一种细胞冻存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.干细胞治疗是目前迅猛发展的一种非常有前景的治疗多种疾病的手段，而该技术的发展需要干细胞库建设为支撑，细胞的冷冻保存是其中的关键技术之一。冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列的理化变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、ph值改变以及蛋白质变性等，严重时甚至会导致细胞死亡。因此，细胞冻存液需要添加甘油、dmso等保护剂成分，以降低冰点，在缓慢降温条件下，使细胞内水分渗出细胞外，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。冻存液的优劣对冻存后细胞的质量有着举足轻重的影响。
3.间充质干细胞是一种多能的，具有自我更新能力的细胞，最早从骨髓中发现，可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等组织。现在间充质干细胞不仅可以从骨髓中分离出来，也可从脂肪、脐带、胎盘等组织中分离出来。与骨髓相比，脐带来源广泛，便于取材，对供者不造成创伤以及无伦理道德制约，因此，人脐带间充质干细胞有着更加理想的发展前景。
4.人脐带间充质干细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞。目前，现有技术中普遍使用的细胞冻存液采用二甲基亚砜(dmso)为保护剂。
5.dmso是细胞保存中最常用的渗透型冷冻剂，dmso可渗入细胞内，使水分渗出，降低细胞受冻存过程中形成的冰晶的损伤程度，但dmso存在一定的毒性作用，能够与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性。因此，现有的冻存液(含10％dmso的完全培养基)在保持细胞活力及复苏后增殖活性方面仍存在显著的不足。因此，寻找新的配方或联合其它成分，降低或消除dmso对间充质干细胞(msc)损害是目前一个重要的研究方向。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用，将冻存液用于冻存间充质干细胞，降低或消除dmso对间充质干细胞(msc)损害。本发明提供的冻存液能很好地保持细胞存活率和增殖活性。
7.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明的第一个目的在于提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液由多种成分组成，具体包括以下组分：imdm基础培养基、dmso(二甲基亚砜)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、盐酸吡哆醛、肌醇、腐胺、血清素、巯基乙醇、花生四烯酸、胆固醇、儿茶素、氯化胆硷、泛酸钙、烟酰胺、海藻糖、聚氧丙烯聚氧乙烯、吐温80、白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、fisetin漆黄素、piperlongumine荜茇酰胺、生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
9.优选的，所述冻存液还包括氨基酸、激素、抑制剂、细胞因子、无机化合物和维生
素；
10.所述氨基酸包括谷氨酸、精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种；
11.所述激素为氢化可的松、黄体酮、地塞米松和胃动素中的至少一种；
12.所述抑制剂包括rock1抑制剂y-27632、gsk-3抑制剂laduviglusib、alk-5抑制剂a 83-01、dasatinib达沙替尼、bcl-xl抑制剂a1331852和mek抑制剂pd0325901中的至少一种；
13.所述细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子、人内皮素-1、转化生长因子-β1、白细胞介素-1、白细胞介素-6、干细胞生长因子、肝细胞生长因子和白血病抑制因子中的至少一种；
14.所述无机化合物包括cuso4、znso4、na2seo3、fecl3、na2sio3、fecl3、na2sio3、mnso4、nh4vo3、niso4、sncl2、alcl3、agno3、ba(c2h3o2)2、kbr、cdcl2、cocl2、crcl3、naf、geo2、钼酸、ki和碳酸氢钠中的至少一种；
15.所述维生素包括抗坏血酸、盐酸硫胺素、核黄素和叶酸中的至少一种。
16.本发明的第二个目的在于提供一种细胞冻存液，按照终浓度的组成包括：4-羟乙基哌嗪乙磺酸0.5-3mm/l、盐酸吡哆醛1-3mg/l、肌醇0.05-0.2mg/l、腐胺15-25mg/l、血清素0.5-1.5mg/l、巯基乙醇0.05-0.2μm/l、花生四烯酸40-60μg/l、胆固醇150-250μg/l、儿茶素40-60mg/l、氯化胆硷0.005-0.02mg/l、泛酸钙0.05-0.2mg/l、烟酰胺0.05-0.2mg/l、海藻糖8-12mm/l、聚氧丙烯聚氧乙烯60-100mg/l、吐温80 1-3mg/l、白蛋白1-3g/l、转铁蛋白70-130mg/l、纤维连接蛋白400-600μg/l、fisetin漆黄素80-120μm、piperlongumine荜茇酰胺0.05-0.2μm、生育酚乙酸酯400-600μg/l、亚油酸5-15μg/l、亚麻酸160-240μg/l、豆蔻酸8-12μg/l、油酸150-250μg/l、棕榈酸5-15μg/l、棕榈油酸180-220μg/l和硬脂酸150-250μg/l；溶剂为imdm基础培养基。
17.优选的，所述冻存液还包括氨基酸、激素、抑制剂、无机化合物和维生素；按照终浓度的组成，所述氨基酸包括谷氨酸25-35mm、精氨酸0.5-2mm、胱氨酸0.005-0.02mm、组氨酸0.5-1.5mm、异亮氨酸0.005-0.02mm、亮氨酸0.5-1.5mm、赖氨酸0.005-0.02mm、甲硫氨酸0.5-1.5mm、苯丙氨酸0.005-0.02mm、苏氨酸0.5-1.5mm、色氨酸0.005-0.02mm、酪氨酸0.5-1.5mm、缬氨酸0.005-0.02mm、甘氨酸0.1-0.3mm、丙氨酸0.005-0.02mm、天冬酰胺0.1-0.3mm、天冬氨酸0.005-0.02mm、脯氨酸0.005-0.02mm和丝氨酸0.1-0.3mm；
18.所述激素为氢化可的松80-120μg/l、黄体酮0.05-0.15μg/l、地塞米松0.5-1.5nm/l和胃动素7-12μm/l；
19.所述抑制剂包括rock1抑制剂y-27632 1-5μm、gsk-3抑制剂laduviglusib
20.35-65μm、alk-5抑制剂a83-01 30-70μm、dasatinib达沙替尼0.0005-0.002μm、bcl-xl抑制剂a1331852 80-120μm和mek抑制剂pd0325901 0.005-0.02μm中的至少一种；
21.所述细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子80-120ng/ml、人内皮素-18-12ng/ml、转化生长因子-β1 0.005-0.02ng/ml、白细胞介素-1 5-15μg/l、白细胞介素-6 0.5-2μg/l、干细胞生长因子3-7ng/ml、肝细胞生长因子1-3ng/ml和白血病抑制因子2.5-7.5ng/ml；
22.所述无机化合物包括cuso
4 10-30μg/l、znso
4 80-120μg/l、na2seo30.005-0.02μ
g/l、fecl
3 1100-1300μg/l、na2sio
3 75-125μg/l、fecl
3 1100-1300μg/l、na2sio
3 80-120μg/l、mnso
4 15-25μg/l、nh4vo
3 10-30μg/l、niso40.005-0.02μg/l、sncl
2 15-25μg/l、alcl
3 0.005-0.02μg/l、agno
3 10-30μg/l、ba(c2h3o2)
2 0.005-0.02μg/l、kbr 10-30μg/l、cdcl
2 0.005-0.02μg/l、cocl210-30μg/l、crcl
3 0.005-0.02μg/l、naf 15-35μg/l、geo
2 0.005-0.02μg/l、钼酸0.005-0.02μg/l、ki 15-30μg/l和碳酸氢钠10-30g/l；
23.所述维生素包括抗坏血酸80-120mg/l、盐酸硫胺素1-3mg/l、核黄素0.05-0.2mg/l和叶酸1-3mg/l；溶剂为imdm基础培养基。
24.优选的，所述冻存液还包括dmso(二甲基亚砜)，所述dmso(二甲基亚砜)占所述冻存液的体积百分含量为10％。
25.优选的，按照终浓度的组成配料，将所有组分用imdm基础培养基溶解，最后加入dmso(二甲基亚砜)，即得。
26.本发明的第三个目的在于提供一种如上述所述冻存液在冻存细胞中的应用。
27.本发明的第四个目的在于提供一种如上述所述冻存液在制备冻存细胞的产品中的应用。
28.本发明的第五个目的在于提供一种如上述所述冻存液在保持冻存复苏后细胞的活性中的应用或在制备保持冻存复苏后的细胞的活性的产品中的应用。
29.优选的，所述细胞为人间充质干细胞。
30.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
31.本发明提供的冻存液能够更好地维持人脐带间充质干细胞的生物学功能，使人脐带间充质干细胞冻存复苏后具有高的存活率，同时保持更好的分化能力；与现有的冻存液(含10％dmso的完全培养基)相比，本发明方法制备的冻存液，能更好地保持细胞存活率和增殖活性。
附图说明
32.图1为实验组a组72h细胞融合度实验结果图；
33.图2为实验组b组72h细胞融合度实验结果图；
34.图3为实验组c组72h细胞融合度实验结果图；
35.图4为实验组d组72h细胞融合度实验结果图；
36.图5为对照组72h细胞融合度实验结果图。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例对本发明做进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
38.所述gsk-3抑制剂laduviglusib购自medchemexpress(mce)，型号hy-10182；
39.所述alk-5抑制剂a 83-01购自medchemexpress(mce)，型号hy-10432；
40.所述dasatinib达沙替尼购自abmole，型号m1701；
41.所述白血病抑制因子购自medchemexpress(mce)，型号hy-p7049；
42.所述mek抑制剂pd0325901购自medchemexpress(mce)，型号hy-10254；
43.所述fisetin漆黄素购自medchemexpress(mce)，型号hy-n0182；
44.所述piperlongumine荜茇酰胺购自medchemexpress(mce)，型号hy-n2329；
45.所述bcl-xl抑制剂a1331852购自medchemexpress(mce)，型号hy-19741；
46.所述地塞米松购自medchemexpress(mce)，型号hy-14648；
47.所述胰酶为胰蛋白酶，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号15090046。
48.实施例1一种干细胞的冻存液
49.按照终浓度的组成配料，将下表1所示冻存液所有组分用imdm基础培养基溶解，最后加入冻存液体积分数10％的dmso(二甲基亚砜)，即得。
50.表1实施例1间充质干细胞冻存液组分表
51.52.[0053][0054]
实施例2细胞冻存
[0055]
细胞冻存包括以下步骤：
[0056]
1)p2代细胞培养约72h，镜下观察细胞融合度达到85％以上时进行收获；
[0057]
2)将培养瓶中的培养液收获至t175培养瓶中，做为消化终止液，将每个培养瓶中加入10ml生理盐水清洗液。往洗涤后的t175培养瓶中各加入5ml0.125％胰酶，轻摇培养瓶，使培养瓶中胰酶能迅速浸润到培养瓶底面，消化1.5min后立即向培养瓶中加入15ml终止液终止消化；
[0058]
3)将消化后的细胞悬液收获到225ml离心管中，培养瓶用10-15ml的生理盐水依次洗涤，洗涤贴附在培养瓶中的残留细胞，将洗涤的悬液收获至225ml离心管中，300g、10min离心；
[0059]
4)离心后，去除上清，用5-10ml的生理盐水混匀管底细胞，将所有细胞平均收集到50ml离心管中，用生理盐水将各组配平定容至相同体积，300g、10min离心。离心之后弃上清，将各管中细胞沉淀分别用10ml完全培养基混匀，取样计数；
[0060]
5)根据细胞数量添加完全培养基，调整细胞密度为4
×
107/ml，制备细胞悬液；
[0061]
6)将实施例1配制的冻存液和细胞悬液按1：1的体积比例进行混合，调整细胞密度为2
×
107/ml，将冻存管用封口膜封口，迅速转入已预先放置4℃30min的程序降温盒中，以确保获得最佳的冻存效果，然后转入-80℃冰箱，过夜后转入液氮中长期保存。
[0062]
实施例3细胞复苏
[0063]
将冻存后的人脐带间充质干细胞进行细胞复苏，包括以下步骤：
[0064]
将实施例2所述冻存管从液氮取出，放入37摄氏度水浴锅内，轻晃，使冻存的细胞悬液融化，操作时间不要超过1分钟，将冻存管中细胞悬液加入10ml完全培养基中，混匀，300g、10min离心，去上清，细胞沉淀用完全培养基重悬，接种1
×
106个细胞至t175培养瓶进行培养。
[0065]
对比例1一种干细胞的冻存液
[0066]
与实施例1相比，本对比例没有添加地塞米松，其他与实施例1相同。
[0067]
对比例2一种干细胞的冻存液
[0068]
与实施例1相比，本对比例没有添加y-27632，其他与实施例1相同。
[0069]
对比例3一种干细胞的冻存液
[0070]
与实施例1相比，本对比例没有laduviglusib，其他与实施例1相同。
[0071]
实验一 人脐带间充质干细胞冻存液效果验证
[0072]
取3根不同脐带培养的细胞，按照实施例2所述细胞冻存步骤进行细胞冻存，每支冻存管的细胞数量为2
×
107/支，进行冻存液效果验证，设置实验组和对照组进行实验，实验组设置a、b、c和d组，每组设3个复孔。其中，a组实验组为采用本发明实施例1制备的冻存液进行冻存；b组实验组为采用本发明对比例1制备的冻存液进行冻存；c组实验组为采用本发明对比例2制备的冻存液进行冻存；d组实验组为采用本发明对比例3制备的冻存液进行冻存；对照组为采用常规“含10％dmso+90％完全培养基”的细胞冻存液进行冻存。按照实施例3所述的实验步骤进行消化收集复苏的细胞，检测复苏后细胞的细胞活率和回收率，同时，对复苏后的细胞进行传代培养，检测24h时细胞贴壁率和72h时的细胞融合度。
[0073]
(一)冻存细胞复苏后细胞活率和回收率实验
[0074]
将20μl细胞悬液和20μl台盼蓝染色液(2
×
)混匀，染色3分钟，显微镜下检测细胞活率。其中，细胞存活率的计算公式为：细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数
×
100％；所述细胞回收率的计算公式为：回收率＝复苏后活细胞数量/冻存时细胞数量
×
100％；实验结果如下表所示：
[0075]
表2复苏后活细胞总数结果表
[0076][0077][0078]
表3复苏后细胞活率结果表
[0079][0080]
表4复苏后细胞细胞回收率结果表
[0081]
[0082][0083]
由此可知，采用本发明的间充质干细胞冻存液进行冻存复苏后实验组的细胞的存活率和回收率，远远大于对照组采用常规“含10％dmso+90％完全培养基”的细胞冻存液进行冻存复苏后的细胞的存活率和回收率。
[0084]
(二)冻存细胞复苏后培养24h后细胞贴壁率实验
[0085]
冻存细胞复苏后，培养24h后计算细胞贴壁率。所述24h时细胞贴壁率的计算公式：细胞贴壁率(％)＝收获细胞数量/接种细胞数量
×
100％。
[0086]
表5细胞复苏后培养24h细胞贴壁率结果表
[0087]
[0088][0089]
由此可知，冻存细胞复苏后，培养24h后计算细胞贴壁率，采用本发明的间充质干细胞冻存液进行冻存复苏后实验组的细胞培养24h后，细胞贴壁率远远大于对照组的数据。
[0090]
(三)冻存细胞复苏后培养72h细胞融合度实验
[0091]
按照实施例2-3所述实验步骤将实施例1和对比例1-3所述人脐带间充质干细胞冻存1个月后进行细胞复苏，传代培养72h后镜下观察拍照，记录细胞融合度。所述72h时的细胞融合度是指细胞培养至72h时显微镜下观察评估细胞融合度。
[0092]
实验结果如图1-5所示，实验组a组细胞复苏传代培养后细胞生长速度最快，长势最好，在72h后达到90％以上融合度，表明可以在复苏后培养72h即可进行传代；b、c、d组的细胞融合度次之，分别为86％、84％和82％；然而，对照组72h细胞融合度较低，仅有80％。
[0093]
综上所述，可知，本发明冻存液的成分能够更好地维持人脐带间充质干细胞的生物学功能，使人脐带间充质干细胞冻存复苏后具有高的存活率，同时保持更好的分化能力。与现有的冻存液(含10％dmso的完全培养基)相比，本发明方法制备的冻存液，能更好地保持细胞存活率和增殖活性。因此，本发明的细胞冻存液具有很好的保存细胞增殖活性等显著的效果。
[0094]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。