一种马的细管冻精制作方法与流程

份、一水柠檬酸钾1
‑
3份、羟乙基哌嗪乙硫磺酸8
‑
10份、无菌蒸馏水100
‑
200份、脱脂奶100
‑
200份、甘油1
‑
3份、卵黄1
‑
3份；
15.所述冷冻液的配置方法为：称取2
‑
吗啉乙磺酸、无水葡萄糖、一水乳糖、五水棉籽糖、五水柠檬酸钠、一水柠檬酸钾和羟乙基哌嗪乙硫磺，并使用无菌蒸馏水配制成溶液；用1mol/l氢氧化钠溶液与ph计，将所得溶液ph值调至6.7；按1：1的配比在所配制的溶液中加入脱脂奶，放入合适容器中封口待用；在使用当天，在配制好的溶液中加入2％卵黄和2.5％甘油，即可制得冷冻液。
16.本发明进一步设置为：在所述步骤s2中，采精人员从公马上采集采精的方法为：
17.在公马充分勃起并爬跨假台马后，采精员站立于公马左侧，左手持假阴道，右手握成半月状揽住公马阴茎的中后部，将阴茎顺势引导入假阴道；阴茎在假阴道内来回抽动数次完成射精；采精人员将假阴道及时竖起并跟随公马后退，待龟头、阴茎从假阴道内出来之后，移开假阴道，完成公马采精。
18.本发明进一步设置为：在所述步骤s3中，对采集的精液检查与处理，包括以下步骤：
19.s301、准备：将室温维持在26
‑
28℃；接触精液的物品提前4h放在37℃恒温箱中；稀释液提前1h放在37℃恒温水浴锅中备用；离心液和冷冻液置于37℃水浴中半小时后取出、擦干并置于室温备用；
20.s302、预处理：采集的原精传递入精液处理室后，把集精瓶放入37℃的恒温水浴锅中，精液用四层消毒纱布过滤，然后用肉眼观察原精液的颜色，记录原精液量；
21.s303、精液检查、精液量及密度测定：根据气味和色泽，确认精液是否正常；从37℃无菌恒温干燥箱中取出纱布、刻度瓶，将精液迅速用灭菌纱布过滤至刻度瓶中，除去精液内的胶状物后再读取精液量；采用精子密度测定仪准确测定精子密度；
22.s304、精子活率检测：用干净的玻璃棒蘸取一滴稀释后的精液滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，其间充满精液，不存留气泡；在200
‑
400倍显微镜下观察精子活率。根据前进运动精子数的多少评定精子活率，计算公式为：
23.s305、精液稀释：采用稀释液对采集的精液进行稀释。
24.本发明进一步设置为：在所述步骤s305中，采用稀释液对采集的精液进行稀释，包括以下步骤：
25.s3050、将稀释精液所用的器具置于37℃恒温环境中，用等温稀释液冲洗2
‑
3次；
26.s3051、将新采集的精液及时稀释，并置于35℃恒温水浴锅中；
27.s3052、将稀释液沿杯壁缓缓加入精液中，然后轻轻转动精液瓶或用灭菌玻璃棒搅动，混合均匀。
28.本发明进一步设置为：在所述步骤s4中，将精液离心、再稀释、灌装和平衡，包括以下步骤：
29.s401、离心：将稀释后精液分装至50ml离心管中，在每只离心管底部加入离心液，然后将离心管轻轻放于离心机中进行离心，离心机参数设定为：25℃，1000
‑
1800g，离心10
‑
20min；
30.s402、离心结束后，打开离心机，取出离心管至蠕动泵安放处，用蠕动泵依次将离
心管上层上清液及下层离心液吸除，留下精子粥，向精子粥中加入适量冷冻稀释液，上下颠倒混匀后，用全精子分析仪检测离心后精液质量，记录其密度、活率、前向运动率、畸形率等精液信息，确定加入的冷冻稀释液的量，保证其终密度为1
×
108个/ml；
31.s403、平衡：根据离心后精液质量检测报告中所得数据，对离心后所得的精液进行进一步稀释，将稀释好的精液放置在0
‑
4℃平衡柜中水浴平衡或直接平衡120min；
32.s404、打印冻精细管：采用细管打印机打印冻精细管；
33.s405、灌装细管：使用精液灌装机，将冷却至0
‑
4℃的精液灌装至打印好的细管中。
34.本发明进一步设置为：在所述步骤s404中，采用细管打印机打印冻精细管，包括以下步骤：
35.s4040、根据离心后精液质量检测报告中所得数据，得出本次制作的冻精细管数，使用细管打印机打印精液分装细管，所印信息包括公马代号、品种代号、冻精生产日期、生产单位代号；
36.s4041、打开细管打印机，输入需要打印的内容，选择打印管数，进行细管打印；
37.s4042、将打印好的细管按照正确的顺序码放在细管托架上并置于0
‑
4℃的平衡柜中降温至0
‑
4℃，以备灌装使用。
38.本发明进一步设置为：在所述步骤s5中，将s4中的冻精细管冷冻，包括以下步骤：
39.s501、上架：将平衡、封装后的冻精细管码放在冷冻托架上；
40.s502、冷冻：将全自动精液冷冻仪预降温至0
‑
4℃，将灌装有精液的细管放入全自动精液冷冻仪中冷冻，冷冻结束后，取出细管装入拇指管，并放入液氮罐中保存。
41.有益效果
42.采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
43.本发明通过配制稀释液和冷冻液、对采集的精液检查与处理、将精液离心、再稀释、灌装和平衡以及将冻精细管冷冻，能够有效的提高解冻后的存活率，进而确保了后继配种流程的配怀率和产仔率能有相应的提高，也有效提高精液的利用率，同时，能够有效的降低畸形率，具有更广阔的市场前景，更适宜推广。
附图说明
44.图1为一种马的细管冻精制作方法的流程图。
具体实施方式
45.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
47.实施例1
48.一种马的细管冻精制作方法，包括以下步骤：
49.步骤一、配制稀释液和冷冻液。
50.稀释液的配置方法为：称取2
‑
吗啉乙磺酸7.8g、无水葡萄糖50g、一水乳糖3g、五水
棉籽糖3g、五水柠檬酸钠0.6g、一水柠檬酸钾0.82和羟乙基哌嗪乙硫磺9.52，并使用无菌蒸馏水1000ml配制成溶液；用1mol/l氢氧化钠溶液与ph计，将所得溶液ph值调至6.7；按1：1的配比在所配制的溶液中加入脱脂奶1000ml，放入合适容器中封口待用；在使用当天，在配制好的溶液中加入5％卵黄，即可制得稀释液。
51.冷冻液的配置方法为：称取2
‑
吗啉乙磺酸7.8g、无水葡萄糖50g、一水乳糖3g、五水棉籽糖3g、五水柠檬酸钠0.6g、一水柠檬酸钾0.82和羟乙基哌嗪乙硫磺9.52，并使用无菌蒸馏水1000ml配制成溶液；用1mol/l氢氧化钠溶液与ph计，将所得溶液ph值调至6.7；按1：1的配比在所配制的溶液中加入脱脂奶1000ml，放入合适容器中封口待用；在使用当天，在配制好的溶液中加入2％卵黄和2.5％甘油，即可制得冷冻液。
52.步骤二、采精人员从公马上采集采精。
53.在采集前对种马准备：
54.运动：采精前为公马佩戴水勒、护腿，根据公马兴奋度进行5
‑
10min适度打圈运动。
55.清洗：准备40℃的热水，操作人员清洗前需清洁双手，佩戴一次性手套，待公马勃起后，操作人员从左前方靠近公马，用左肩紧贴公马肩腹部，清洗时左手手掌摊平，轻轻拖住公马阴茎，右手由下至上的清洗。清洗完毕时操作人员目光紧盯公马眼睛，后退撤离，更换纸巾进行下一次清洗。清洗三次后，双手拿出提前放在兜里的干净纸巾，按由下到上的顺序轻轻将阴茎上残留的水吸干。
56.诱情：牵引发情母马或在假台马上涂抹发情母马的阴道分泌物、尿液等，诱使公马产生性欲并爬跨假台马。
57.采精人员从公马上采集采精的方法为：
58.在公马充分勃起并爬跨假台马后，采精员站立于公马左侧，左手持假阴道，右手握成半月状揽住公马阴茎的中后部，将阴茎顺势引导入假阴道；阴茎在假阴道内来回抽动数次完成射精；采精人员将假阴道及时竖起并跟随公马后退，待龟头、阴茎从假阴道内出来之后，移开假阴道，完成公马采精。
59.采精时要尽量将假阴道固定于假台马后部。马射精时，龟头膨大，阴茎基部、尾根部呈现有节奏收缩和搏动。射精后每匹公马从假台马下来会有不同表现，采精人员应注意自身安全，并根据公马不同表现进行操作。如果公马阴茎回缩速度快，则采精人员及时移开并竖起假阴道，防止精液流失；如果公马阴茎回缩速度慢，采精人员将假阴道及时竖起并跟随公马后退，待龟头、阴茎从假阴道内出来之后，移开假阴道，迅速送检。
60.步骤三、对采集的精液检查与处理。
61.对采集的精液检查与处理，包括以下步骤：
62.301)、准备：将室温维持在26℃；接触精液的物品提前4h放在37℃恒温箱中；稀释液提前1h放在37℃恒温水浴锅中备用；离心液和冷冻液置于37℃水浴中半小时后取出、擦干并置于室温备用。
63.302)、预处理：采集的原精传递入精液处理室后，把集精瓶放入37℃的恒温水浴锅中，精液用四层消毒纱布过滤，然后用肉眼观察原精液的颜色，记录原精液量。
64.303)、精液检查、精液量及密度测定：根据气味和色泽，确认精液是否正常；从37℃无菌恒温干燥箱中取出纱布、刻度瓶，将精液迅速用灭菌纱布过滤至刻度瓶中，除去精液内的胶状物后再读取精液量；采用精子密度测定仪准确测定精子密度。
65.气味：公马的精液略带腥味，如有异常气味，可能是混有尿液、脓液、尘土、粪渣或其他异物，应废弃。
66.色泽：马的正常精液的颜色为淡乳白色或浅灰白色，如有异常颜色，可能是混有尿液、脓液、血液或其他异物，应废弃。
67.304)、精子活率检测：用干净的玻璃棒蘸取一滴稀释后的精液滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，其间充满精液，不存留气泡；在200
‑
400倍显微镜下观察精子活率。根据前进运动精子数的多少评定精子活率，计算公式为：
68.305)、精液稀释：采用稀释液对采集的精液进行稀释。
69.采用稀释液对采集的精液进行稀释，包括以下步骤：
70.3050)、将稀释精液所用的器具置于37℃恒温环境中，用等温稀释液冲洗2次。
71.3051)、将新采集的精液及时稀释，并置于35℃恒温水浴锅中。
72.3052)、将稀释液沿杯壁缓缓加入精液中，然后轻轻转动精液或用灭菌玻璃棒搅动，混合均匀。
73.步骤四、将精液离心、再稀释、灌装和平衡。
74.将精液离心、再稀释、灌装和平衡，包括以下步骤：
75.401)、离心：将稀释后精液分装至50ml离心管中，在每只离心管底部加入离心液，然后将离心管轻轻放于离心机中进行离心，离心机参数设定为：25℃，1000g，离心10min。
76.402)、离心结束后，打开离心机，取出离心管至蠕动泵安放处，用蠕动泵依次将离心管上层上清液及下层离心液吸除，留下精子粥，向精子粥中加入适量冷冻稀释液，上下颠倒混匀后，用全精子分析仪检测离心后精液质量，记录其密度、活率、前向运动率、畸形率等精液信息，确定加入的冷冻稀释液的量，保证其终密度为1
×
108个/ml。
77.403)、平衡：根据离心后精液质量检测报告中所得数据，对离心后所得的精液进行进一步稀释，将稀释好的精液放置在0℃平衡柜中水浴平衡或直接平衡120min。
78.404)、打印冻精细管：采用细管打印机打印冻精细管。
79.405)、灌装细管：使用精液灌装机，将冷却至0℃的精液灌装至打印好的细管中。
80.采用细管打印机打印冻精细管，包括以下步骤：
81.4040)、根据离心后精液质量检测报告中所得数据，得出本次制作的冻精细管数，使用细管打印机打印精液分装细管，所印信息包括公马代号、品种代号、冻精生产日期、生产单位代号。
82.4041)、打开细管打印机，输入需要打印的内容，选择打印管数，进行细管打印。
83.4042)、将打印好的细管按照正确的顺序码放在细管托架上并置于0℃的平衡柜中降温至0℃，以备灌装使用。
84.步骤五、将步骤四中的冻精细管冷冻。
85.将步骤四中的冻精细管冷冻，包括以下步骤：
86.501)、上架：将平衡、封装后的冻精细管码放在冷冻托架上。
87.502)、冷冻：将全自动精液冷冻仪预降温至0℃，将灌装有精液的细管放入全自动精液冷冻仪中冷冻，冷冻结束后，取出细管装入拇指管，并放入液氮罐中保存。
88.在解冻时：预先把水浴锅水温加热至37℃，打开液氮罐，用镊子取一支冷冻后的冻
精细管迅速浸泡入水浴锅中并轻轻晃动，30秒钟，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，取出预先准备好的样品管，剪去超声波封口端，将剪口端放入样品管，然后剪开棉塞端，使精液流入样品管中，取出冻精细管，根据精子密度进行稀释，取稀释后精液或原精进行镜检。
89.实施例2
90.本实施例所提供的一种马的细管冻精制作方法大致和实施例1相同，其主要区别在于：
91.在步骤二中，在清洗时准备42℃的热水；
92.在步骤三中，将室温维持在27℃，将稀释精液所用的器具置于37℃恒温环境中，用等温稀释液冲洗3次；
93.在步骤四中，离心机参数设定为：1400g，离心15min，将稀释好的精液放置在2℃平衡柜中水浴平衡或直接平衡，使用精液灌装机，将冷却至2℃的精液灌装至打印好的细管中，将打印好的细管按照正确的顺序码放在细管托架上并置于2℃的平衡柜中降温至2℃，以备灌装使用；
94.在步骤五中，将全自动精液冷冻仪预降温至2℃。
95.实施例3
96.本实施例所提供的一种马的细管冻精制作方法大致和实施例1相同，其主要区别在于：
97.在步骤二中，在清洗时准备45℃的热水；
98.在步骤三中，将室温维持在28℃，将稀释精液所用的器具置于37℃恒温环境中，用等温稀释液冲洗3次；
99.在步骤四中，离心机参数设定为：1800g，离心20min，将稀释好的精液放置在4℃平衡柜中水浴平衡或直接平衡，使用精液灌装机，将冷却至4℃的精液灌装至打印好的细管中，将打印好的细管按照正确的顺序码放在细管托架上并置于4℃的平衡柜中降温至4℃，以备灌装使用；
100.在步骤五中，将全自动精液冷冻仪预降温至4℃。
101.性能检测
102.选择三头适龄公马(分别编号为001、002和003)，分别采集精液，分别检测合格后，按照实施例1中的所述方法制得细管冻精，将制得的细管冻精在液氮中贮存满48小时后，解冻进行检测，测试结果见表1。
103.表1：公马细管冻精数据统计表
[0104][0105]
通过分析上述表中的相关数据可知，通过本发明所提供的一种马的细管冻精制作方法，能够有效的提高解冻后的存活率，同时，能够有效的降低畸形率。由此表明本发明提供的一种马的细管冻精制作方法具有更广阔的市场前景，更适宜推广。
[0106]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。