一种刀孢蜡蚧菌油剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物防治技术领域，具体地说，涉及一种刀孢蜡蚧菌油剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.烟粉虱(bemisia tabaci(gennadius)(hemiptera：aleyrodidae))，又名小白蛾、甘薯粉虱，是农作物中造成巨大损失的“超级害虫”的害虫之一，可直接刺吸及间接传播病毒为害农作物、经济作物等。且已对化学合成农药和昆虫激素类等药物产生抗药性，开发新型生物农药势在必行。
3.蜡蚧菌lecanicillium属于子囊菌门(ascomycota)、粪壳菌纲(sordariomycetes)、肉座菌目(hypocreales)、麦角菌科(clavicipitaceae)，是一类重要的昆虫病原真菌，其致病性广、宿主种类多，对小型刺吸式口器害虫的防治效果较好，如蚜虫、粉虱、蚧虫、叶蝉等。其作为害虫生物防治的重要因子发挥着重要作用，在世界范围内的应用正在稳步增长。蜡蚧菌主要以分生孢子侵染害虫，目前以蜡蚧菌分生孢子为主要活性成分的蜡蚧菌制剂在害虫生物防治中取得了明显成效，但有关刀孢蜡蚧菌(lecanicillium psalliotae)的剂型研制却鲜有报道。
4.真菌油剂通常是以一定的比例将真菌孢子液或孢子粉加入载体油中并辅以其他助剂制成的害虫防治剂，具有较好的附着性和渗透性，在孢子萌发和对害虫侵染时可以降低对环境湿、温度的依赖，从而提高杀虫效果。本研究采用液体发酵菌体，添加各种助剂将刀孢蜡蚧菌hflp006菌株制备成油剂，以期为害虫生物防治提供新的生防材料。


技术实现要素：

5.1、要解决的问题
6.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种刀孢蜡蚧菌油剂及其制备方法和应用，它可以有效防治烟粉虱。
7.2、技术方案.
8.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
9.一种刀孢蜡蚧菌油剂，包括以下组分：真菌孢子液、载体油、乳化剂、稳定剂、紫外线保护剂、抗氧化剂；
10.所述的真菌孢子液为刀孢蜡蚧菌的孢子液；
11.所述的载体油为稻米油；
12.所述的乳化剂为油酸聚氧乙烯脂；
13.所述的稳定剂为t-80；
14.所述的紫外线保护剂为uv-234；
15.所述的抗氧化剂为维生素c。
16.上述所述的刀孢蜡蚧菌油剂中，所述的刀孢蜡蚧菌的编号为hflp006，2018年9月
20、s-20；乳化剂：tw-80、农乳-600、农乳-1602、硬脂酸聚氧乙烯脂、油酸聚氧乙烯脂、松香酸聚氧乙烯脂、乳化剂el；氧化剂：vc、ve、抗氧化剂皆由合肥诺卓生物科技有限公司提供。
58.1.4试验方法
59.1.4.1液体发酵
60.将活化的菌株于无菌操作台内接种于sday培养基平板上，在微生物培养箱内28
±
1℃培养10d。用无菌打孔器在菌落边缘打取菌碟，接种至sday液体培养基内，在28
±
1℃恒温摇床下以转速160r
·
min-1
震荡培养5d。
61.在500ml锥形瓶内加入发酵液(葡萄糖∶蛋白胨∶酵母浸粉＝4∶1∶1，每100ml)，121℃灭菌20min，取刀孢蜡蚧菌hflp006孢子悬浮液以体积百分比1％的接入量在无菌操作台内加入锥形瓶中，每个处理重复三次。置于28
±
1℃恒温摇床以160r
·
min-1
的转速连续震荡培养7d。用血球计数板(25
×
16)计算孢子浓度，重复测定3次。
62.发酵完成的孢子液中孢子浓度为1.032
×
108cfu/ml，活孢率为99.58％。
63.1.4.2载体筛选
64.按姚鸿章等(姚洪章.球孢白僵菌油剂剂型改进的研究[d].安徽农业大学，2007.)的方法，将各种载体油121℃灭菌20min后，经真空干燥24h，以孢子液30％的比重配制成油剂，在高速振荡器上以2500r
·
min-1
的转速震荡均匀，放在4℃冰箱内保存以备用，每组重复三次。
[0065]
在无菌操作台上，分别取8ml的各种载体油装入15ml的试管内，加入2ml的菌液，在振荡器上震荡均匀，常温保存，每隔30d测定孢子活孢率。重复三次。对照处理为孢子悬浮液。
[0066]
1.4.3助剂筛选
[0067]
1.4.3.1乳化剂筛选
[0068]
将乳化剂以0.01％、0.05％、0.1％、0.5％(每100ml)4个浓度梯度配制成含乳化剂的的油溶液，高温灭菌(121℃、20min)，加入30％的孢子液，置于4℃冰箱内保存以备用。实验重复三次。
[0069]
将油剂摇匀，用微量取样器分别取样油剂1ml放入1.5ml的离心管内，测定孢子活孢率。以不含乳化剂的油剂为对照。
[0070]
1.4.3.2稳定剂筛选
[0071]
将稳定剂以0.1％、0.3％、0.5％、1％4个浓度梯度配制成含稳定剂的油剂，置于4℃冰箱内保存以备用。用1000μl移液枪吸取1ml油剂放入1.5ml的eppendoff管内。测定孢子活孢率并观察油剂的稳定性。实验重复三次。对照处理为不含稳定剂的油剂。
[0072]
1.4.3.3紫外保护剂筛选
[0073]
分别将紫外保护剂以0.3g(每100ml油剂)的浓度配制成含紫外剂的油剂，于4℃冰箱内保存以备用。在无菌操作台内，将油剂震荡均匀，用1000μl移液枪分别取样5ml油剂平铺于9cm的培养皿内，取掉培养皿盖，于紫外灯下照射2h(紫外灯18w，照射高度为40cm)。对照处理为不含紫外保护剂的油剂。每组重复三次。测定孢子活孢率。
[0074]
筛选出对孢子保护效果较好的紫外保护剂，以0.05g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g 6个相对浓度配制成油剂，分别取样5ml均匀平铺于培养皿内，紫外灯照射2h，每组重复三次。测定孢子活孢率。
[0075]
1.4.3.4抗氧化剂筛选
[0076]
分别将抗氧化剂配制成5个不同浓度(0.05％、0.1％、0.15％、0.3％、0.5％)加入油剂中，震荡均匀，每组重复三次。对照为不含有抗氧化剂的油剂。于4℃冰箱内保存以备用。
[0077]
用1.5ml的离心管分别装入1ml的油剂，常温避光处理，每隔15d测定孢子活孢率并在显微镜下观察孢子生长发育状况。
[0078]
1.5货架期测定
[0079]
按照1.3的试验方法，将配置好的hflp006菌株油剂，按1ml的装液量分装于1.5ml的离心管内，分别于4℃冰箱和常温保存，每隔30d测定油剂中hflp006菌株的孢子活孢率。
[0080]
1.6活孢率(萌发率)计算
[0081]
活孢率计算方法(李娟.防治西花蓟马的白僵菌耐热性及可湿性粉剂研究[d].中国农业科学院，2015.)，以可见芽管长度大于孢子宽度作为孢子已萌发的保准，每处理随机选取5个视野测定孢子活孢率，每处理重复3次。
[0082][0083]
1.7室内毒力测定
[0084]
采用喷施法。将hflp006菌株油剂稀释成100x、300x、500x、800x、1000x分别测定对q型烟粉虱二龄若虫的毒力效果。每组供试虫各100头，每组试验重复3次。置于光照培养内培养，t：30℃，l∶d＝14∶10，rh：80％，连续测定6d。
[0085]
1.8数据处理
[0086]
采用excel 2019和dps 7.05软件进行数据统计分析和处理。
[0087]
2.结果与分析
[0088]
2.1载体油的筛选
[0089]
如图1所示，在油剂长期贮存过程中，不同载体油中刀孢蜡蚧菌hflp006菌株的孢子活孢率差异显著(f
9，20
＝18.49，p＝0.0001；f
9，20
＝7.85，p＝0.0001；f
9，20
＝5.28，p＝0.0009)，说明不同种类的载体油对刀孢蜡蚧菌hflp006菌株的孢子萌发有影响作用。在贮存1d、15d和30d后，山茶油和稻米油中的孢子活孢率与对照差异不显著，以葵花籽油作为载体油的油剂也表现出较好的效果，而以菜籽油作为载体油的油剂中孢子活孢率最低与对照处理组表现出显著差异。综合比较，稻米油性价比较高，选为刀孢蜡蚧菌hflp006菌株的载体油。
[0090]
2.2乳化剂筛选
[0091]
对添加不同浓度乳化剂的hflp006菌株油剂各处理组的活孢率进行镜检，结果显示各处理组的活孢率与油酸聚氧乙烯脂处理组差异显著(图2)，其中硬脂酸聚氧乙烯脂和乳化剂el在各浓度下对孢子萌发均表现出不利影响，乳化剂油酸聚氧乙烯脂在各浓度下差异不显著，在0.5％浓度下(f
6，14
＝167.59，p＝0.001)，hflp006菌株孢子的萌发率仍高达95.29％，表现出与孢子较好的相容性。tw-80在低浓度下孢子活孢率较高，而随着浓度增加出现伤孢现象。
[0092]
对含有乳化剂的hflp006菌株油剂进行形态学观察(图3)，发现在0.05％浓度下(f
6，14
＝42.69，p＝0.001)，各乳化剂对油剂孢子具有更好分散力，其中油酸聚氧乙烯脂对
hflp006菌株孢子的乳化效果较好，孢子和菌丝单一排列，视野清晰，且与载体油相容性较好，tw-80与载体油的相容性明显弱于油酸聚氧乙烯脂，可作为备用材料。油酸聚氧乙烯脂选为hflp006菌株油剂生产的乳化剂，且以0.05％的浓度为使用浓度。
[0093]
2.3稳定剂的筛选
[0094]
分别镜检含不同种类和不同浓度稳定剂t-80、t-60、t-20、s-20油剂中的孢子活孢率，结果显示各稳定剂中孢子活孢率差异显著(图4，p＝0.0001)，且随着浓度增加，t-60、t-20、s-20各处理组的稳定剂均对孢子萌发造成不利影响。而稳定剂t-80在各浓度下均表现出与hflp0006菌株油剂有较好的相容性，且在0.3％(f
3，8
＝530.67，p＝0.0001)浓度下油剂的稳定性较好(图5)。
[0095]
2.4紫外保护剂的筛选
[0096]
hflp006菌株油剂中加入不同种类的紫外保护剂，经紫外灯照射处理2h后的孢子活孢率差异性显著(图6，f
5，12
＝261.03，p＝0.0001)，5种紫外保护剂中的孢子活孢率显著高于对照处理组，其中uv-234对hflp006菌株的孢子保护效果较好，以uv-234作为hflp006菌株油剂的紫外保护剂。
[0097]
将uv-234配制成0.05g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g(每100ml油剂)浓度加入hflp006菌株油剂中，紫外灯照射处理2h后，hflp006菌株孢子在0.3g和0.4g的活孢率最高，在0.05g时对孢子的保护效果较差(图7，f
5，12
＝136.49，p＝0.0001)，且在0.5g时，uv-234对孢子的保护效果仍达到84.54％，是非常理想的紫外保护剂材料。
[0098]
2.5抗氧化剂的筛选
[0099]
贮存试验结果表明(表2)，ve、抗氧化剂对hflp006菌株孢子的抗氧化保护性能较差，在常温贮存15d、30d后，孢子活孢率下降明显，与对照处理组的孢子活孢率达到显著水平，且这两种抗氧化剂对孢子萌发的保护作用并未随着浓度增加而升高，反而孢子活孢率下降愈加明显。vc表现出较好的抗氧化性能，在0.05％(f
2，6
＝0.25，p＝0.01)浓度下，常温贮存30d后，各处理组的孢子活孢率与对照差异不显著，且在低浓度下表现出较好的抗氧化效果。综合考虑hflp006菌株油剂的生产成本和抗氧化效果，选择vc为油剂的抗氧化剂，0.05％为其使用浓度。
[0100]
表2 hflp006在3种抗氧化剂中的活孢率
[0101]
[0102][0103]
注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.01)。
[0104]
2.6油剂货架期测定
[0105]
在4℃冰箱和常温贮存的hflp006油剂孢子的萌发率差异不显著(图8，f
2，6
＝1.80，p＝0.24；f
2，6
＝7.57，p＝0.02)，但孢子活孢率变化趋势大致相同，在下降程度上，常温保存的油剂要高于4℃冰箱贮存的油剂。这是由于低温环境抑制孢子萌发，营养成分流失较少。
[0106]
2.7室内毒力测定效果
[0107]
hflp006菌株油剂各浓度处理烟粉虱二龄若虫的差异性呈显著水平(如表3所示，f
4，1
0＝26.87，p＝0.0001)，lc
50
为1402.06x(表4)，其中在100x浓度下，对若虫的lt
50
最短，为2.94d。而随着浓度降低，油剂对若虫的防治效果降低，且在800x浓度下，对若虫的防治降低明显，但对若虫的防治仍达到72.33％。综合考虑油剂对若虫的防效，选择500x为烟粉虱田间防治的推荐浓度。
[0108]
表3 hflp006菌株油剂对烟粉虱二龄若虫致死中时间
[0109][0110]
注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.01)。
[0111]
表4 hflp006菌株油剂对烟粉虱二龄若虫的致死中浓度
[0112][0113]
综上所述，本研究对hflp006菌株与载体、助剂的相容性研究，研制出hflp006菌株油剂的配方，并使用此油剂对烟粉虱二龄若虫进行室内毒力测定，结果表明该制剂对烟粉虱有较好的防治作用，可进行推广应用。具体来说：温度、湿度、光照等环境因素会影响白僵菌、蜡蚧菌、绿僵菌等真菌孢子剂型的贮存稳定性、田间防效的持续性、害虫防治的作用速
度，因此在剂型研究中，除载体外，还应考虑各种助剂的理化性能，提高剂型在环境中的稳定性、抗逆性和防治效果。本研究以刀孢蜡蚧菌hflp006菌株孢子的生物学特性为前提，对载体和各种助剂进行筛选，确定刀孢蜡蚧菌hflp006菌株油剂的配方，稻米油为菌株的载体油，油酸聚氧乙烯脂为乳化剂，t-80为稳定剂，uv-234为紫外保护剂，vc为抗氧化剂。真菌油剂剂型的生产加工是一个复杂的过程，要保证其具有良好的应用性、稳定性，还要有较好的贮存性、相容性。载体油是油剂生产过程中的重要因素，其本身是一种非常理想的菌株保存介质，评价其优劣的主要指标是真菌孢子在保存过程中存活的年限。本实验中，将hflp006菌株孢子液以30％的体积比加入供试油中并在常温贮存，对9种载体油中的孢子萌发率进行统计分析，结果显示保存在稻米油、山茶油中的蜡蚧菌孢子萌发率较高，与对照处理组差异不显著，在30d后的孢子萌发率为98.08％、98.51％，综合比较稻米油的经济成本较为低廉且与hflp006菌株孢子的相容性较好，与其他载体油相比优势明显。对添加了各种助剂的hflp006菌株油剂的孢子萌发率测定，以稻米油为载体的油剂在常温环境下，7个月后的孢子萌发率为95.63％，且未出现不良现象，这说明稻米油作为刀孢蜡蚧菌hflp006菌株油剂生产的载体完全符合真菌孢子剂型生产的要求，对hflp006菌株的孢子有较好的保护作用，为后续助剂的筛选和商品化生产奠定了基础。油剂与可湿性粉剂、颗粒剂等相比，在贮存和稳定性上具有一定的优势，但油具有流动性，容易造成大量孢子团的存在，影响孢子在萌发过程的检测不准确和在害虫防治上虫体孢子分布不均，造成剂型研究过程的不准确性。乳化剂可以改善真菌剂型中各种组成成分之间的表面张力，使各个物质形成均匀稳定的分散体系。本研究比较了7种乳化剂的悬浮性和与hflp006菌株油剂的相容性，油酸聚氧乙烯脂在各个浓度均表现出对hflp006菌株孢子有较好的乳化性，其次是tw-80。硬脂酸聚氧乙烯脂和乳化剂-el显著抑制hflp006菌株孢子的萌发，不易作为hflp006菌株油剂的乳化剂。通过形态分析比较油酸聚氧乙烯脂在0.05％浓度对hflp006菌株油剂中的孢子分散效果较好，tw-80可作为备用乳化剂。hflp006菌株孢子的密度大于油，仅靠乳化剂的乳化悬浮性难以维持孢子长时间保持悬浮状态。添加稳定剂可以改善油剂中孢子的沉降。本研究中，t-80可作为hflp006菌株油剂的稳定剂，其在0.3％、0.5％、1％浓度下表现出较好的悬浮稳定性，显著优于其他供试稳定剂，考虑成本效益，推荐使用浓度为0.3％。紫外线对真菌孢子有较强的负面影响，可杀伤孢子或抑制孢子的萌发，添加紫外保护剂能有效抵抗孢子的损伤。在供试的5种紫外剂中，uv-234表现出对hflp006菌株孢有较好的保护效果，且在0.3g、0.4g浓度下对孢子保护效果最好，推荐0.3g作为油剂生产浓度。真菌剂型在长期贮存中理化性质会发生变化，这可能是剂型在保存过程中不稳定的原因之一。抗氧化剂可以有效的抵抗剂型中各物质发生氧化作用。本研究筛选的3种抗氧化剂，vc与hflp006菌株油剂相容性较好，在0.05％浓度下贮存30d，孢子萌发率为97.85％，且油剂中各物质未出现被氧化现象。贮存期是检验真菌剂型优劣最关键的因素，制剂中所有的物质在长期贮存中皆可导致孢子自溶、毒力下降，或者各物质之间发生化学反应，使制剂不耐保存或变化成其他物质。hflp006菌株油剂在4℃冰箱和常温贮存7个月后，孢子活孢率分别为96.53％和95.63％，且其理化性质未发生变化，具有商品化生产和推广价值。
[0114]
此外，参考专利如下：
[0115]
中国发明专利，申请号：cn201410419402.5，公开号：cn104255808a，公开了一种蜡蚧菌油剂及其制备方法和在防治农业害虫中的作用，其公开的技术方案如下：按重量百分
比计算，蜡蚧轮枝菌孢子粉占比10-30％，乳化剂占比5-20％，稳定剂占比1-3％，植物油占比47-84％。
[0116]
结合上述内容，设置具体的方案：
[0117]
(1)配方：
[0118]
ck：30％hflp006菌株孢子液(其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)、0.05％的油酸聚氧乙烯脂为乳化剂、0.5％的t-80作稳定剂、0.3g的uv-234作紫外保护剂、抗氧化剂为0.05％浓度的vc，稻米油补足至体积分数为100％。
[0119]
a：47g大豆油、20g农用乳化剂gernol、3g羟基纤维素钠、30ml蜡蚧菌孢子液(上述参考专利，其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)。
[0120]
b：64g大豆油、5g农用乳化剂gemol、1g羟基纤维素钠、30ml蜡蚧菌孢子液(上述参考专利，其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)。
[0121]
c：47g菜籽油、20g脂肪醇聚氧乙烯脂、3g羟基纤维素钠、30ml蜡蚧菌孢子液(上述参考专利，其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)。
[0122]
d：64g菜籽油、5g脂肪醇聚氧乙烯脂、1g羟基纤维素钠、30ml蜡蚧菌孢子液(上述参考专利，其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)。
[0123]
e：47g蓖麻油、20g烷基酚聚氧乙烯醚、3g甲基纤维素、30g蜡蚧菌孢子液(上述参考专利，其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)。
[0124]
f：64g蓖麻油、5g烷基酚聚氧乙烯醚、1g甲基纤维素、30ml蜡蚧菌孢子液(上述参考专利，其中孢子的浓度为1.032
×
108cfu/ml)。
[0125]
(2)供试昆虫：q型烟粉虱二龄若虫。
[0126]
(3)供试植物：云烟87。
[0127]
(4)测试结果：
[0128]
室内毒力效果如下：
[0129]
表5 hflp006菌株不同油剂种类对q型烟粉虱二龄若虫的毒力
[0130][0131]
各油剂配方在500x浓度下处理烟粉虱二龄若虫的差异性呈显著水平(表5)，其中ck处理组对若虫的累计死亡率最高为90.33％，lt
50
最短为3.21d，显著优于其他处理组。
[0132]
按照每亩通常对水喷雾30kg量，本设计油剂配方ck处理，每亩用药量为60ml[孢子质量为60
×
0.3
×
1.032
×
108÷
(500
×
108)＝0.037g]，防治烟粉虱即可达到累计死亡率最高为90％以上。对比文件(申请号：cn201410419402.5)，可算出每亩用药量150g[孢子质量为150
×
0.2＝30g]，防治蚜虫效果达90％以上，但本设计油剂配方ck处理孢子用量远小于
对比文件孢子的用量。同时对比文件中，每公顷用水2250kg，每亩用水150kg，用水量大，用工成本明显增高。
[0133]
货架期测定效果如下：
[0134]
表6 hflp006菌株不同油剂种类在不同贮存条件下7个月后的活性孢子浓度
[0135][0136]
从表6可以看出，hflp006菌株不同油剂种类在不同贮存条件下7个月后的活性孢子浓度存在差异。本设计配方ck组hflp006菌株油剂在4℃和常温条件贮存7个月后的孢子浓度分别为12.79
×
107cfu/ml和11.61
×
107cfu/ml，均大于参考专利a、b、c、d、e、f组hflp006菌株油剂在4℃和常温条件贮存7个月后的孢子浓度，且差异显著。同时观察到本设计配方ck组hflp006菌株油剂在4℃和常温条件贮存7个月后的剂型溶液分布均匀且稳定，而参考专利a、b、c、d、e、f组hflp006菌株油剂在4℃和常温条件贮存7个月后的剂型溶液分布不稳定，孢子与溶液分层。
[0137]
如图9-图15所示，在4℃冰箱和常温贮存的hflp006油剂孢子的活孢率差异显著，且两种环境下孢子活孢率变化趋势大致相同，但在下降程度上，常温保存的油剂要高于4℃冰箱贮存的油剂。其中ck处理组在贮存7个月后，4℃冰箱和常温贮存的hflp006油剂孢子的活孢率仍分别为96.53％和95.63％，而其他处理组孢子活孢率下降幅度较高，显著低于ck处理组，表明ck处理组具有较好的长期贮存性能。
[0138]
通过对比得知，结果显示30％hflp006菌株孢子液、0.05％的油酸聚氧乙烯脂为乳化剂、0.5％的t-80作稳定剂、0.3g的uv-234作紫外保护剂、抗氧化剂为0.05％浓度的vc、稻米油为载体，更适合作为刀孢蜡蚧菌hflp006菌株油剂的配方。
[0139]
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。