乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法及应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，占所有女性癌症的近四分之一，其发病率和死亡率均高居第一，并趋于年轻化。动物模型是开展肿瘤研究不可替代的重要支撑工具，随着乳腺癌发病机制及临床治疗的研究越来越深入，乳腺癌动物模型的构建及应用也越来越成为关注的热点。其中，乳腺癌小鼠模型能够较好模拟人乳腺癌发生发展，在乳腺癌疾病机理研究和临床前药效学评估等方面具有重要的应用价值。乳腺癌小鼠模型可分为原发性和移植性两种，其中原发性包括自发型乳腺癌模型、诱导型乳腺癌模型和基因工程鼠乳腺癌模型。移植性包括原位移植型乳腺癌模型和异位移植型乳腺癌模型。
3.乳腺癌移植模型，相对于原发性模型而言，具备成本低、周期短的特点，是研究乳腺癌治疗及药物评估的优势模型，目前应用最广。根据移植物的来源，可以分为同种移植和异种移植。异种移植多采用人源的乳腺癌细胞或组织接种到不同程度的免疫缺陷鼠上，其中原位的异种移植模型鼠肿瘤微环境最接近人体肿瘤特性。
4.异种原位乳腺癌模型是目前研究乳腺肿瘤致病机理和研发药物评估的优势模型，主要是将人源的肿瘤细胞株接种免疫缺陷的小鼠体内成瘤。目前市场多采用开创式接种，以保证原位，例如，剪开表皮找到小鼠第四对乳房垫位置，用镊子挑起乳房垫组织，向乳房垫接种肿瘤细胞或组织。然而，该操作对小鼠本身的治愈能力提出了更高挑战，同时，操作耗时、无菌要求高。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，该构建方法操作简单，采用无创式注射乳腺癌细胞的方法，解决了目前市场上常用接种模式的局限性。
7.本发明的第二目的在于提供一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法在乳腺癌药物药效评估中的应用。
8.第一方面，本发明提供了一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，包括以下步骤：
9.使用注射器从小鼠第5对乳头的单侧乳头进针，然后向同侧第4对乳头方向皮下行针至小鼠后腿根部后注入乳腺癌细胞溶液，构建得到乳腺癌细胞株原位移植模型；
10.所述第5对乳头为将小鼠从头至尾方向数的第5对乳头；
11.所述第4对乳头为将小鼠从头至尾方向数的第4对乳头。
12.作为进一步技术方案，所述乳腺癌细胞包括mda-mb-231乳腺癌细胞株或py8119乳
腺癌细胞株。
13.作为进一步技术方案，所述乳腺癌细胞采用对数生长期的mda-mb-231乳腺癌细胞株。
14.作为进一步技术方案，所述乳腺癌细胞溶液的细胞量为0.8
×
106～1.2
×
106个细胞，优选为1
×
106个细胞。
15.作为进一步技术方案，所述乳腺癌细胞溶液的体积为100～200μl，优选为200μl。
16.作为进一步技术方案，所述乳腺癌细胞溶液中乳腺癌细胞密度为4
×
106～6
×
106细胞/ml，优选为5
×
106细胞/ml。
17.作为进一步技术方案，所述乳腺癌细胞溶液中还包括基质胶。
18.作为进一步技术方案，所述小鼠包括nsg小鼠；
19.优选地，所述小鼠的周龄为5～7周龄，优选为6周龄。
20.作为进一步技术方案，注入乳腺癌细胞溶液之后抽出注射器；
21.在注射器针头即将离开小鼠皮下时，旋转注射器后再拔出。
22.第二方面，本发明提供了一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法在乳腺癌药物药效评估中的应用。
23.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
24.本发明提供的乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，首先使用注射器从小鼠第5对乳头的单侧乳头进针，然后向同侧第4对乳头方向皮下行针至小鼠后腿根部后注入乳腺癌细胞溶液，构建得到乳腺癌细胞株原位移植模型。本发明依据小鼠乳腺组织解剖图的结构特征，设计特殊的皮下接种方式，既能实现无创伤口的皮下注射式原位接种，又能保证精准的原位成瘤，提高了原位模型的成功率。本发明的构建方法操作简单，解决了目前市场上常用接种模式的局限性，为大规模、可重复构建乳腺癌小鼠模型，提供了更大可能。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本发明实施例1提供的小鼠乳腺位置及注射位置图；
27.图2为本发明实施例1提供的带红色荧光标记的mda-mb-231乳腺癌细胞株，左图为细胞明场图，右图为细胞荧光图；
28.图3为本发明实施例1提供的小动物活体成像图；
29.图4为本发明实施例1提供的原位模型解剖图；
30.图5为本发明实施例1提供的成瘤乳腺组织解剖图；
31.图6为本发明实施例2提供的小鼠乳腺原位成瘤图；
32.图7为本发明实施例2提供的小鼠肿瘤生长曲线图；
33.图8为对比例2提供的小鼠乳腺成瘤图；
34.图9为对比例2提供的小鼠肿瘤组织解剖图；
35.图10为对比例3提供的小鼠成瘤乳腺组织解剖图；
36.图11为对比例3提供的小鼠肿瘤组织解剖图。
具体实施方式
37.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
38.第一方面，本发明提供了一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，包括以下步骤：
39.使用注射器从小鼠第5对乳头的单侧乳头进针，然后向同侧第4对乳头方向皮下行针至小鼠后腿根部后注入乳腺癌细胞溶液，构建得到乳腺癌细胞株原位移植模型；
40.所述第5对乳头为将小鼠从头至尾方向数的第5对乳头；
41.所述第4对乳头为将小鼠从头至尾方向数的第4对乳头。
42.小鼠五对乳腺位置及注射位置如图1所示，可以看到，将小鼠从头至尾的方向数，依次为第1对乳头、第2对乳头、第3对乳头、第4对乳头和第5对乳头，其中，小鼠的第4对乳头附近的脂肪垫为承载肿瘤细胞最合适的区域。因此，本发明的构建方法选择小鼠的第4对乳房作为接种乳腺癌细胞的位置。
43.本发明依据小鼠乳腺组织解剖图的结构特征，设计特殊的皮下接种方式，既能实现无创伤口的皮下注射式原位接种，又能保证精准的原位成瘤，提高了原位模型的成功率。本发明的构建方法操作简单，解决了目前市场上常用接种模式的局限性，为大规模、可重复构建乳腺癌小鼠模型，提供了更大可能。
44.在一些优选的实施方式中，所述乳腺癌细胞包括但不限于mda-mb-231乳腺癌细胞株或py8119乳腺癌细胞株，或者本领域技术人员所熟知的其他乳腺癌细胞。
45.在一些优选的实施方式中，所述乳腺癌细胞采用对数生长期的mda-mb-231乳腺癌细胞株。
46.对数生长期的细胞酶系活跃，代谢旺盛，抗不良环境的能力最强，因此，在本发明中采用对数生长期的mda-mb-231乳腺癌细胞株对小鼠进行接种。
47.在一些优选的实施方式中，所述乳腺癌细胞溶液的细胞量为0.8
×
106～1.2
×
106个细胞，例如可以为，但不限于0.8
×
106个细胞、0.9
×
106个细胞、1.0
×
106个细胞、1.1
×
106个细胞或1.2
×
106个细胞，优选为1
×
106个细胞。
48.在一些优选的实施方式中，所述乳腺癌细胞溶液的体积为100～200μl，例如可以为，但不限于100μl、120μl、140μl、160μl、180μl或200μl，优选为200μl。
49.由于小鼠的乳腺组织(脂肪垫)承载的细胞悬液的容量有限，为防止漏液等情况的发生，本发明选择乳腺癌细胞溶液的注射体积在100～200μl范围内。
50.在一些优选的实施方式中，所述乳腺癌细胞溶液中乳腺癌细胞密度为4
×
106～6
×
106细胞/ml，例如可以为，但不限于4
×
106细胞/ml、4.4
×
106细胞/ml、4.8
×
106细胞/ml、5.2
×
106细胞/ml、5.6
×
106细胞/ml或6
×
106细胞/ml，优选为5
×
106细胞/ml。
51.乳腺癌细胞溶液的实际细胞浓度，依据肿瘤细胞的类型选择，当以mda-mb-231乳腺癌细胞株作为接种细胞时，优选的细胞密度为5
×
106细胞/ml。
52.在本发明中，接种乳腺癌细胞溶液的细胞量、体积或者细胞面密度均会影响乳腺癌原位模型的成功率。通过对接种乳腺癌细胞溶液的细胞量、体积和细胞密度的进一步优化和调整，以提高乳腺癌原位模型构建的成功率。
53.在一些优选的实施方式中，所述乳腺癌细胞溶液中还包括基质胶。
54.对于不易形成肿瘤组织的乳腺癌细胞，可以采用向乳腺癌细胞溶液中添加基质胶的方式来提高成瘤率。
55.在一些优选的实施方式中，所述小鼠包括但不限于nsg小鼠，或者本领域技术人员所熟知的其他免疫缺陷型小鼠。
56.优选地，所述小鼠的周龄为5～7周龄，优选为6周龄。
57.在一些优选的实施方式中，注入乳腺癌细胞溶液之后抽出注射器；
58.在注射器针头即将离开小鼠皮下时，旋转注射器后再拔出。
59.当乳腺癌细胞注入乳腺组织时，会形成鼓包，注射完成后，慢慢抽出注射器，在针头即将离开皮下的时候，轻轻旋转注射器，避免注射的乳腺癌细胞溶液流出。
60.第二方面，本发明提供了一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法在乳腺癌药物药效评估中的应用。
61.下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
62.实施例1
63.乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，构建方法如下：
64.细胞培养：选择红色荧光标记的lv10n-nc稳转株mda-mb-231乳腺癌细胞株(利用lv10n-nc慢病毒侵染mda-mb-231乳腺癌细胞构建带红色荧光标记的mda-mb-231乳腺癌细胞株，带红色荧光标记的mda-mb-231乳腺癌细胞株如图2所示)，在细胞的倍数生长期，收集并调整细胞浓度为5
×
106cell/ml。细胞准备好后，放置冰上。
65.构建原位移植模型：选用6只6周龄的雌性nsg小鼠，利用呼吸麻醉机将同批实验鼠麻醉后，用1ml无菌注射器吸取0.2ml密度为5
×
106cell/ml的细胞，依据小鼠的解剖图所示的乳腺结构特征，从第5对乳头的单侧乳头进针，以与该侧第四对乳头相连方向为皮下行针方向，如图1所示线条(图1中的为解剖前实验鼠5对乳腺的位置，线圈为5对乳头位置，线条为注射位置；图1中的右图为第四与第五乳房解剖图)，当针头到达小鼠后腿根部时，缓缓注入肿瘤细胞，当肿瘤细胞注入乳腺组织时，会形成鼓包，慢慢抽出注射器，在针头即将离开皮下的时候，轻轻旋转注射器，以避免漏液。
66.待小鼠肿瘤组织长至15
×
15mm左右的时候，对构建得到的乳腺癌原位模型采用多模式动物活体成像系统检测和解剖，观察成瘤情况，结果如图3、图4和图5所示。
67.从图3和4中可以看出，采用本发明的乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法成功对所有小鼠构建得到了乳腺癌原位模型，构建成功率为100％，并且所有小鼠的成瘤位置均在第4对乳房处，成瘤位置精准。
68.实施例2
69.乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，构建方法如下：
70.细胞培养：选择py8119乳腺癌细胞株，在细胞的倍数生长期，收集并调整细胞浓度为6
×
106cell/ml。细胞准备好后，放置冰上。
71.构建原位移植模型：选用6只6-8周龄的c57bl/6雌性小鼠，利用呼吸麻醉机将同批实验鼠麻醉后，用1ml无菌注射器吸取0.2ml密度为6
×
106cell/ml的细胞，依据小鼠的解剖图所示的乳腺结构特征，从第5对乳头的单侧乳头进针，以与该侧第四对乳头相连方向为皮下行针方向，当针头到达小鼠后腿根部时，缓缓注入肿瘤细胞，当肿瘤细胞注入乳腺组织时，会形成鼓包，慢慢抽出注射器，在针头即将离开皮下的时候，轻轻旋转注射器，以避免漏液，对小鼠进行正常繁殖饲养，小鼠肿瘤平均生长情况如图7所示。
72.待小鼠肿瘤组织长至15
×
15mm左右的时候，对构建得到的乳腺癌原位模型进行观察和解剖，成瘤情况如图6。
73.结果发现，6只实验鼠均产生明显的肿瘤，说明所有小鼠成功构建得到了乳腺癌原位模型，构建成功率为100％，并且所有小鼠的成瘤位置均在第4对乳房处，成瘤位置精准。
74.实施例3
75.乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，构建方法如下：
76.细胞培养：选择mda-mb-231乳腺癌细胞株，在细胞的倍数生长期，收集并调整细胞浓度为4
×
106cell/ml。细胞准备好后，放置冰上。
77.构建原位移植模型：选用6只6周龄的雌性nsg小鼠，利用呼吸麻醉机将同批实验鼠麻醉后，用1ml无菌注射器吸取0.2ml密度为4
×
106cell/ml的细胞，依据小鼠的解剖图所示的乳腺结构特征，从第5对乳头的单侧乳头进针，以与该侧第四对乳头相连方向为皮下行针方向，当针头到达小鼠后腿根部时，缓缓注入肿瘤细胞，当肿瘤细胞注入乳腺组织时，会形成鼓包，慢慢抽出注射器，在针头即将离开皮下的时候，轻轻旋转注射器，以避免漏液。
78.待小鼠肿瘤组织长至15
×
15mm左右的时候，对构建得到的乳腺癌原位模型进行观察和解剖。
79.结果发现，6只实验鼠均产生明显的肿瘤，说明所有小鼠成功构建得到了乳腺癌原位模型，构建成功率为100％，并且所有小鼠的成瘤位置均在第4对乳房处，成瘤位置精准。
80.对比例1
81.一种乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，专利申请号为：201610626474.6。参见该专利申请的实施例1，构建方法如下：
82.取人乳腺癌组织标本，放入无菌的40c预冷的装有dmem基础培养基的15m1离心管中，并保持0-4℃保存，在1小时内进行处理。
83.在超净工作台中，将上述肿瘤组织放入无菌培养皿中，剪去周边脂肪组织以及坏死组织后，使用无菌手术刀将肿瘤组织po切成《lmm3的小块后，移入无菌1.5mlep管中，加入小牛血清和基质胶(bd公司，货号354234)各200u1，使用lml注射器换12
#
针头吸取肿瘤组织各用；
84.接种小鼠使用18-22g，6-8周龄spf级nod-scid雌小鼠，具体接种方法：麻醉小鼠后，使用动物剃毛器对小鼠腹部和颈后剃毛；剃毛区域先后使用碘伏和酒精擦拭消毒，将肿瘤组织植入分别植入至小鼠腹部两侧第四对乳房垫中；颈后皮下植入17β-雌二醇缓释药剂(ira公司，货号5e-121)。植入完毕后正常饲养并完成相关信息记录。
85.根据该专利说明书第[0030]段的记载可知，该方法虽然采用了与本发明相似的构
建方法，包括以乳腺癌细胞作为接种细胞并采用注射的方式进行接种，然而其小鼠模型的构建成功率仅为20％，远远低于本发明。
[0086]
对比例2
[0087]
乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，区别在于进针注射的方法不同，构建方法如下：
[0088]
细胞培养：选择py8119乳腺癌细胞株，在细胞的倍数生长期，收集并调整细胞浓度为6
×
106cell/ml。细胞准备好后，放置冰上。
[0089]
构建原位移植模型：选用4只6-8周龄的c57bl/6雌性小鼠，利用呼吸麻醉机将同批实验鼠麻醉后，用1ml无菌注射器吸取0.2ml密度为6
×
106cell/ml的细胞，依据小鼠的解剖图所示的乳腺结构特征，从第4对乳头的单侧乳头皮下进针，当针头到达小鼠后腿根部时，缓缓注入肿瘤细胞，当肿瘤细胞注入乳腺组织时，会形成鼓包，慢慢抽出注射器，在针头即将离开皮下的时候，轻轻旋转注射器，以避免漏液，对小鼠进行正常繁殖饲养。
[0090]
待小鼠肿瘤组织长至15
×
15mm左右的时候，对构建得到的乳腺癌原位模型进行观察和解剖，成瘤情况如图8(图8中小鼠从左至右依次为1号至4号)和图9(图9中从左至右依次为1号至4号)。
[0091]
从图中可以看出，虽然成瘤位置相近，但是解剖后发现，原位成瘤率为50％(2/4)。
[0092]
判断依据：1号和2号肿瘤实质生长进入肌肉组织，无明显界面，不在乳腺脂肪层，不易剥离。
[0093]
对比例3
[0094]
乳腺癌细胞株原位移植模型的构建方法，区别在于进针注射的方法不同，构建方法如下：
[0095]
细胞培养：选择mda-mb-21人源乳腺癌细胞株，在细胞的倍数生长期，收集并调整细胞浓度为6
×
106cell/ml。细胞准备好后，放置冰上。
[0096]
构建原位移植模型：选用5只5-6周龄的ngs雌性小鼠，利用呼吸麻醉机将同批实验鼠麻醉后，用1ml无菌注射器吸取0.2ml密度为6
×
106cell/ml的细胞，依据小鼠的解剖图所示的乳腺结构特征，从第4对乳头的单侧乳头皮下进针，当针头到达小鼠后腿根部时，缓缓注入肿瘤细胞，当肿瘤细胞注入乳腺组织时，会形成鼓包，慢慢抽出注射器，在针头即将离开皮下的时候，轻轻旋转注射器，以避免漏液，对小鼠进行正常繁殖饲养。
[0097]
待小鼠肿瘤组织长至15
×
15mm左右的时候，对构建得到的乳腺癌原位模型进行观察和解剖，成瘤情况如图10(图10中小鼠从左至右依次为1号至5号)和图11(图11中从左至右依次为1号至5号)。
[0098]
从图中可以看出：虽然成瘤位置相近，但是解剖后发现，原位成瘤率为60％(3/5)。
[0099]
判断依据：4号和5号肿瘤实质生长进入肌肉组织或腹腔，无明显界面，不在乳腺脂肪层，不易剥离。例如5号小鼠的肿瘤界限模糊，已经侵入腹部和腿部肌肉，不是单纯的乳腺原位肿瘤。将5只小鼠的肿瘤剥离后，可以看到实质瘤的形状不均一，不完全包埋在乳腺脂肪层，不是单纯的原位肿瘤。
[0100]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。