一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法

1.本发明属于组织冻存技术领域，具体涉及一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法。


背景技术：

2.临床中，由创伤、感染、骨肿瘤切除等各种原因导致的骨缺损是骨科治疗的难题之一，骨移植是其首选的治疗方法。虽然自体骨移植是骨缺损修复的“金标准”，但因取骨导致患者创伤增加，且取骨量有限，限制了其在临床中的应用。同种异体骨来源广泛，产生排斥反应小，不存在二次伤害，解决了自体骨移植组织来源不足的问题，因而临床应用日渐广泛。而如何将从供体取下来的异体骨及骨软组织在体外进行长时间保存，且具有良好的细胞活性，成为众学者争相研究的焦点。
3.现有的冻存方法主要包括程序化法和玻璃化法。程序化法耗时长、细胞内易产生冰晶。而玻璃化法可以避免产生细胞内冰晶，且操作简单，成为近年来冻存研究的热点，然而影响其玻璃化法冻存效果的因素很多，目前还未形成统一规范的方法。特别是冻存液，其对冻存效果起到了至关重要的作用。低温保护剂是冻存液中的重要组成部分，能够保护细胞不被低温损伤。
4.然而，低温保护剂通常是具有毒性的物质。因此，如何设计冻存液的配方，以及如何设置冻存细胞的方法，尽可能降低低温保护剂对细胞的毒性是冻存细胞领域中重要的研究课题。中国发明专利申请“cn201910853381.0一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及冻存免疫细胞的方法”针对免疫细胞提出了一种冻存液和方法，通过合理的配方设计，尽可能地减少了低温保护剂二甲基亚砜或乙二醇的使用，降低了冻存液的毒性，提高了细胞存活率。
5.对于骨组织及骨软组织的冻存，现有的冻存液和冻存方法均存在毒性过强、细胞存活率较低的问题，因而还需要针对骨组织及骨软组织开发新的冻存液和冻存方法。


技术实现要素：

6.针对现有技术的缺陷，本发明提供一种用于骨组织和骨软组织的冻存液和冻存方法，其目的在于：通过优化冻存液的配方和冻存方法，降低冻存液的毒性，提供冻存细胞的存活率。
7.一种用于骨组织和/或骨软组织的冻存液，每1000ml所述冻存液由如下组分构成：
8.koh 80-120mmol、
9.hcl 40-80mmol、
10.nahco
3 10-50mmol、
11.nah2po
4 0.8-1.2mmol、
12.mgso
4 0.8-1.2mmol、
13.cacl
2 0.8-1.2mmol、
14.葡萄糖2-8mmol、
15.tes 80-120mmol、
16.1,2丙二醇80-120ml、
17.99.9％二甲基亚砜80-120ml，
18.余量为水。
19.优选的，每1000ml所述冻存液由如下组分构成：
20.koh 100mmol、
21.hcl 60mmol、
22.nahco3 30mmol、
23.nah2po4 1mmol、
24.mgso4 1mmol、
25.cacl2 1mmol、
26.葡萄糖5mmol、
27.tes 100mmol、
28.1,2丙二醇100ml、
29.99.9％二甲基亚砜100ml，
30.余量为去离子水。
31.优选的，所述冻存液的ph为7.3-7.5。
32.本发明还提供上述冻存液在冻存骨组织和/或骨软组织中的用途。
33.本发明还提供一种用于骨组织和/或骨软组织的冻存方法，包括如下步骤：
34.步骤1，配制上述冻存液；
35.步骤2，将待冻存的组织在冻存液中以0-4℃放置1-3小时；
36.步骤3，将待冻存的组织和冻存液逐步降温冷冻至-70～-90℃，放置8-12 小时，然后于液氮中保存。
37.优选的，步骤2中，将待冻存的组织放入冻存液中之前，先采用磷酸盐缓冲液清洗3-5次。
38.优选的，步骤3中，逐步降温的速度为-0.1～-0.3℃/min。
39.本发明中，“tes”为化合物2-[[三(羟甲基)甲基]氨基]乙磺酸。
[0040]
本发明针对骨组织和骨软组织优化了冻存液的组成，仅使用了二甲亚砜一种低温保护剂，将低温保护剂对细胞的损伤降至最低。此外，本发明还对冻存方法进行了改进，不进行快速的升温或降温，利用低温保护剂二甲基亚砜的毒性随温度的降低而减小的特点，在保存骨组织或骨软组织时，逐渐降温，最终使组织细胞在低温下载入足够多的二甲基亚砜，实现玻璃化。这进一步降低了二甲亚砜对细胞的损伤。可见，本发明不仅提供了一种新的用于骨组织和骨软组织冻存的冻存液，还将该冻存液对细胞的损伤降至最低，能够有效提高骨组织和骨软组织的冻存效果，延长体外骨组织和骨软组织的保存时间，以便于建立骨组织和骨软组织库，扩大同种异体骨移植在修复骨缺损的临床应用。因而，本发明具有很好的应用前景。
[0041]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0042]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说
明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0043]
图1为实验例1中冻存细胞的存活率的实验结果；
[0044]
图2为实验例1中按照实施例3的冻存液和冻存方法冻存的骨组织和软骨组织的he染色图像；
[0045]
图3为实验例1中按照对比例1的冻存液和冻存方法冻存的骨组织和软骨组织的he染色图像。
具体实施方式
[0046]
以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。
[0047]
实施例1
[0048]
本发明骨组织和骨软组织冻存液，每1000ml含koh 80-120mmol、 hcl 40mmol、nahco
3 10mmol、nah2po
4 0.8mmol、mgso
4 0.8mmol、 cacl
2 0.8mmol、葡萄糖2mmol、tes 80mmol、1,2丙二醇80ml、99.9％二甲基亚砜80ml，余量为去离子水。该骨组织和软组织冻存液的ph值为 7.3-7.5。分装，封口，0-4℃保存。
[0049]
实施例2
[0050]
本发明骨组织和骨软组织冻存液，本发明骨组织和骨软组织冻存液，每1000ml含koh 120mmol、hcl 80mmol、nahco
3 50mmol、nah2po
4 1.2mmol、mgso
4 1.2mmol、cacl
2 1.2mmol、葡萄糖8mmol、tes 120mmol、 1,2丙二醇120ml、99.9％二甲基亚砜120ml，余量为去离子水。该骨组织和软组织冻存液的ph值为7.3-7.5。分装，封口，0-4℃保存。
[0051]
实施例3
[0052]
本发明骨组织和骨软组织冻存液，每1000ml含koh 100mmol、 hcl 60mmol、nahco
3 30mmol、nah2po
4 1mmol、mgso
4 1mmol、cacl
2 1 mmol、葡萄糖5mmol、2-[[三(羟甲基)甲基]氨基]乙磺酸100mmol、1,2丙二醇100ml、99.9％二甲基亚砜100ml，余量为去离子水，该骨组织和软组织冻存液的ph值为7.3-7.5。分装，封口，0-4℃保存。
[0053]
采用本实施例的冻存液对骨组织和骨软组织进行冻存的方法如下：
[0054]
步骤1，配制上述冻存液；
[0055]
步骤2，将待冻存的组织先采用磷酸盐缓冲液清洗3-5次，然后在冻存液中以在4℃温育放置2小时；
[0056]
步骤3，将待冻存的组织和冻存液以-0.3℃/min的速度逐步降温冷冻至
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80℃，放置12小时，然后于液氮中保存。
[0057]
下面通过实验对本发明的技术效果作进一步的说明。
[0058]
实验例1
[0059]
1、实验方法
[0060]
采用实施例3冻存液(以10％二甲亚砜冻存液为对照组)和冻存方法对骨软骨组织进行冻存，考察冻存后的骨软骨组织的软骨细胞存活率并采集其he 染色图像。
[0061]
获得软骨细胞存活率的具体方法如下：将冻存管直接浸泡于37℃水浴中复温，取
出骨软骨块,制作切片，染色，然后在荧光显微镜下观察软骨细胞。软骨细胞存活率为绿染细胞数/(绿染细胞数+橙染细胞数)。
[0062]
2、实验结果
[0063]
冻存细胞的存活率如图1所示，从图中可以看到，对照组第2周细胞存活率为84％，第4周细胞存活率为79％，第6周细胞存活率为72％；发明组 (采用实施例3的冻存液和冻存方法)第2周细胞存活率为89％，第4周细胞存活率为84％，第6周细胞存活率为79％。可见本发明能够有效提升细胞存活率。
[0064]
按照实施例3的冻存液和冻存方法冻存的骨组织和软骨组织的he染色图像如图2所示，对照组的he染色图像如图3所示。从图中可以看到，对照组的关节面破坏明显，软骨细胞排列紊乱，聚集较多，软骨损伤明显，软骨下骨小梁结构减少、纤细、排列紊乱。关节软骨下骨小梁数量明显降低并导致其微结构损伤。而实施例3的实验组关节表面较完整，软骨细胞形态较为规则，软骨下骨小梁结构排列较为整齐。可见本发明的冻存液和冻存方法对骨组织及骨软组织的损伤更小，更有利于对它们进行长期保存。
[0065]
从上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了一种新的冻存液和冻存方法，本发明特别适用于骨组织和骨软组织的冻存，能够有效降低冻存液中低温保护剂对细胞的毒性，提高细胞存活率，减少对细胞和组织的损伤。从而有利于延长体外骨组织和骨软组织的保存时间，以便于建立骨组织和骨软组织库，扩大同种异体骨移植在修复骨缺损的临床应用。因而，本发明具有很好的应用前景。