一种cik细胞冻存液及冻存方法
技术领域
1.本发明涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种cik细胞冻存液及冻存方法。
背景技术：
2.cik细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，cik)是一种新型的免疫活性细胞，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广的特点，对提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。但诱导cik细胞需要花费很长的时间，在临床应用上需要多次诱导和采血，给患者造成了极大的痛苦和经济负担。为了解决上述问题可采用细胞冻存技术将cik细胞在超低温保存，需要时再复苏、增殖使用。
3.细胞冻存是将细胞放在低温环境，减缓细胞代谢，以达到长期储存的一种技术。其原理是将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将细胞特性保存起来，在需要的时候通过复苏细胞即可使用。细胞冻存时向细胞悬液中加入保护剂，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结的条件下，细胞内水分渗透出细胞外，减少细胞内冰晶形成，从而避免细胞在冰冻过程中的损伤。
4.而cik细胞冻存还存在诸多问题。如cik细胞易受到冰晶损伤，复苏后细胞活率低等问题。细胞冻存液直接影响冻存后cik细胞的活性，目前常见的cik细胞冻存液多采用二甲基亚砜作保护剂同时添加胎牛血清，提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。但是二甲基亚砜存在细胞毒性、胎牛血清成分不确定，可能引入细菌和病毒等污染源，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。因此有必要提供一种成分安全的cik细胞冻存液，保证cik细胞经冻存后的细胞活率以及增殖活性。
技术实现要素：
5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种cik细胞冻存液，不添加dmso和胎牛血清，成分安全，不影响细胞活性。
6.本发明的目的之二在于提供一种cik细胞的冻存方法。
7.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种cik细胞冻存液，由以下成分组成：0.9%氯化钠注射液、低分子右旋糖酐、葫芦素b、葛缕醇、亮啡丝肽、维生素c、肝素钠。
8.优先地，所述cik细胞冻存液由以下成分组成：0.9%氯化钠注射液90-100份、低分子右旋糖酐1.5-2份、葫芦素b 0.8-1.2份、葛缕醇1.2-1.8份、亮啡丝肽2.1-2.4份、维生素c 0.5-1份、肝素钠0.1-0.5份。
9.优先地，所述cik细胞冻存液由以下成分组成：0.9%氯化钠注射液95份、低分子右旋糖酐1.7份、葫芦素b 1.1份、葛缕醇1.4份、亮啡丝肽2.3份、维生素c 0.8份、肝素钠0.3份。
10.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种cik细胞的冻存方法，采用上述冻存液。
11.优选地，所述cik细胞的冻存方法包括以下步骤：（1）将冻存液分装在无菌冻存管中降温至4-6℃，加入待冻存的cik细胞吹打均匀；（2）将步骤（1）冻存管程序降温至-80℃，冻存10-12h，然后转移至液氮中冻存。
12.优选地，所述冻存液中cik细胞的密度为5-10
×
106个/ml。
13.优选地，步骤（2）中程序降温过程为：4-6℃等待1-2min，以1-2℃/min降温至-20℃，以10-15℃/min降温至-80℃。
14.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种cik细胞冻存液，亮啡丝肽帮助维持cik细胞内外渗透压的稳定性，避免在降温过程中细胞局部电解质浓度增高，造成细胞死亡。葫芦素b、葛缕醇对cik细胞形成保护作用，一方面减少冰晶对cik细胞造成的损伤；另一方面使cik细胞保持良好的增殖活性，经复苏后的cik细胞存活率高，增殖活性不降低，有效保障了冻存后的cik细胞仍可用于临床的免疫治疗中。本发明的冻存液不添加dmso和外源性血清，成分明确，安全性更好。冻存液中各成分相互配合降低了冻存过程对cik细胞造成的损伤。
15.本发明还提供一种cik细胞的冻存方法，先采用程序降温至-80℃，然后再转移至液氮中冻存，结合本发明的冻存液，有效保证了cik细胞的存活率，经冻存后的cik细胞仍具有较好的增殖活性。
具体实施方式
16.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
17.实施例1一种cik细胞冻存液，由以下成分组成：0.9%氯化钠注射液95份、低分子右旋糖酐1.7份、葫芦素b 1.1份、葛缕醇1.4份、亮啡丝肽2.3份、维生素c 0.8份、肝素钠0.3份。
18.一种cik细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）将冻存液分装在无菌冻存管中，每管2ml，降温至4℃，加入待冻存的cik细胞吹打均匀，冻存液中cik细胞的浓度为8
×
106个/ml；（2）将步骤（1）冻存管程序降温至-80℃，程序降温过程为：4℃等待2min，以1℃/min降温至-20℃，以10℃/min降温至-80℃，在-80℃冻存10h，然后转移至液氮中冻存。
19.实施例2一种cik细胞冻存液，由以下成分组成：0.9%氯化钠注射液90份、低分子右旋糖酐1.5份、葫芦素b 0.8份、葛缕醇1.2份、亮啡丝肽2.1份、维生素c 0.5份、肝素钠0.1份。
20.一种cik细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）将冻存液分装在无菌冻存管中，每管2ml，降温至4℃，加入待冻存的cik细胞吹打均匀，冻存液中cik细胞的浓度为5
×
106个/ml；（2）将步骤（1）冻存管程序降温至-80℃，程序降温过程为：4℃等待2min，以2℃/min降温至-20℃，以12℃/min降温至-80℃，在-80℃冻存11h，然后转移至液氮中冻存。
21.实施例3一种cik细胞冻存液，由以下成分组成：0.9%氯化钠注射液100份、低分子右旋糖酐
2份、葫芦素b 1.2份、葛缕醇1.8份、亮啡丝肽2.4份、维生素c1份、肝素钠0.5份。
22.一种cik细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）将冻存液分装在无菌冻存管中，每管2ml，降温至6℃，加入待冻存的cik细胞吹打均匀，冻存液中cik细胞的浓度为10
×
106个/ml；（2）将步骤（1）冻存管程序降温至-80℃，程序降温过程为： 6℃等待1min，以1℃/min降温至-20℃，以15℃/min降温至-80℃，在-80℃冻存12h，然后转移至液氮中冻存。
23.对比例1对比例1提供一种cik细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去亮啡丝肽，其余均和实施例1相同。
24.对比例2对比例1提供一种cik细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去葫芦素b，其余均和实施例1相同。
25.对比例3对比例3提供一种cik细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去葛缕醇，其余均和实施例1相同。
26.对比例4对比例4提供一种cik细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去葫芦素b，将葛缕醇的用量调整为2.5份，其余均和实施例1相同。
27.对比例5对比例5提供一种cik细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去葛缕醇，将葫芦素b的用量调整为2.5份，其余均和实施例1相同。
28.在实施例1至实施例3，对比例1至对比例5中的 cik细胞冻存1个月、3个月、6个月、9个月、12个月时，每次取出三个冷冻管在37℃快速复苏，离心后收集细胞，用x-vivo 15培养基制成悬液，取50微升细胞悬液置于ep管中，加入6.2微升0.4%台盼蓝染色，计算台盼蓝拒染率，得出cik细胞存活率，每组数据均取三个冷冻管检测结果的平均值，结果如表1所示。
29.表1
样品冻存1个月存活率（%）冻存3个月存活率（%）冻存6个月存活率（%）冻存9个月存活率（%）冻存12个月存活率（%）实施例198.0297.0195.3693.1491.35实施例297.7496.4394.2292.0790.89实施例397.2196.1494.1192.0290.04对比例184.6580.6976.3271.6764.98对比例287.1984.2780.4975.6670.91对比例381.3277.0572.8466.9761.43对比例483.5780.0676.9172.7966.46对比例580.4476.2171.8565.3758.19
由表1可以看出实施例1至实施例3中的cik细胞在冻存12个月后经复苏后细胞活率在90%以上。对比例1至对比例5中均有不同程度的下降。
30.对比例1中省去了亮啡丝肽，随着冻存时间的延长cik细胞的活率下降显著，在经过12个月的低温冻存后cik细胞的存活率仅为64.98%，远远不能满足临床治疗对cik细胞存活率的要求。这是因为亮啡丝肽可以帮助维持cik细胞内外渗透压的稳定性，避免在降温过
程中细胞局部电解质浓度增高，造成细胞死亡，进而提高cik细胞的存活率。
31.对比例2至对比例5中分别省去葫芦素b或葛缕醇，或者在省去其中一种成分后增加剩余原料的用量，由表1可以看出随着冻存时间的延长cik细胞的存活率呈明显下降趋势，在经过12个月的冻存后，复苏的cik细胞存活率远不能满足使用需求。这是因为本发明的冻存液中添加葫芦素b、葛缕醇对cik细胞形成保护作用，减少冰晶对cik细胞造成的损伤，经复苏后的cik细胞存活率高，增殖活性不降低，冻存后的cik细胞仍可用于临床的免疫治疗中。
32.将未经冻存的cik细胞作为对比例6，分别取实施例1，对比例1至5中冻存12个月后复苏的cik细胞，以及对比例6的细胞加入aim-v medium cts培养基重悬（培养基中添加il-2 500u/ml，il-21 300u/ml），调整细胞密度为1
×
105个/ml，将上述接种细胞的培养基转移至t75培养瓶中，置于37℃，5%co2的培养箱中培养，培养过程中及时补充培养基使细胞浓度维持在1
×
105个/ml，培养10天时，采用台盼兰染色，统计cik细胞数量，计算cik细胞的增殖倍数，结果如表2所示。
33.表2组别增值倍数实施例1182对比例1151对比例2132对比例3146对比例4129对比例5150对比例6175由表2可以看出实施例1中cik细胞的增殖倍数和对比例6未经冻存的cik细胞相当。对比例1至5中为调整了冻存液组成后保存的cik细胞的扩增倍数。由表2可知均有不同程度的下降。对比例1中省去了亮啡丝肽，对比例2至对比例5中分别省去葫芦素b或葛缕醇，或者在省去其中一种成分后增加剩余原料的用量，经冻存后cik细胞的增殖活性均受到不同程度的影响。说明本发明通过在冻存液中添加亮啡丝肽、葫芦素b、葛缕醇有助于cik细胞保持增殖活性，经冻存后的细胞仍可快速恢复活性大量增殖，充分满足临床的应用需求。
34.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。