外源硒钼组合物在缓解烟草铬胁迫中的应用的制作方法

1.本发明涉及农业技术领域，具体地涉及外源硒钼组合物在缓解烟草铬胁迫的应用。


背景技术：

2.铬(cr)是一种植物有毒金属。铬在植物组织中的过度沉积会引起严重的植物毒性，如生长和生物量减少、叶绿素降解、养分吸收延迟、活性氧化物质(ros)的过度产生、抗氧化防御机制的紊乱和细胞超微结构的破坏，同时铬毒性也会抑制植物中各种蛋白质的功能和调节，并导致植物组织中的染色体畸变。
3.铬是一种重金属污染物，能够直接影响烟草细胞自由水的迁移，从而引起烟草植株失水、萎蔫，其对烟草的危害不仅体现在对烟草生长发育过程中各方面的胁迫，还包括铬对烟草品质的影响。同时重金属铬也会对卷烟制品的安全性造成威胁，烟草易富集铬,并且卷烟烟叶中的铬在抽吸时可随主流烟气进入人体,进而危害吸食者健康。
4.现有研究中，外源硒、钼单独施用缓解烟草重金属胁迫的响应机制已有研究，但外源硒钼组合物缓解烟草幼苗铬胁迫的机理尚不明确。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种外源硒钼组合物在缓解烟草铬胁迫中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过使用外源硒钼组合物，改善烟草在铬胁迫下的生长状况的同时，增强烟草的抗重金属胁迫能力。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.技术方案一：本发明提供了外源硒钼组合物在提高铬胁迫下烟草的抗性中的应用。
8.进一步地，外源硒钼组合物中的外源硒为四价硒，外源钼为六价钼。
9.进一步地，四价硒为亚硒酸钠，六价钼为钼酸钠。
10.进一步地，亚硒酸钠的使用浓度为2μmol/l；钼酸钠的使用浓度为1μmol/l。
11.技术方案二：本发明提供了缓解烟草幼苗铬胁迫的表现包括如下任意一种：提高铬胁迫下烟草幼苗的生物量；缓解铬对烟草幼苗的光合作用抑制；改善烟草的抗氧化系统；提高烟草对铬的耐受性；减轻烟草由铬引起的细胞损伤；改变烟草根和叶中铬的亚细胞分布。
12.技术方案三：本发明提供了外源硒钼组合物在提高铬胁迫下烟草的抗性中的应用方法，包括将外源硒钼组合物与烟草营养液共同施用。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.(1)硒钼互作能够提高铬胁迫下烟草幼苗的生物量，可以显著缓解cr对烟草幼苗的光合作用抑制，se和mo可以共同改善抗氧化系统，提高对cr的耐受性，从而降低cr对烟草幼苗生长的毒害作用。
15.(2)硒钼的单独使用与组合使用均可以缓解由cr引起的薄壁组织形态的损伤，其中硒钼的组合使用显著减轻了由cr引起的细胞损伤，尤其是薄壁细胞的形态。
16.(3)硒钼的单独使用与组合使用均可以缓解cr处理下对根茎和叶片细胞超微结构的负面影响，其中硒钼的组合使用显著减轻了cr对叶片细胞的损伤，细胞形态相对正常，细胞组织结构相对完整。
17.(4)外源硒钼组合物对cr处理下烟草幼苗cr亚细胞分布的影响
18.外源硒钼的使用改变了烟草幼苗根和叶中cr的亚细胞分布，在烟草幼苗叶中，cr主要存在于细胞壁中，少部分分布在细胞质和细胞器中，se和se+mo的添加分别使细胞器中的cr积累量增加了70％和97.8％；在烟草幼苗根中，cr主要存在细胞壁中和细胞器中，只有少部分存在于细胞质中，se和se+mo的添加分别使根细胞壁中cr的积累降低了63.7％和66.8％。
19.(5)利用本发明公开的外源硒钼组合物，能够改善烟草在铬胁迫下的生长状况，增强烟草的抗重金属胁迫能力。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是cr胁迫下不同处理组烟草幼苗生物量的影响，a为不同处理组幼苗的株高，b为不同处理组的叶干重，c为不同处理组的根长，d为不同处理组的根干重；
22.图2是cr胁迫下不同处理组烟草幼苗中叶绿素含量的影响，a为不同处理组的叶绿素a含量，b为不同处理组的叶绿素b含量，c为不同处理组的总叶绿素t的含量；
23.图3是cr胁迫下不同处理组烟草幼苗叶中抗氧化酶活性的影响，a为不同处理组的幼苗叶的pod活性，b为不同处理组的幼苗叶的sod活性；c为不同处理组的幼苗叶的cat活性；d为不同处理组的幼苗根的pod活性，e为不同处理组的幼苗根的sod活性；f为不同处理组的幼苗根的cat活性；
24.图4是cr胁迫下不同处理组的根茎横截面的解剖图，a为对照组的幼苗根茎超微结构图，b为cr处理组的幼苗根茎超微结构图，c为cr+se处理组的幼苗根茎超微结构图，d为cr+mo处理组的幼苗根茎超微结构图，e为cr+mo+se处理组为幼苗根茎超微结构图；
25.图5是cr胁迫下不同处理组的叶片透射电镜图，a为对照组的叶片透射电镜图，b为cr处理组的叶片透射电镜图，c为cr+se处理组的叶片透射电镜图，d为cr+mo处理组的叶片透射电镜图，e为cr+mo+se处理组的叶片透射电镜图；
26.图6是烟草幼苗的叶和根细胞的三个亚细胞部分(即细胞壁(fcw)、细胞器(fo)和细胞质(fs))中cr含量的分析图。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.具体的实施方式：
33.原材料的选取：选取全国广泛种植的烟草品种云烟87。铬选用重铬酸钾，使用浓度为50μmol/l。
34.试剂来源：亚硒酸钠、钼酸钠、重铬酸钾固体粉剂购置于郑州艾克姆化工有限公司，含量为99％的分析纯试剂。
35.培育方法：(1)烟草种子前处理：先用10％的次氯酸钠溶液消毒十分钟，再用超纯去离子水后反复冲洗，并浸种8h；(2)将处理后的烟草种子点入含有网格海绵的去离子水育苗盘中，每个网格点2-3粒种子，然后置于28℃的培养箱中进行避光发芽；(3)种子萌发后约三周，用镊子将长出2片子叶的烟草幼苗移栽到市售的蛭石盒(蛭石的化学成分为sio
2 al2o
3 fe2o
3 mgo h2o)中，移至人工气候室培养，先用1/4hoagland营养液浇苗，培养一周后改用1/2hoagland营养液；(3)待烟草幼苗长至4片1心时，选取形态长势基本一致的健壮烟苗，将健壮幼苗移植至盛有1/2hoagland营养液的5l水培盒中，每3d更换一次营养液，并放置于生长条件为14h光照，10h黑暗，40％-60％相对湿度，白天28
±
2℃、夜间20
±
2℃，光照强度400μmol
·
m-2
s-1
的生长室中培养3周；(4)挑选长势一致的健壮烟苗进行移栽，第1组移栽至不添加任何元素的全营养液中栽培，作为对照(ck)；第二组移栽至添加铬的全营养液中栽培，作为单独施用铬组(cr)，其中cr浓度为50μmol/l；第三组移栽至添加铬和硒的营养液中栽培(cr+se)，其中cr浓度为50μmol/l，se浓度为2μmol/l；第四组移栽至添加铬和钼的营养液中栽培(cr+mo)，其中cr浓度为50μmol/l，mo浓度为1μmol/l；第五组移栽至添加cr、se、mo的营养液中，其中cr浓度为50μmol/l，mo浓度为1μmol/l，se浓度为2μmol/l。每组设3个重复，每个重复4株烟苗，在处理一周后取第三片真叶待测。其中cr来自k2cr2o7；se来自na2seo3；mo来自na2moo4·
2h2o。
36.农艺性状及生物量测定：用软皮尺测量株高，测量部位为根尖顶端起至3cm。
37.烟草样品各部位鲜重测定：每个处理取3株待测烟草幼苗，蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，称取鲜重。然后将称取鲜重以后的植株置于105℃烘箱中杀青1h，在80℃
下烘干至恒重称取干重。
38.生理生化测定测定方法：准确称取0.5g鲜叶，采用80％丙酮提取，使用分光光度计(uv-1750,shimadzu,kyoto,japan)测定分别在波长663nm，646nm和470nm的吸光值。叶绿素a(ca)，叶绿素b(cb)和总叶绿素t(ct)，每个处理重复3次。含量的计算参考lichtenthaler和wellburn的方法(lichtenthaler and wellburn 1982)如下所示：
39.ca＝12.21a663-2.81a646
40.cb＝20.13a646-5.03a663
41.ct＝(1000a470-3.27ca-104cb)/229
42.采用氮蓝四唑(nbt)光还原比色法测定超氧化物歧化酶(sod)活性；
43.采用愈创木酚法测定过氧化物酶(pod)活性；
44.采用过氧化氢分解法测定过氧化氢酶(cat)活性；
45.采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(mda)含量；
46.采用zhang等方法(zhang s,liu s,zhang j,et al.synergistic anti-oomycete effect of melatonin with a biofungicide against oomycetic black shank disease[j].journal of pineal research,2018:12492)检测烟草幼苗叶片的超微结构。
[0047]
采用liu等(liu,k.,gu,z.,2009.selenium accumulation in different brown rice cultivars and its distribution infractions.j.agric.food chem.57,695
–
700)的方法，测定烟草幼苗根叶中的铬浓度。
[0048]
采用wang等(wang,x.,liu,y.,zeng,g.,chai,l.,song,x.,min,z.,xiao,x.,2008.subcellular distribution and chemical forms of cadmium in bechmeria nivea(l.)gaud.environ.exp.bot.62(3),389
–
395)的方法，测定烟草幼苗根叶的亚细胞结构。
[0049]
实施例1
[0050]
外源硒钼组合物的应用对铬胁迫下烟草幼苗生物量的影响，详见图1。利用上述农艺性状及生物量测定和烟草样品各部位鲜重测定的方法，分别对上述五组烟草幼苗的株高、根长、叶干重和根干重进行测量。
[0051]
由图1可以看出，cr胁迫显著减少了株高、根长、叶干重和根干重，而se、mo和se+mo的使用均减轻了cr对烟草幼苗生长的抑制作用，与ck相比，cr处理显着降低了株高和根长16.8％和42.6％，烟草幼苗叶干重和根干重分别降低了28.0％和38.9％。se和mo的添加显著促进铬胁迫下烟草幼苗的生长，其中se和mo组合的作用最为明显，与cr处理相比，se和mo的添加显著增加了株高6.3％和6.8％，根长分别增加了47.8％和32.4％，详见图1a和图1c。此外，se和mo的组合使株高和根长分别增加了34.9％和59.2％，详见图1a和图1c。叶干重和根干重分别增加了36.0％和56.8％，详见图1b和图1d。
[0052]
由此可以看出，cr胁迫下，应用外源硒钼组合物后，可以显著提高烟草幼苗的生物量。
[0053]
实施例2
[0054]
外源硒钼组合物的应用对cr胁迫下烟草幼苗中叶绿素含量的影响，详见图2。利用上述生理生化测定方法，分别对上述五组的烟草进行叶绿素含量进行测定。
[0055]
光合作用和其他生理过程对重金属高度敏感，低浓度的cr也会抑制植物的光合作
用。如图2所示，铬胁迫显著降低了烟草幼苗的叶绿素含量，分别降低了41.0％、30％、和38％。研究表明，单独添加硒钼后均可以增加铬胁迫下叶绿素的含量，se、mo的添加分别使叶绿素a含量显著增加了26.7％、36.2％，叶绿素b含量显著增加了34.7％、101.1％，叶绿素t含量分别显著增加了38.1％、33.9％，与单独添加se或mo相比，se和mo的组合处理显著增加了铬胁迫下烟草幼苗中的叶绿素的含量，分别使叶绿素a、叶绿素t的含量增加了68.1％和66.1％(详见图2中的a、b和c)。
[0056]
由此可以看出，cr胁迫下，应用外源硒钼组合物后，可以显著缓解cr对烟草幼苗的光合作用抑制。
[0057]
实施例3
[0058]
外源硒钼组合物的应用对cr胁迫下烟草幼苗中抗氧化酶活性的影响，详见图3。分别采用上述的氮蓝四唑(nbt)光还原比色法测定超氧化物歧化酶(sod)活性；采用愈创木酚法测定过氧化物酶(pod)活性；采用过氧化氢分解法测定过氧化氢酶(cat)活性；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(mda)含量。其中图3中的a、b、c分别为不同处理组的幼苗叶的pod活性、sod活性和cat活性；图3中的d、e、f分别为不同处理组的幼苗根的pod活性、sod活性和cat活性。抗氧化系统在植物对环境胁迫的反应中起着至关重要的作用，如图3所示，铬胁迫下sod、pod和cat活性分别降低了15.2％、7.3％、8.5％，外源硒钼的添加显着增强sod、pod、cat的酶活性。与单独应用se或mo相比，se和mo的组合应用在增加抗氧化酶活性方面表现出更好的缓解作用。
[0059]
由此得出，se和mo可以共同改善抗氧化系统，提高对cr的耐受性，从而降低cr对烟草幼苗生长的毒害作用。
[0060]
实施例4
[0061]
外源硒钼组合物的应用对烟草茎秆横截面解剖图的影响，详见图4。采用上述检测烟草茎秆横截面解剖图方法分别对5组方案进行测定。
[0062]
烟草茎秆横截面的解剖图分析表明，根由一个中央区(详见图4中的“s”)，和一个三层薄壁组织皮质区构成(皮质区分别为图4中的“en”“ct”和“ep”)，并以带有毛细胞的表皮为界，详见图4a。对不同的处理下的烟草茎秆横截面的解剖图进行对比观察。在对照组(详见图4a)中，烟草茎秆的薄壁组织有规律的排列，细胞形态饱满。在cr胁迫下，烟草茎秆的薄壁组织排列不规则并出现细胞破碎、空泡细胞的现象(详见图4b)。硒钼的分别单独使用(详见图4c和4d)与组合使用(详见图4e)均可以缓解由cr引起的薄壁组织形态的损伤，其中硒钼的组合使用显著减轻了由cr引起的细胞损伤，尤其是薄壁细胞的形态，详见图4e。
[0063]
实施例5
[0064]
外源硒钼组合物的应用对烟草叶片组织结构的影响。图5是cr胁迫下不同处理组的烟草幼苗叶片透射电镜图，a为对照组的叶片透射电镜图，b为cr处理组的叶片透射电镜图，c为cr+se处理组的叶片透射电镜图，d为cr+mo处理组的叶片透射电镜图，e为cr+mo+se处理组的叶片透射电镜图。采用上述检测烟草幼苗叶片的超微结构的方法分别对5组方案进行测定。
[0065]
对不同处理下烟草幼苗叶片透射电镜图的对比分析，详见图5。可以看出，对照组中烟草幼苗的叶肉细胞中叶绿体贴壁分布，呈椭圆形或者长梭形，形态饱满，结构完全，具有完整的内外膜结构和片层系统，类囊体堆叠整齐，基粒规则有序，呈平行排列，基粒与基
质片层之间界限清晰，内含淀粉粒较小；cr处理下严重影响了叶片细胞超微结构构型和叶绿体的完整性，细胞形态异常，呈不规则形状，细胞膜与细胞壁部分分离，叶绿体外膜及类囊体膜肿胀，形成较大间隙；硒钼的单独使与组合使用均可以缓解cr处理对叶片超微结构的负面影响。其中硒钼的组合使用显著减轻了cr对叶片超微结构的损伤，在细胞壁附近观察到具有椭圆形的叶绿体，其中包含相对完整的颗粒堆叠和薄片。
[0066]
实施例6
[0067]
外源硒钼组合物对cr处理下烟草幼苗cr亚细胞分布的影响，详见图6。采用上述测定烟草幼苗根叶的亚细胞结构的方法分别对5组方案进行测定。
[0068]
重金属的亚细胞分布可能是植物中最主要的重金属解毒机制之一，它通过区室化影响重金属耐受性和解毒能力。烟草幼苗的叶和根细胞被分成三个亚细胞部分(即细胞壁(fcw)、细胞器(fo)和细胞质(fs))。对这三种亚细胞成分中cr含量的分析表明，在烟草幼苗的叶中，cr主要存在于细胞壁中，少部分分布在细胞质和细胞器中，se和se+mo的添加分别使细胞器中的cr积累量增加了70％和97.8％；在烟草幼苗的根中，cr主要存在细胞壁中和细胞器中，只有少部分存在于细胞质中，se和se+mo的添加分别使根细胞壁中cr的积累降低了63.7％和66.8％。
[0069]
由此看出，cr胁迫下，外源硒钼的使用改变了烟草幼苗根和叶中cr的亚细胞分布。
[0070]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。