一种苹果砧木重度玻璃化组培苗恢复正常生长的方法与流程

1.本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种苹果砧木重度玻璃化组培苗恢复正常生长的方法。


背景技术：

2.在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是p.debergh(1981)首先命名的"玻璃化
″
(vitrification)，是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。
3.玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低，角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低。所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料，生根困难。移栽后也很难成活。植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50％以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费。所以试管苗玻璃化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。在科学研究和工厂化生产上大多将出现玻璃化的植株剔除丢弃，这使得组培苗生产增加了较大成本，也给相关科学研究带来极大风险。因此对于玻璃化组培苗的恢复研究具有十分重要的意义。
4.现有技术中，枸杞玻璃化组培苗恢复技术一文中公开了以枸杞不同程度玻璃化组培苗为试材，采用组织培养法，研究了不同基本培养基、外源添加物、添加聚丙烯酰胺、改变培养条件及玻璃化苗脱水处理在玻璃化组培苗恢复中的作用，探索出最佳的枸杞玻璃化组培苗恢复方法。结果表明，聚丙烯酰胺对枸杞玻璃化的组培苗有明显的逆转效果，逆转后的组培苗生长良好。经过脱水处理后，玻璃化苗明显得到恢复。
5.公开号为cn 112106659 a的中国发明专利公开了“一种菊花玻璃化组培苗复壮的方法”，该方法是以中度玻璃化植株，剪成1.0-1.5cm小段后接入玻璃化苗复壮培养基中进行复壮培养，通过对培养基6-ba浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度、活性炭添加量及封口材料与甘菊和长裂太行菊玻璃化苗复壮的关系进行了研究，探索一种控制菊花试管苗玻璃化的组培复壮方法，能够有效提高菊花试管苗增殖系数、良好的解决菊花增殖培养过程中发生的组培苗玻璃化现象。发明人在实验过程中也做了相关的实验，但是实验结果却不尽人意，对于苹果砧木组培苗，凡出现玻璃化的植株再次转接至增殖培养基上，新增殖出的植株依然表现为透明肿胀状态，一般不能有效恢复其玻璃化。
6.公开号为cn 107278897 a的中国发明专利公开了“一种金线莲玻璃化组培苗复苏的方法”，该方法同样是通过对培养基、培养条件进行研究，快速复苏金线莲玻璃化组培苗并增殖金线莲无菌苗。
7.本发明的发明人在苹果砧木组织培养的研究过程中发现，同样会存在组培苗出现
玻璃化的情况，对研究材料造成了极大的浪费，并且还会耽误实验的进程。因此，对苹果玻璃化组培苗的复壮同样具有十分重要的价值。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种苹果砧木重度玻璃化组培苗恢复正常生长的方法，该方法能够有效地使严重玻璃化植株恢复正常生长，从而降低生产和研究成本。
9.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
10.一种苹果砧木重度玻璃化组培苗恢复正常生长的方法，所述方法包括如下步骤：
11.(1)采用苹果砧木外植体茎段进行接种，启动培养，继而进行增殖培养，选取增殖培养过程中分化出的重度玻璃化组培苗；
12.(2)将重度玻璃化组培苗转接于增殖培养基上，在光照培养室内继续培养20～25d，此时，增殖形成的再生芽依然为严重玻璃化的植株；
13.(3)将步骤(2)再生产生的严重玻璃化植株的瓶苗放置在正南朝向的房间内玻璃窗的窗台上，使之接受阳光自然暴晒，期间以晴天为主，(注：晴天午后13～15时，接受阳光自然暴晒的瓶苗，经反复测量瓶内温度最高可达36～37℃)，2～3周后，当瓶内组培苗叶片全部干枯焦灼，而此时植株的茎却由原来的肿胀状态恢复为正常状态，后进行下一步骤；
14.(4)将经过步骤(3)处理的瓶苗，在超净工作台内无菌状态下，取出植株，切去全部焦灼叶片，将恢复为正常状态的茎切分为1～2cm长的小段，转接于生根诱导培养基上，室温下进行光照培养；
15.(5)将在生根诱导培养基上培养18-22d的茎段转接于再生增殖培养基上进行增殖，再在室温25℃下培养，18-22天即可分化出形态正常的再生植株。
16.其中，步骤(1)所述启动培养和增殖培养可以是任何适合采用苹果砧木外植体茎段进行组织培养的方法，这一步骤的目的是为了挑选在增殖过程中分化出的重度玻璃化组培苗。其中，本发明做实验时是在启动培养基ms+6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l上进行，增殖培养是在增殖培养基ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l上进行。
17.步骤(2)的增殖培养基同样可以采用任何适合采用苹果砧木外植体茎段进行组织培养的增殖培养基，为了前期实验简单，可以选择和步骤(1)相同的增殖培养基ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l，毕竟这一步也是为了得到依然是严重的玻璃化的植株。
18.优选地，所述生根诱导培养基为1/2ms+iba1.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l。
19.优选地，所述再生增殖培养基为ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l。本发明的优点：
20.之前的做法均是把玻璃化组培苗挑出扔掉，在实验过程中一次偶然的机会发现有一些未扔掉的玻璃化组培苗叶片都晒蔫了，但是茎的状态还好，就对其进行了转接，但结果却出乎预料，新增殖出的植株绝大部分恢复了正常，后来经过多次重复，发现本发明的这种处理方法能够使重度玻璃化组培苗有效恢复正常生长。因此，本发明对现实组织培养具有较高的应用价值。
21.本方法步骤(3)的处理对于严重玻璃化植株的恢复至关重要，一般地，对于严重玻璃化植株要么直接丢弃，要么对于阳光照射出现叶片萎蔫的植株直接丢弃，但是，本发明最重要的一个发明点却是步骤(3)一将步骤(2)再生产生的严重玻璃化植株的瓶苗放置在正
南朝向的房间内玻璃窗的窗台上，使之接受阳光自然暴晒，期间以晴天为主，2～3周后，当瓶内组培苗叶片全部干枯焦灼，而此植株的茎却由原来的肿胀状态恢复为正常状态，然后将茎转接于生根诱导培养基上，室温下进行光照培养；将在生根诱导培养基上培养18-22d的茎段转接于再生增殖培养基上进行增殖，再在室温下培养，18-22天即可分化出形态正常的再生植株。这个方法简单，易操作，对于正常组织培养产生的一些玻璃化组培苗可以重新加以利用，可以有效地提高实验效率。
附图说明
22.图1是重度玻璃化植株；
23.图2是高温暴晒后的植株；
24.图3是恢复正常生长的植株。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
26.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
27.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
28.一种苹果砧木重度玻璃化组培苗恢复正常生长的方法，所述方法包括如下步骤：
29.(1)苹果砧木外植体茎段在超净工作台内消毒接种，在启动培养基ms+6-ba0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l上进行萌芽启动培养，获得无菌芽进而在增殖培养基ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l上进行增殖培养分化出再生植株。
30.(2)将增殖培养过程中分化出的重度玻璃化组培苗转接于增殖培养基ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l上，在光照培养室内继续培养20～25d，此时，增殖形成的再生芽依然为严重玻璃化的植株，如图1所示。
31.(3)将步骤(2)所述的增殖形成的再生芽依然为严重玻璃化植株的瓶苗放置在正南朝向的房间内玻璃窗的窗台上，使之接受阳光自然暴晒，期间要以晴天为主，(注：晴天午后14时前后，测量瓶内温度最高可达36～37℃)，约2～3周后，瓶内组培苗叶片全部干枯焦灼，而此时植株的茎却由原来的肿胀状态恢复为正常状态，如图2所示。
32.(4)将经过步骤(3)处理的瓶苗，在超净工作台内无菌状态下，取出处理过的植株，切去焦灼叶片，将茎段切分为1～2cm长的小段，转接于培养基1/2ms+iba1.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l上，室温下进行光照培养。
33.(5)将步骤(4)培养20d左右的茎段转接于ms+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l培养基上进行增殖，再经室温25℃，20d左右的培养，即可分化出形态正常的再生植株，如图3所示。
34.经上述步骤的处理，严重玻璃化的苹果砧木组培苗即可恢复正常生长。
35.并且，在发现这个现象后，发明人对实验还进行了进一步的验证，是否现有技术中已有相关的技术，在检索过程中发现，有一些专利也有报道玻璃化组培苗复壮的方法，比如公开号为cn 112106659a的中国发明专利公开了“一种菊花玻璃化组培苗复壮的方法”，该方法是以中度玻璃化植株，剪成1.0-1.5cm小段后接入玻璃化苗复壮培养基中进行复壮培养，通过对培养基6-ba浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度、活性炭添加量及封口材料与甘菊和长裂太行菊玻璃化苗复壮的关系进行了研究，探索一种控制菊花试管苗玻璃化的组培复壮方法，能够有效提高菊花试管苗增殖系数、良好的解决菊花增殖培养过程中发生的组培苗玻璃化现象。发明人在实验过程中也做了相关的实验，通过对在组织培养过程中关键的一些因素包括培养基以及培养条件进行了改进调整，但是实验结果却不尽人意，对于苹果砧木组培苗，凡出现玻璃化的植株再次转接至增殖培养基上，新增殖出的植株依然表现为透明肿胀状态，一般不能有效改善其玻璃化状态，所以，该发明的这种通过调整培养基的方法对苹果砧木的重度玻璃化组培苗恢复正常帮助不大。
36.另外，对于上述处理方法中，省却步骤(3)的重度玻璃化组培苗进行培养，同样不能恢复正常，可见，步骤(3)对于本发明的成功非常关键。
37.以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。