合的处理器；其中，所述处理器调用所述存储器中存储的可执行程序代码，执行如上所述的方法。

采用上述技术方案，由于本发明提供的方法相对于现有技术增加了通过分析植冰操作前后冻存管温度并以此判断冻存管植冰是否成功的步骤，使得细胞植冰冻存的过程具有检验冻存管植冰是否成功的判断过程，进而使操作人员能够更高地掌握植冰情况，避免过度植冰或者植冰不足，从而有效地提高了细胞植冰冻存效果。

附图说明

图1为本发明一种细胞植冰冻存方法的流程图；

图2为本发明中判断植冰是否成功的方法流程图；

图3为本发明中一种细胞植冰冻存装置的结构示意图；

图4为本发明中一种细胞植冰冻存装置去除外壳后的结构示意图。

图中:1-主机体、2-冷端、3-散热风扇、4-散热翅片、5-电源及控制模块、6-外壳、7-冷冻台、8-冷冻槽、9-测温元件、10-超声波振子、11-控制系统、12-保护层、13-上盖。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示对本发明结构的说明，仅是为了便于描述本发明的简便，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

对于本技术方案中的“第一”和“第二”，仅为对相同或相似结构，或者起相似功能的对应结构的称谓区分，不是对这些结构重要性的排列，也没有排序、或比较大小、或其他含义。

另外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连接”应做广义理解，例如，连接可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个结构内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据本发明的总体思路，联系本方案上下文具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例一

一种细胞植冰冻存方法，如图1所示，该方法包括步骤s1、步骤s2、步骤s3、步骤s4和步骤s5。

步骤s1、按照预设的降温速率，通过制冷系统对装载有待冻存细胞的冻存管进行降温，并在降温过程中对冻存管的温度进行检测。

制冷系统优选配置为斯特林制冷机，其包括有冷端，而装载有待冻存细胞的冻存管则布置在该冷端处以获取冷量。另外，在冻存管上设置有测温元件，例如温度传感器的探头以检测冻存管的温度。降温速率发送给斯特林制冷机后可由斯特林制冷机上搭载的控制模块对应地通过控制占空比来控制电机的功率，以便于斯特林制冷机按照该预设的降温速率进行降温作业。

当然，在另一个实施例中制冷系统还可以配置为半导体制冷器。

步骤s2、判断冻存管的温度是否达到预设的植冰温度，是则执行步骤s3，否则继续执行步骤s1。

该步骤的实现是通过对比测量获取的冻存管的温度与预设的植冰温度的大小得到，即当测量得到的冻存管的温度等于预设的植冰温度时，执行步骤s3；而其余情况下都是大于预设的植冰温度，因此继续执行步骤s1即可。

步骤s3、制冷系统在上述预设的植冰温度下对冻存管进行保温。

步骤s4、通过超声波振子对冻存管施加超声波以进行植冰操作，并持续预设的阈值时间。

超声波振子的工作状态是由超声波发生器控制，因此本步骤中，是通过向超声波发生器发出工作指令，该工作指令通常包含工作时长和频率信息，进而使超声波振子发出相应时长和频率的超声波。而冻存管在接收到该超声波后，其内装载的细胞保护液(胞外溶液)出现共晶体，共晶体在该温度下生长的过程中，会优先结晶稀溶液，造成其余保护液的浓度上升，由于渗透压的作用，细胞会逐渐脱水，从而可以防止/减少胞内冰的形成，避免胞内冰损伤。

本实施例中，设置上述预设的阈值时间为0.2s，当然针对不同的细胞保护液也可以是其他数值。

s5、通过分析植冰操作前后冻存管的温度判断冻存管是否植冰成功，是则执行s6，否则继续执行s4；

本步骤的实现在于：当植冰成功后，溶液出现结晶而释放大量的结晶焓，从而造成溶液温度升高，即，植冰操作前后冻存管的温度发生了一定变化，通过分析该变化即可判断冻存管是否植冰成功。

例如，如图2所示，本实施例具体给出一种判断步骤：

s51、获取植冰操作开始前t1时段内冻存管的平均温度t1，以及获取植冰操作结束后t2时段内冻存管的平均温度t2；

s52、判断t2＞t1+2是否成立，是则判断冻存管植冰成功，否则判断为失败。

本实施例中，进一步优选t1＝t2＝1s，而为了降低仪器自身的误差以及制冷系统停止降温后的温度自然回升影响，本实施例具体设置了2℃的余量，即，如果检测到植冰操作后的1s内平均温度升高了2℃以上，则判断为植冰成功。

可以理解的是，如果设置t1和t2为其他的时间数值，还可以对应的调整公式t2＞t1+2中的常数“2”为其他数值，以便于更精确地判断植冰是否成功。

并且，如果判断植冰失败，则再次进行植冰操作，并获取再次植冰操作结束后1s内的平均温度t21，用t21代替上述的t2进行判断，以此类推，直至植冰成功。

步骤s6、通过制冷系统继续对冻存管进行降温，并在降温到预设的冻存温度后停止降温并保温。

实施例二

一种细胞植冰冻存装置，如图3及图4所示，包括制冷系统、超声波植冰系统和控制系统。

其中，制冷系统优选为斯特林制冷机，斯特林制冷机作为成熟产品，其包括有主机体1以及设置在主机体1上的冷端2、散热风扇3、散热翅片4以及用于供电和控制的电源及控制模块5，通常，主机体1外包围有外壳6，外壳6上开设有使电源及控制模块5露出的开口以便于操作，使用时，通过可电源及控制模块5对斯特林制冷机的降温速率，本实施例不再赘述。

本实施例中，在冷端2设置有冷冻台7，冷冻台7由导热性良好以及对超声波传导性能良好的材料制造，例如铜、铝、钛镁合金等。同时，冷冻台7上设置有冷冻槽8，冷冻槽8为开设在冷冻台7上的凹槽或者盲孔，冷冻槽8内设置有冻存管，该冻存管用于盛装待冻存的细胞或者组织，通常还会添加保护剂。另外，冷冻台7上和/或冻存管内设置有测温元件9，测温元件9用于获取盛装于冻存管内的细胞或者组织的温度，例如本实施例中，将测温元件9设置在冻存管内，或者在另一个实施例中还可以将测温元件9设置在冷冻台7上，通过测量冷冻台7的温度间接的获得冻存管的温度。本实施例配置测温元件9为温度传感器，其探头伸入到冻存管内。

其中，超声波植冰系统包括超声波发生器(图中未示出)和超声波振子10，其中超声波振子10安装在冷冻台7上以通过冷冻台7向冻存管发射超声波。本实施例中，超声波振子10安装在冷冻台7的侧壁上，并且超声波振子10发射超声波的方向正对冻存管，发出的超声波通过冷冻台7传递给冻存管。

其中，控制系统11安装在上述的外壳6上，控制系统11与制冷系统(具体是电源及控制模块5)、测温元件9以及超声波发生器电性连接，本实施例中，配置控制系统11包括触控屏和处理器，使用时通过触控屏设置制冷系统的降温速率以及超声波植冰系统的植冰温度，再由处理器控制执行。控制系统11还用于判断超声波植冰操作是否成功，例如，设置控制系统11包括存储有可执行程序代码的存储器以及与该存储器耦合的处理器；其中，该处理器调用存储器中存储的可执行程序代码，执行实施例一公开的细胞植冰冻存方法。

使用时，通过触控屏输入降温速率、植冰温度、冻存温度、超声波频率和时长、植冰判断条件并启动工作后；控制系统11将降温速率发送给斯特林制冷机，斯特林制冷机中的电源及控制模块5对应地控制其中的电机的功率，使冷端按照该降温速率降温；在降温过程中，控制系统11不断地获取冻存管的温度，并在该温度下降到该植冰温度(例如-10℃)后，控制斯特林制冷机停止降温并在该植冰温度下保温，同时向超声波发生器发送工作指令，使超声波振子按照预设的频率和时长(0.2s)工作，并在工作完成后停止；控制系统11调取冻存管在植冰操作前、后一段时间(1s)内的平均温度(t1和t2)，执行上述的植冰判断条件(t2＞t1+2)是否成立，是则判断为植冰成功，否则再继续执行一次超声波植冰操作，再进行植冰条件判断，直至判断为植冰成功；控制系统11继续控制斯特林制冷机按照预设的降温速率降温，直至达到冻存温度(例如-80℃)后停止，并在该冻存温度上进行保温，从而可以在该温度上进行长期保存，或者，也可以将冻存管转移到其它保存设备如冰箱、液氮罐等。

实施例三

其与实施例二的区别在于：本实施例中，还包括保温层12和上盖13。

其中保温层12由保温材料制造，其固定在斯特林制冷机的冷端，并围绕冷冻台7设置一周，从而对冷冻台7进行保护，防止外界温度干扰。

其中，上盖13覆盖在保温层12的顶部，其也由保温材料制造。

实施例四

其与实施例二的区别在于：设置超声波振子10有多个，例如四个，四个超声波振子10周向均匀地安装在冷冻台7的侧壁上。

另外，配置超声波振子10形成至少两个工作频率，例如相对的两个超声波振子10工作在同一频率，四个超声波振子10共工作在两个频率上。

或者，设置四个超声波振子10分别工作在不同的频率上，例如20khz、40khz、60khz、80khz，并配置功率均为50w。如此设置，使得针对不同成分的细胞冻存液可使用不同的超声波频率进行植冰，从而提高适用范围。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。