用于滇金石斛的培养基、快速繁殖方法与流程

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及滇金石斛的壮苗培养基、快速繁殖方法。


背景技术：

2.金石斛属(flickingeria)是兰科植物中的一种，本属约70种,主要分布于热带东南亚菲律宾新几内亚和大洋洲的一些群岛。我国迄今记录10种1变种,现有研究表明,金石斛属植物含有同科石斛属植物相同结构类型的菲类、联苄、酚酸和木脂素等成分。具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用。但石斛属植物生长条件苛刻，随着环境的破坏及人为掠夺性采挖，资源越来越少，有些物种已濒临灭绝的边缘。因此，兰科近缘属的金石斛属植物在临床上常替代石斛类药材使用。
3.滇金石斛flickingeria albopurpurea seidenf是金石斛属的一种，主要分布于中国云南省，生长在海拔0.8
‑
1.2km的山地疏林中的树干或林下岩石上。在驯化养护过程中，滇金石斛相对于石斛属植物苛刻的生长条件，表现出对于环境的较高的抗性和适应力，较易栽培。但作为兰科植物，滇金石斛种子和其它大部分兰科植物一样特别小，没有种胚，自然条件下萌发率低(不足5％)并且要有兰菌存在的条件下才能萌发，繁殖率极低，萌发后仍存在生根率底、存活率低、不易移植的问题，严重阻碍了滇金石斛的工业扩繁，不能很好的满足市场规模化生产的需求。因此，有必要找到一种滇金石斛无菌播种及组织培养快速繁殖的方法。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于提供一种滇金石斛的繁殖的方法，以通过滇金石斛无菌播种提高萌发率及组织培养的方法，实现滇金石斛的快速繁殖，以满足市场规模化生产的需求，使其成为石斛的优良替代。
5.本发明的其中一个目的在于提供一种用于滇金石斛的培养基，具体技术方案如下：
6.一种用于滇金石斛的培养基，每升培养基中包括以下组分：
[0007][0008]
在其中一些实施例中，每升培养基中包括以下组分：
[0009][0010]
其中，1/2ms基础培养基是指大量元素减半,其余不变的ms基础培养基。
[0011]
本发明还提供了如上所述的培养基在滇金石斛无菌播种后组织培养中的应用，其特征在于，包括以下步骤：人工授粉后取未裂开的果荚、灭菌处理、接种至诱导萌发培养基；将萌发出的圆球球茎及根状茎切块置于增殖培养基中进行增殖培养；增殖培养形成的幼苗置于壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养；生根苗移栽。
[0012]
在其中一些实施例中，每升所述诱导萌发培养基包含以下组分：
[0013]
1/2ms基础培养基0.45
‑
0.55l，naa0.45
‑
0.55g，蔗糖25
‑
35g，琼脂7
‑
7.5g；
[0014]
和/或所述增殖培养基为上述两种培养基中的任一种；
[0015]
和/或所述壮苗生根培养基为上述两种培养基中的任一种。
[0016]
本发明的另一目的在于提供一种滇金石斛的快速繁殖方法，具体技术方案如下：
[0017]
一种滇金石斛的快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0018]
人工授粉后取未裂开的果荚、灭菌处理、接种至诱导萌发培养基；
[0019]
将萌发出的圆球球茎及根状茎切块置于增殖培养基中进行增殖培养；
[0020]
增殖培养形成的幼苗置于壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养；所述壮苗生根培
养基为上述两种培养基中的任一种；
[0021]
生根苗移栽。
[0022]
在其中一些实施例中，所述灭菌处理为：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用70％
‑
80％酒精擦洗干净，再用升汞溶液灭菌5
‑
15min，无菌水冲洗5
‑
8 次，用无菌滤纸吸干残余水分。
[0023]
在其中一些实施例中，所述接种至诱导萌发培养基后，进行弱光培养，光照强度为500
‑
1000lx，光照周期为10
‑
14h，温度为24℃
‑
26℃。
[0024]
在其中一些实施例中，所述增殖培养的步骤包括：将萌发出的圆球球茎及根状茎，小心切成1
‑
2mm左右，接种到增殖培养基中进行增殖培养，光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为10
‑
14h，温度为24℃
‑
26℃，每4周继代一次。
[0025]
在其中一些实施例中，所述壮苗生根培养的步骤包括：把圆球球茎及根状茎增殖继代形成的幼苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根培养，每4周转接一次，转接3次。光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃。
[0026]
在其中一些实施例中，包括以下步骤：
[0027]
人工授粉：植株亲本于中午10：00
‑
14：00授粉；授粉60
‑
70天后，得到未开裂成熟度为80％的果荚进行无菌播种；
[0028]
果荚预处理：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗5
‑
8次，用无菌滤纸吸干残余水分；
[0029]
种子播种及萌发：切开消毒好的果荚将种子接种在诱导萌发培养基中，进行弱光培养，光照强度为500
‑
1000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，大约80
‑
90天后，种子长出圆球球茎及根状茎；
[0030]
增殖继代培养：将萌发出的圆球球茎及根状茎，小心切成1
‑
2mm左右，接种到增殖培养基中进行增殖培养，光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，每4周继代一次，增殖率达5倍后，进行壮苗生根培养；
[0031]
壮苗生根培养：把圆球球茎及根状茎增殖继代形成的幼苗转接到如权利要求1或2所述的培养基上进行壮苗生根培养，每4周转接一次，转接3次；光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃；
[0032]
生根苗移栽。
[0033]
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
[0034]
本发明寻找到了合适的用于滇金石斛无菌播种后组织培养用的培养基配方，通过培养基各个组份的配合，并采取合理的无菌播种时机、无菌播种条件，在这些各项因素的合理配合下，实现了不需要兰菌存在的条件下，滇金石斛也能够播种后萌发、生根、壮苗、移栽，其存活率高。可见本发明快速繁殖的体系，该方法可以满足滇金石斛快速繁殖的工业生产需求，成为石斛的优良替代。
附图说明
[0035]
图1为实施例1滇金石斛温室驯化、开花的图片；
[0036]
图2为滇金石斛授粉后60
‑
70天的果荚图；
[0037]
图3为滇金石斛在萌发诱导培养基中的情况；
[0038]
图4为滇金石斛在增殖基中的情况；
[0039]
图5为实施例1滇金石斛在壮苗生根培养基中的情况；
[0040]
图6为实施例2滇金石斛在壮苗生根培养基中的情况；
[0041]
图7为对比例1滇金石斛在壮苗生根培养基中的情况；
[0042]
图8为实施例1滇金石斛生根壮苗后的情况；
[0043]
图9为对比例1滇金石斛生根不明显的情况。
具体实施方式
[0044]
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
[0045]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0046]
下面通过实施例对本发明进行详细介绍：
[0047]
实施例1
[0048]
1、实验材料：滇金石斛获取自上海植物园保育温室，驯化培养10年以上的植株(滇金石斛温室驯化、开花的情况如图1所示)。
[0049]
2、人工授粉：根据多年驯化养护经验得出，滇金石斛花寿一般只有8
‑
12 小时，且花朵极易掉落。植株亲本的选择时间，为中午10：00
‑
2:00左右为最佳，授粉结种率最高。授粉60
‑
70天后，得到未开裂成熟度为80％的果荚(如图2 所示)进行无菌播种。
[0050]
3、果荚预处理：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗5
‑
8次，用无菌滤纸吸干残余水分。
[0051]
4、种子播种及萌发：切开消毒好的果荚将种子接种在诱导萌发培养基中，进行弱光培养，光照强度为500
‑
1000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，大约80
‑
90天后，种子长出圆球球茎及根状茎。其中诱导萌发培养基为1/2ms 基础培养基+naa0.5g/l+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂。滇金石斛在萌发诱导培养基中的情况如图3所示。
[0052]
5、增殖继代培养：将萌发出的圆球球茎及根状茎，小心切成1
‑
2mm左右，接种到增殖培养基中进行增殖培养，光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，每4周继代一次，增殖率达5倍后，进行壮苗生根培养。其中增殖培养基为1/2ms基础培养基+0.5mg/l6
‑
ba6
‑
苄氨基嘌呤+0.2mg/lnaa萘乙酸+40.0g/l土豆+60.0g/l香蕉+1g/l活性炭+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂；滇金石斛在增殖基中的情况如图4所示。
[0053]
6、壮苗生根培养：把圆球球茎及根状茎增殖继代形成的幼苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根培养，每4周转接一次，转接3次。光照强度为 1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃。其中壮苗生根培养基为1/2ms 基础培养基+0.02mg/l6
‑
ba+0.5mg/lnaa+40.0g/l土豆+60.0g/l香蕉+1g/l活性炭+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂；滇金石斛在壮苗
生根培养基中的情况如图5所示。
[0054]
7、生根苗移栽：4次转接后，植株增大5倍，根系生长明显，将植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。滇金石斛生根壮苗后的情况如图8所示。
[0055]
实施例2
[0056]
1、实验材料：滇金石斛获取自上海植物园保育温室，驯化培养10年以上的植株。
[0057]
2、人工授粉：根据多年驯化养护经验得出，滇金石斛花寿一般只有8
‑
12 小时，且花朵极易掉落。植株亲本的选择时间，为中午10：00
‑
2:00左右为最佳，授粉结种率最高。授粉60
‑
70天后，得到未开裂成熟度为80％的果荚进行无菌播种。
[0058]
3、果荚预处理：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗5
‑
8次，用无菌滤纸吸干残余水分。
[0059]
4、种子播种及萌发：切开消毒好的果荚将种子接种在诱导萌发培养基中，进行弱光培养，光照强度为500
‑
1000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，大约80
‑
90天后，种子长出圆球球茎及根状茎。其中诱导萌发培养基为1/2ms 基础培养基+0.5g/l naa+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂。
[0060]
5、增殖继代培养：将萌发出的圆球球茎及根状茎，小心切成1
‑
2mm左右，接种到增殖培养基中进行增殖培养，光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，每4周继代一次，增殖率达5倍后，进行壮苗生根培养。其中增殖培养基为1/2ms基础培养基+1mg/l6
‑
ba+0.2mg/lnaa+40.0g/l土豆 +60.0g/l香蕉+0.2g/l活性炭+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂。
[0061]
6、壮苗生根培养：把圆球球茎及根状茎增殖继代形成的幼苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根培养，每4周转接一次，转接3次。光照强度为 1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃。其中壮苗生根培养基为1/2ms 基础培养基+1mg/l6
‑
ba+0.2mg/l naa+40.0g/l土豆+60.0g/l香蕉+1g/l活性炭+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂；滇金石斛在壮苗生根培养基中的情况如图6所示。
[0062]
7、生根苗移栽：4次转接后，植株愈伤组织增多，植株增大2倍，有一定根系生长，将根系生长良好的植株转移到自然光下炼苗，然后将其移栽至基质中进行培养，成活率可达95％。
[0063]
对比例1
[0064]
1、实验材料：滇金石斛获取自上海植物园保育温室，驯化培养10年以上的植株。
[0065]
2、人工授粉：根据多年驯化养护经验得出，滇金石斛花寿一般只有8
‑
12 小时，且花朵极易掉落。植株亲本的选择时间，为中午10：00
‑
2:00左右为最佳，授粉结种率最高。授粉60
‑
70天后，得到未开裂成熟度为80％的果荚进行无菌播种。
[0066]
3、果荚预处理：果荚经流水冲洗后，在超净工作台上用75％酒精擦洗干净，再用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗5
‑
8次，用无菌滤纸吸干残余水分。
[0067]
4、种子播种及萌发：切开消毒好的果荚将种子接种在诱导萌发培养基中，进行弱光培养，光照强度为500
‑
1000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，大约80
‑
90天后，种子长出圆球球茎及根状茎。其中诱导萌发培养基为1/2ms 基础培养基+0.5g/l naa+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂。
[0068]
5、增殖继代培养：将萌发出的圆球球茎及根状茎，小心切成1
‑
2mm左右，接种到增殖培养基中进行增殖培养，光照强度为1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃，每4周继代一次，增殖率达5倍后，进行壮苗生根培养。其中增殖培养基为1/2ms基础培养基+1mg/l6
‑
ba+0.2mg/lnaa+40.0g/l土豆 +60.0g/l香蕉+0.2g/l活性炭+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂。
[0069]
6、壮苗生根培养：把圆球球茎及根状茎增殖继代形成的幼苗转接到壮苗生根培养基上进行壮苗生根培养，每4周转接一次，转接3次。光照强度为 1500
‑
2000lx，光照周期为12h，温度为24℃
‑
26℃。其中壮苗生根培养基为1/2ms 基础培养基+0.02mg/l6
‑
ba+0.5mg/lnaa+40.0g/l土豆+60.0g/l香蕉+1g/l活性炭+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂；滇金石斛在壮苗生根培养基中的情况如图7所示。
[0070]
7、生根苗移栽：4次转接后，植株增大1倍，根系生长不明显，不适合移栽。
[0071]
上述实施例、对比例中涉及的培养基总结如下：
[0072]
[0073][0074]
通过以上实施例、对比例的实验结果分析可知：本发明利用自交滇金石斛无菌播种后，使用壮苗生根培养基为1/2ms基础培养基+0.5mg/l6
‑
ba +0.2mg/lnaa+40.0g/l土豆+60.0g/l香蕉+活性炭1g/l+30.0g/l蔗糖+7.2g/l琼脂为最优选方案，其中，6
‑
ba使用范围为0.5mg/l
‑
1mg/l。通过无菌播种及组织培养快速繁殖的方法，显著提高了滇金石斛的增值率和生长速度。
[0075]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0076]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。