一种黄山松的组培快繁方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种黄山松的组培快繁方法。


背景技术：

2.黄山松是中国特有针叶树种，是我国东部亚热带高海拔地区山地绿化、造林和生态恢复的重要树种。黄山松具有较强的生态演替功能、极强的适应性、较高的生态环保功能以及独特的自然景观效果。松树是松材线虫的危害寄主，而松材线虫病传入我国以来，截止2020年12月31日，已蔓延至全国18个省(自治区、直辖市)726个县级行政区，严重威胁我国生态安全、生物安全和经济发展。黄山松是松材线虫病的寄主之一，并于2004年在安庆大龙山林场近700m高的海拔林地中首次发现了自然状态下松材线虫侵染黄山松，并造成数株黄山松枯死，这对黄山景区内黄山松种质资源造成巨大威胁。然而，目前关于黄山松种质资源保存与组培快繁体系的研究还未见报道。
3.植物组织培养是植物种质资源保存的重要方式。植物组织培养具有生长周期短、繁殖率高、管理方便等诸多优点，有利于工厂化生产和自动化控制。利用植物组织培养技术，不仅可以在短时间内快速繁殖珍稀濒危植物，使珍稀物种得以保存。同时，该技术可以快速繁殖名优特新品种，获取具有母本优良性状的植株。
4.据此，若能以黄山松种子的种胚为外植体开展黄山松组培快繁技术，将对黄山松种质资源保存、遗传改良、新品种培育和优质种苗繁殖等方面具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于提供一种黄山松的组培快繁方法，其操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景。
6.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
7.一种黄山松的组培快繁方法，包括如下步骤：
8.(1)外植体的预处理：
9.将黄山松球果置于自然光照下晾晒，以获取黄山松种子；接着，去除黄山松种子的外种皮；
10.(2)外植体的消毒：
11.将去除外种皮的黄山松种子，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒；随后，在无菌滤纸上吸干水分，并挑出种子胚，即得接种所需的无菌外植体；
12.(3)愈伤组织诱导：
13.无菌条件下，将步骤(2)获得的无菌外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+30g/l蔗糖 +7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l naa，ph 5.8；
14.(4)不定芽的诱导与伸长：
15.挑选愈伤组织，将其转接至不定芽诱导培养基，进行不定芽的诱导；其中，不定芽
诱导培养基的配方为：dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；
16.待长出不定芽，将诱导的不定芽转接至伸长培养基，进行不定芽的伸长培养；其中，伸长培养基的配方为：dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+0.1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；
17.(5)生根培养：
18.选择高度为1～2cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培养基中进行直接生根培养；其中，生根培养基的配方为：1/2 dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+2mg/l iba+0.05mg/l naa，ph 5.8。
19.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，黄山松球果采自安徽黄山风景区。
20.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒的具体过程为：将去除种皮的黄山松种子取出备用；接着，在超净工作台中，先用无菌水清洗种子3～5次，再利用75％酒精漂洗60s，利用1％次氯酸钠溶液浸泡10min，最后再用无菌水冲洗3～5次。
21.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒方式，种子的污染率为2％。
22.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，诱导培养至12～16d时，外植体开始愈伤化，出愈率93.65％～96.35％。
23.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，诱导培养至25～35d时，愈伤组织开始长出不定芽，平均不定芽数为2.42～3.72。
24.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，生根培养35～45d时，开始生根，生根率28％。
25.作为本发明的优选方式之一，所述ms、dcr与1/2dcr基本培养基均为本领域常规培养基。
26.作为本发明的优选方式之一，所述愈伤组织诱导、不定芽的诱导与伸长，以及，生根培养的过程中，培养条件均为：培养温度25
±
2℃，相对湿度70％～80％，光照时间14～16h/d，光照强度2000～2500lx。
27.作为本发明的优选方式之一，还包括步骤(6)的炼苗移栽步骤；所述炼苗移栽过程如下：
28.待黄山松生根苗长出发达根系后，打开组培苗瓶盖，炼苗3～5天，期间保持培养基中水分充足；随后，将组培瓶中的培养基用玻璃棒捣碎，并将组培苗从组培瓶中取出；接着，用自来水将其根部培养基冲洗干净，并移栽至花盆中；最后，将移栽的黄山松苗置于培养室中进行培养。
29.本发明相比现有技术的优点在于：
30.(1)本发明首次以黄山松种子的种胚为实验材料，进行黄山种胚消毒体系的构建以及愈伤、不定芽、生根的诱导试验，最终建立了黄山松组培快繁技术；其操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景；
31.(2)本发明填补了关于黄山松离体快繁殖技术的空白，解决了黄山松无性繁殖难、种苗成活率低的瓶颈，极大地减少了购买种苗的成本，降低了因种子质量参差不齐而导致的造林效果差等风险，实现了黄山松的规模化种植，增加了林农收益。
附图说明
32.图1是实施例3中去除外种皮的黄山松种子图；
33.图2是实施例3中无菌种子胚转接至诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养的培养图；
34.图3是实施例3中外植体诱导出的愈伤组织状态图；
35.图4是实施例3中愈伤组织转接至不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养的培养图；
36.图5是实施例3中愈伤组织长出的不定芽状态图；
37.图6是实施例3中不定芽转接至伸长培养基进行不定芽伸长培养的培养图；
38.图7是实施例3中不定芽的生根图；
39.图8是实施例3中组培苗的开盖炼苗图；
40.图9是实施例3中生根苗移栽至花盆后的状态图；
41.图10是实施例4中不同消毒组合对黄山松种子胚的消毒效果图；
42.图11是实施例4中不同培养基对不定芽生根率的影响图。
具体实施方式
43.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
44.实施例1
45.本实施例的一种黄山松的组培快繁方法，包括如下步骤：
46.(1)外植体的预处理：
47.将采自安徽黄山风景区的黄山松球果置于自然光照下晾晒，以获取黄山松种子；接着，去除黄山松种子的外种皮，并置于4℃冰箱备用。
48.(2)外植体的消毒：
49.将去除种皮的黄山松种子从冰箱里取出；接着，在超净工作台中，先用无菌水清洗种子3次，再利用75％酒精漂洗60s，利用1％次氯酸钠溶液浸泡10min，最后再用无菌水冲洗3次；随后，在无菌滤纸上吸干水分，并用手术刀挑出种子胚，即得接种所需的无菌外植体。
50.(3)愈伤组织诱导：
51.无菌条件下，将步骤(2)获得的无菌外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；诱导培养至12d时，外植体开始愈伤化。
52.其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度23℃，相对湿度70％，光照时间14h/d，光照强度2000lx。
53.(4)不定芽的诱导与伸长：
54.挑选愈伤组织，将其转接至不定芽诱导培养基，进行不定芽的诱导；诱导培养至25d时，愈伤组织开始长出不定芽。其中，不定芽诱导培养基的配方为： dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度23℃，相对湿度70％，光照时间14h/d，光照强度2000lx。
55.待长出不定芽，将诱导的不定芽转接至伸长培养基，进行不定芽的伸长培养。其中，伸长培养基的配方为：dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+0.1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度23℃，相对湿度70％，光照时间14h/d，光照强度2000lx。
56.(5)生根培养：
57.选择高度为1cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培养基中进行直接生根培养；生根培养35d时，开始生根。
58.其中，生根培养基的配方为：1/2dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+2mg/l iba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度23℃，相对湿度70％，光照时间14h/d，光照强度2000lx。
59.(6)炼苗移栽：
60.待黄山松生根苗长出发达根系后，逐步打开组培苗瓶盖，炼苗3天，期间保持培养基中水分充足；随后，将组培瓶中的培养基用玻璃棒捣碎，并将组培苗从组培瓶中取出；接着，用自来水将其根部培养基冲洗干净，并移栽至花盆中；最后，将移栽的黄山松苗置于培养室中进行培养，保持土壤水分充足，使移栽的黄山松小苗成活并且开始生长。
61.实施例2
62.本实施例的一种黄山松的组培快繁方法，包括如下步骤：
63.(1)外植体的预处理：
64.将采自安徽黄山风景区的黄山松球果置于自然光照下晾晒，以获取黄山松种子；接着，去除黄山松种子的外种皮，并置于4℃冰箱备用。
65.(2)外植体的消毒：
66.将去除种皮的黄山松种子从冰箱里取出；接着，在超净工作台中，先用无菌水清洗种子5次，再利用75％酒精漂洗60s，利用1％次氯酸钠溶液浸泡10min，最后再用无菌水冲洗5次；随后，在无菌滤纸上吸干水分，并用手术刀挑出种子胚，即得接种所需的无菌外植体。
67.(3)愈伤组织诱导：
68.无菌条件下，将步骤(2)获得的无菌外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；诱导培养至16d时，外植体开始愈伤化。
69.其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度27℃，相对湿度80％，光照时间16h/d，光照强度2500lx。
70.(4)不定芽的诱导与伸长：
71.挑选愈伤组织，将其转接至不定芽诱导培养基，进行不定芽的诱导；诱导培养至35d时，愈伤组织开始长出不定芽。其中，不定芽诱导培养基的配方为： dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度27℃，相对湿度80％，光照时间16h/d，光照强度2500lx。
72.待长出不定芽，将诱导的不定芽转接至伸长培养基，进行不定芽的伸长培养。其中，伸长培养基的配方为：dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+0.1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度27℃，相对湿度80％，光照时间16h/d，光照强度2500lx。
73.(5)生根培养：
74.选择高度为2cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培
养基中进行直接生根培养；生根培养45d时，开始生根。
75.其中，生根培养基的配方为：1/2dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+2mg/l iba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度27℃，相对湿度80％，光照时间16h/d，光照强度2500lx。
76.(6)炼苗移栽：
77.待黄山松生根苗长出发达根系后，逐步打开组培苗瓶盖，炼苗5天，期间保持培养基中水分充足；随后，将组培瓶中的培养基用玻璃棒捣碎，并将组培苗从组培瓶中取出；接着，用自来水将其根部培养基冲洗干净，并移栽至花盆中；最后，将移栽的黄山松苗置于培养室中进行培养，保持土壤水分充足，使移栽的黄山松小苗成活并且开始生长。
78.实施例3
79.本实施例的一种黄山松的组培快繁方法，包括如下步骤：
80.(1)外植体的预处理：
81.将采自安徽黄山风景区的黄山松球果置于自然光照下晾晒，以获取黄山松种子；接着，去除黄山松种子的外种皮(如图1所示)，并置于4℃冰箱备用。
82.(2)外植体的消毒：
83.将去除种皮的黄山松种子从冰箱里取出；接着，在超净工作台中，先用无菌水清洗种子4次，再利用75％酒精漂洗60s，利用1％次氯酸钠溶液浸泡10min，最后再用无菌水冲洗4次；随后，在无菌滤纸上吸干水分，并用手术刀挑出种子胚，即得接种所需的无菌外植体。
84.(3)愈伤组织诱导：
85.无菌条件下，将步骤(2)获得的无菌外植体接种于愈伤组织诱导培养基，进行愈伤组织的诱导(如图2所示)；诱导培养至14d时，外植体开始愈伤化(如图3所示)。
86.其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：ms+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度25℃，相对湿度75％，光照时间15h/d，光照强度2250lx。
87.(4)不定芽的诱导与伸长：
88.挑选愈伤组织，将其转接至不定芽诱导培养基，进行不定芽的诱导(如图4 所示)；诱导培养至30d时，愈伤组织开始长出不定芽(如图5所示)。其中，不定芽诱导培养基的配方为：dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度25℃，相对湿度75％，光照时间15h/d，光照强度2250lx。
89.待长出不定芽，将诱导的不定芽转接至伸长培养基，进行不定芽的伸长培养(如图6所示)。其中，伸长培养基的配方为：dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉 +0.1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度25℃，相对湿度75％，光照时间15h/d，光照强度2250lx。
90.(5)生根培养：
91.选择高度为1.5cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培养基中进行直接生根培养；生根培养40d时，开始生根(如图7所示)。
92.其中，生根培养基的配方为：1/2dcr+30g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+2mg/l iba+0.05mg/l naa，ph 5.8；培养条件为：培养温度25℃，相对湿度75％，光照时间15h/d，光照强度2250lx。
93.(6)炼苗移栽：
94.待黄山松生根苗长出发达根系后，逐步打开组培苗瓶盖，炼苗4天，期间保持培养基中水分充足(如图8所示)；随后，将组培瓶中的培养基用玻璃棒捣碎，并将组培苗从组培瓶中取出；接着，用自来水将其根部培养基冲洗干净，并移栽至花盆中(如图9所示)；最后，将移栽的黄山松苗置于培养室中进行培养，保持土壤水分充足，使移栽的黄山松小苗成活并且开始生长。
95.实施例4
96.本实施例用以分析说明上述实施例1
‑
2中的参数选择：
97.一、不同消毒组合对种子污染率的影响
98.用提前配制好的75％的酒精与3％的次氯酸钠对去除种皮的种子进行消毒，并设置不同的消毒时间组合(见表1)。75％酒精的消毒时间分别设置三个梯度 (30s、60s、90s)，3％的次氯酸钠的消毒时间分别设置为5、10、15min。随后，在无菌滤纸上吸干水分，用手术刀挑出种子胚，并接种在不添加任何激素的ms 培养基中。
99.表1不同处理组合对外植体消毒
[0100][0101][0102]
1周后统计各消毒组合下种胚的污染率，结果如图10所示。结果表明：在消毒方式a、d、g处理下，黄山松种子胚污染率极显著低于其它消毒组合，并且，消毒组合d(75％的酒精消毒60秒、3％的次氯酸钠消毒10分钟)为消毒效果最佳的组合，种子污染率仅为2％。
[0103]
二、不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
[0104]
以ms、dcr为基本培养基，并添加不同种类、浓度的生长素和细胞分裂素对黄山松种胚进行愈伤组织诱导。如表2所示，本试验共设置了21种激素配比的愈伤组织诱导培养
基。将无菌的黄山松种胚接种到不同配方的培养基上，每种培养基接种10瓶，每瓶接种3个种胚，并进行3次重复。在组织培养室中培养28天后，观察并统计每种培养基上愈伤组织的诱导率。。
[0105]
表2不同培养基对黄山松种子胚愈伤组织诱导的结果
[0106]
[0107][0108]
由表2可知，在不同配方的培养基诱导下，种胚愈伤组织的诱导率各不相同。数据统计分析表明，在ms基本培养基中，黄山松种胚愈伤组织诱导率普遍高于dcr培养基。其中以ms为培养基，添加1mg/l的6
‑
ba和0.2mg/l 的naa，种胚愈伤组织诱导率高达95％左右。相关研究表明，基本培养基中 nh4
+
和no3
+
浓度对针叶树成熟合子胚脱分化及愈伤组织的诱导具有显著的作用，高浓度的nh4
+
和no3
+
含量可以有效的促进愈伤组织的诱导。我们的实验表明，具有高盐浓度的ms培养基相比于dcr培养基对黄山松种胚愈伤组织的诱导效果更为显著。
[0109]
进一步比较分析发现，在ms培养基中，6
‑
ba的浓度变化对愈伤组织的诱导效果具
有极显著的影响。较低或较高浓度的6
‑
ba均会降低愈伤组织的诱导效果(见表3)。而在6
‑
ba添加量为1mg/l时，种胚愈伤组织诱导效果最佳。同理，生长素2,4
‑
d和naa对愈伤组织的效率差异也很大，添加生长素naa进行愈伤组织的诱导，其作用效果高于2,4
‑
d。当naa添加量为0.2mg/l时，其愈伤组织诱导率最高(见表4)。此外，过高或过低浓度的naa都会影响种胚愈伤组织的诱导效果。
[0110]
表3不同浓度6
‑
ba对种胚愈伤组织诱导率影响的duncan多重比较
[0111][0112]
表4不同浓度2,4
‑
d、naa对种胚愈伤组织诱导率影响的duncan多重比较
[0113][0114][0115]
三、不同激素配比对不定芽诱导的影响
[0116]
本试验以适合针叶树生长的dcr培养基为基本培养基，并添加不同种类的激素组合进行黄山松不定芽的诱导。如表5所示，分别用附含浓度为0.5～2.0mg/l 6
‑
ba和0.05～0.45mg/l naa的dcr培养基进行不定芽的诱导实验，每种培养基配方接种10瓶，每瓶接种3个种胚，并进行3次重复。同时，观察并记录分化培养基中各个时期的变化，比较不同浓度的植物激素对诱导不定芽形成的影响。经过一段时间培养后，统计不定芽的诱导数，并且观察
不定芽诱导过程中的变化，结果见表5。
[0117]
由表5可知，含有不同浓度生长素与细胞分裂素组合的dcr培养基对黄山松不定芽的诱导效果具有显著的差异。其中，6
‑
ba添加量为1mg/l,naa为0.05 mg/l的dcr培养基中，黄山松不定芽诱导的数量高且不定芽的生长状况较好。
[0118]
表5不同分化培养基对不定芽诱导的结果
[0119][0120][0121]
多重比较分析表明(表6)，6
‑
ba浓度为1mg/l时，黄山松种胚不定芽的诱导率最高。当6
‑
ba浓度过高或过低时，不定芽的诱导率显著下降。不同浓度生长素对黄山松种胚不定芽诱导率的多重比较分析表明(表7)，低浓度的naa 对黄山松种胚不定芽的诱导具有显著的作用，而随着naa浓度的升高，其作用效果显著下降，当naa为0.05mg/l时的效果最佳。
[0122]
表6不同浓度6
‑
ba对不定芽诱导率影响的duncan多重比较
[0123]
[0124]
表7不同浓度naa对不定芽诱导率影响的duncan多重比较
[0125][0126][0127]
四、不同激素配比对不定芽伸长的影响
[0128]
本实验以dcr培养基为基本培养基，通过及时降低培养基中细胞分裂素 6
‑
ba和生长素naa的浓度，并调整激素的配比使不定芽得到快速伸长生长。将诱导的不定芽分别转接至含有0.1mg/l、0.3mg/l、0.5mg/l 6
‑
ba与0.05mg/l naa组合的dcr培养基中，并观察不定芽的伸长效果。通过30天的培养，我们发现在6
‑
ba为0.1mg/l、naa为0.05mg/l的dcr培养基中不定芽的伸长效果最佳。
[0129]
五、不同激素配比对不定芽生根的影响
[0130]
本实验以1/2dcr为基本培养基(大量元素减半)，并添加不同浓度的iba、naa进行组合(如表8所示)，探索合适的生根体系。将高度为1～2cm的黄山松不定芽转接至不同的生根培养基中，转接前用手术刀去除芽基部的针叶，40 天左右统计黄山松不定芽的生根情况。结果如图11所示。
[0131]
表8不同组合的生根培养基
[0132][0133]
[0134]
由图11可知，不同浓度的激素组合对黄山松不定芽的生根诱导效率各不相同，当iba添加量为2mg/l，naa为0.05mg/l时(组合4)，黄山松不定芽的生根率最高。在生长素iba添加量为2mg/l的1/2dcr中，不定芽的生根率显著高于其它浓度，而iba浓度过高或过低均会降低不定芽的生根率，这表明2 mg/l为iba的最适浓度。此外，最适宜黄山松不定芽生根的naa为0.05mg/l，随着naa浓度的升高，其对不定芽的诱导效果显著下降。
[0135]
六、讨论
[0136]
本研究以黄山松种子胚为实验材料，进行黄山松组培快繁技术的构建。结果表明，黄山松种胚最佳的消毒体系为75％的酒精消毒1 分钟，3％的次氯酸钠消毒10分钟；愈伤组织的最佳诱导培养基为ms+1mg/l 6
‑
ba+0.2mg/l naa；不定芽的最佳诱导培养基为dcr+1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa；不定芽伸长最佳的诱导条件为dcr+0.1mg/l 6
‑
ba+0.05mg/l naa；生根效果最佳培养基为1/2dcr+2mg/l iba+0.05mg/l naa。本研究结果对黄山松种质资源的保存、遗传改良、新品种培育和优质种苗繁殖具有重要的意义。
[0137]
此外，还需说明的是，本发明所采用的ms、dcr与1/2dcr均为本领域常规培养基，ms培养基的配方见表9，dcr培养基的配方见表10。
[0138]
表9 ms培养基配方
[0139]
[0140][0141]
表10 dcr培养基配方
[0142]
[0143][0144]
注：1/2dcr培养基为dcr培养基大量元素减半即可。
[0145]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。