1.本发明涉及一种愈伤组织的制备方法，特别是一种梅花愈伤组织的制备方法。
背景技术：
2.白梅花又被称为绿梅花、绿萼梅，为蔷薇科落叶小乔木植物梅prunus mume(sieb.)sieb.et zucc.的干燥花蕾。白梅花提取物中含有多种活性物质，其中在化妆品领域应用最为广泛的就是总黄酮与绿原酸类物质。其中黄酮类化合物是梅花提取物中主要的化学成分之一，主要包括黄酮醇及其相关苷类，还包括一部分花色素苷类物质。梅花总黄酮具有优秀的抗氧化及美白功效。研究证明白梅花提取物具有优秀的清除dpph自由基与o
2-自由基的功效。除了抗氧化性之外，白梅花提取物还可以抑制黑色素沉积，对抑制雀斑具有很好的功效，同时，白梅花提取物还具有一定的改善应激功效，作用机制为抑制炎症反应。由此可见白梅花提取物是一种有效的美白剂，可应用于化妆品领域。
3.目前在化妆品已使用原料目录中，仅有欧洲山梅花(philadelphus coronarius)花提取物被作为了已使用原料，导致梅花提取物应用受限的原因一是梅花的种植范围较小，且需要较高的育种水平，因此导致了梅花的产量较低；二是野生梅花具有较多难以除去的原生病毒及细菌，无法得到大范围应用。
4.因此，目前的白梅花提取物在化妆品上的应用存在资源匮乏、携带难于去除的原生病毒及细菌的问题。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于，提供一种梅花愈伤组织的制备方法。本发明具有去除白梅花携带的原生病毒及细菌，扩大白梅花产量的特点。
6.本发明的技术方案：一种梅花愈伤组织的制备方法，包括采用培养基a对白梅花无菌种子进行萌发培养得到无菌的白梅花外植体，其中培养基a包括wpm基本培养基、1～3mg/l的6-ba和25～35g/l的蔗糖；采用培养基b对白梅花外植体进行愈伤组织诱导培养及继代培养，得到白梅花愈伤组织，其中培养基b包括wpm基本培养基、1.5～4.5mg/l的2,4-d、0.05～2mg/l的iba和25～30g/l的蔗糖。
7.前述的一种梅花愈伤组织的制备方法中，所述培养基a为wpm基本培养基、1.5mg/l的6-ba和30g/l的蔗糖。
8.前述的一种梅花愈伤组织的制备方法中，所述培养基b为wpm培养基、3mg/l的2,4-d、0.1mg/l的iba和30g/l的蔗糖。
9.前述的一种梅花愈伤组织的制备方法中，所述白梅花无菌种子的培养方法包括以下步骤：
10.a、取白梅花种子洗净后用没过种子高度的无菌水浸泡，并盖上纱布，置于恒温培养箱中进行萌发预处理，直至白梅花种子表面出现明显裂痕，得a品；
11.b、将a品置于25～35℃的温水中浸泡，浸泡时间为20-30h，得b品；
12.c、将b品用3％的naclo溶液浸泡、震荡除菌，接着用75％的乙醇浸泡、无菌水冲洗，得c品；
13.d、将c品浸入0.1％的hgcl2中10min，之后用无菌水震荡冲洗5min，得白梅花无菌种子。
14.前述的一种梅花愈伤组织的制备方法中，白梅花无菌种子的萌发培养的时间为5-10天；愈伤组织的继代培养的时间为30～45天。
15.前述的一种梅花愈伤组织的制备方法中，愈伤组织的继代培养中，每15天更换一次培养基b。
16.与现有技术相比，本发明使用梅花种子，将白梅花的种子进行除菌处理，得到无菌种子，再通过特别改进配置的培养基及激素的加入，将无菌种子培养到无菌的愈伤组织，得到的愈伤组织生长旺盛，取得增加白梅花外植体产量、减少褐化率等目的，最终利用愈伤组织制备无菌梅花愈伤组织提取物。该方法益于降低白梅花提取物中的原生病毒及病菌。经测定，提取物中的总黄酮含量高，不低于5.5％，显著高于普通白梅花植株，经济效益高，安全性高，功效性强。
17.本发明具有去除白梅花携带的原生病毒及细菌，扩大白梅花产量的特点。
具体实施方式
18.下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
19.实施例：
20.一种梅花愈伤组织的制备方法，包括以下步骤：
21.(1)、处理白梅花无菌种子：
22.a、选取种壳无褶皱且饱满的白梅花种子，使用纯水充分洗净后放入烧杯中，盖上纱布，使用没过种子高度的无菌水浸泡(每48h更换新的无菌水)，置于恒温培养箱中进行萌发预处理(恒温培养箱的条件设置为光照、20℃)，直至该白梅花种子表面出现明显裂痕，此状态即为完成萌发预处理的状态，得a品。
23.b、将得a品置于25～35℃的温水中进行浸泡，浸泡时间为20-30h，得b品。此步操作为催芽处理。可显著提升种子的萌发率，并可提升愈伤组织的诱导效率。
24.优选温水的温度为30℃，种子萌发率可达到66.18％，愈伤组织诱导率可达79.60。
25.c、将b品用3％的naclo溶液浸泡，摇摆震荡20min进行表面除菌，再将浸泡好的种子使用无菌水冲洗干净，之后浸入75％的乙醇中30s，取出后使用无菌水冲洗1min，之后重复2-3次该操作，得c品；
26.d、将c品浸入0.1％的hgcl2中10min，之后用无菌水震荡冲洗5min，重复该操作三次。在滤纸上吸干水分，使用剪刀和镊子剥去种壳，切去子叶部分，即可制得白梅花无菌种子。
27.(2)、采用培养基a对得到的白梅花无菌种子进行萌发培养5-10天，得到白梅花无菌幼苗，在无菌操作台切去根部及叶片，所剩胚轴部分即为无菌的白梅花外植体。
28.培养基a的配方为：wpm基本培养基+1～3mg/l的6-ba+25～35g/l的蔗糖；
29.培养基a的配方优选为：wpm基本培养基+1.5mg/l的6-ba+30g/l的蔗糖。测试得到该培养基的种子萌发率达到70.03％。
30.(3)、白梅花愈伤组织的诱导：
31.采用培养基b对白梅花外植体进行愈伤组织诱导培养，生出新发的愈伤组织。培养基b的配方为：wpm基本培养基+1.5～4.5mg/l2,4-d+0.05～2mg/liba+25～30g/l蔗糖；
32.培养基b的配方优选为：wpm基本培养基+3mg/l2,4-d+0.1mg/liba+30g/l蔗糖。培养基b具有高诱导力，可对白梅花愈伤组织达到100％的诱导成功率。
33.(4)、白梅花愈伤组织的继代培养：
34.待白梅花外植体生出新发的愈伤组织后，切除外植体，将愈伤组织转入培养基b中进行放大继代培养。每15天更换培养基b，培养30天～45天，得到白梅花愈伤组织。白梅花愈伤组织的生长状况为：绿色，生长较旺盛，无褐化，出现小面积泛白，总黄酮含量不低于5.5％，总黄酮的收率达到最大。
35.因愈伤组织初期生长较迅速，且培育时间较短，故，愈伤组织的继代培养和愈伤组织的诱导培养采用同一个培养基配方。
36.培养基b通过控制外源性激素的浓度，达到了最大促进愈伤组织生长效率的作用。
37.(5)、白梅花愈伤组织的提取物制备：
38.取旺盛生长的白梅花愈伤组织，使用滤纸吸干表面水分，迅速进行冻干处理，该操作能够最大限度地保证愈伤组织中活性物质的活性与结构完整，有效提高提取物中芍药苷的含量与质量。冻干完成后将愈伤组织研磨成粉，使用75％丁二醇以料液比1:20(g：l)进行超声提取，温度控制为50℃，提取时间30min，制成提取物。
39.白梅花愈伤组织提取物的总黄酮测定方法：
40.1.标准曲线的绘制
41.在6支10ml比色管中，分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml的芦丁标准溶液，并使用30％乙醇分别补齐到5ml。之后在所有比色管中精确加入5％nano2溶液0.3ml，摇匀放置6min后，加入10％al(no3)3溶液0.3ml，摇匀放置6min，随后加入4ml浓度为1mol/l的naoh溶液，加水0.4ml，摇匀放置15min，以第一管为空白对照于510nm波长下测定吸光度，以吸光度对标准品含量作图，绘制标准曲线。
42.2.样品溶液的测定
43.取2ml配制好的白梅花提取物加到10ml比色管中，加入30％乙醇溶液使比色管内达到5ml，取1ml样品加0.3ml的5％nano2，摇匀，放置6min，加入0.3ml的10％al(no3)3，摇匀，放置6min，加4ml的1mol/lnaoh，加0.4ml水，摇匀，放置10min，在510nm波长下测吸光度，计算样品所含的黄酮含量。
44.经测定，此方法制备的白梅花愈伤组织提取物中总黄酮含量不低于5.5％。