一种银耳液体菌种的制备方法与流程

1.本发明属于银耳人工栽培技术领域，具体涉及一种银耳液体菌种的制备方法，适用于银耳瓶栽和袋栽。


背景技术：

2.银耳 (tremella fuciformis berk.) 也称为白木耳，是一种非常珍贵的食药用菌，具有“菌中之冠”的美称。在营养方面，银耳属于低能、低脂肪，但是富含蛋白质、多糖和膳食纤维。它富含多种矿物质、微量元素和维生素。近年来的研究表明，银耳多酚具有较高的抗氧化活性。从其体内提取的天然多糖被认为包含人体营养和健康的主要活性成分，具有增强免疫力、降低血糖、降低血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成等多种生物活性，是保健食品和药品的理想原料。人类从上世纪40年代开始有意识地人工栽培银耳，迄今已有近80年的栽培历史。
3.目前，银耳人工栽培均采用固体菌种，包含银耳和香灰菌 (annulohypoxylon stygium)两种菌丝。香灰菌属于子囊菌，将基质中的木质纤维素降解成可溶性小分子物质，并源源不断地传输给银耳，为其菌丝和子实体的生长发育所用。银耳菌丝仅仅在其接种点周围1 cm 区域生长，而香灰菌菌丝生长在整个栽培基质。接种前，固体菌种需要进行人工混种，将银耳与香灰菌菌丝混合均匀，确保每个栽培瓶/袋所接菌种均包含银耳与香灰菌菌丝。银耳菌种的这一特性，导致其固体菌种接种过程只能人工进行，不仅耗时费力，混合菌种均一性差，无法进行大规模机械化操作，已成为银耳工厂化、规模化栽培的“卡脖子”问题。
4.采用发酵罐生产银耳液体菌种，实现菌种边搅拌边生产，银耳菌丝均匀分布在菌种的各个角落，确保每个栽培瓶/袋所接菌种均包含比例相当的银耳与香灰菌菌丝。菌种均一、可实现大规模机械化生产，是银耳工厂化、规模化栽培用种的理想选择。前人有对银耳的液体菌种进行探索，所制备的菌种均不稳定，生产银耳产量远低于固体菌种的水平、成品率均不超过50%，无法应用于生产。


技术实现要素：

5.发明提供了一种适用于规模化栽培的银耳液体菌种的制备方法，解决现有固体菌种只能人工混种、耗时费力、均一性差、以及无法大规模机械化操作等问题。
6.为实现上述目的，采用以下技术方案：提供一种银耳液体菌种的制备方法，包括以下步骤：a、选取子实体生长至直径5 ~ 7 cm的银耳原种或培养8~9天的银耳生产种，作为液体菌种生产的出发菌种。
7.b、取步骤a所选取的银耳原种，在无菌条件下用接种刀将子实体和基质表面的老菌丝铲除，剩余菌种用银耳专用混种机将银耳与香灰菌菌丝混合均匀，在19 ~23℃下恒温恢复培养1~2 天；
c、在发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种步骤b所得到的银耳菌种，在20~22℃下恒温培养5～6天，即得到银耳液体菌种。
8.步骤a所选取的银耳原种需满足如下条件：香灰菌菌丝吃料快、长势均匀，白毛团胶质化快、出耳早，子实体朵形圆整、耳片伸展好，没有污染。
9.步骤b的银耳与香灰菌混种中，采用专用接种机先将子实体基部硬块基质打撒，再混匀菌种瓶的其他位置，通过旋转接种机的机头混合菌种，必要时使用接种勺辅助混合上下界面的菌种。每瓶原种混合2~3分钟。
10.所述液体培养基的组成为：1000 ml培养基包含40 ~ 60 g 麸皮细粉、4 ~ 5 g 葡萄糖、6 ~ 9 g 蛋白胨、2 ~ 3 g 硫酸镁和4 ~ 6 g磷酸二氢钾，植物油 2-3 g，其余为水。
11.所述液体培养基的制备步骤如下：按比例，将的麸皮细粉加配方量的水，煮沸30 ~40 min，两层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾和植物油，搅拌均匀后在压力0.11 mpa, 121 ℃下灭菌20~40 min。
12.进一步的，所述麸皮细粉为经过超微粉碎成粒径小于75 μm的颗粒。
13.进一步的，上述超微粉碎的具体操作步骤为：将新鲜麸皮烘干至含水量低于6%，经过剪切粉碎机重复粉碎10-20次，用高速分散粉碎机粉碎，粉碎一次后用200目的标准筛网过筛；未通过筛的细粉再用高速分散粉碎机粉碎和200目标准筛网过筛，如此重复，最终麸皮细粒粒径小于75 μm。培养基中添加麸皮细粉的作用：1）麸皮细粉为银耳与香灰菌的生长提供营养；2）银耳菌丝只有与香灰菌紧密结合才能快速生长，液体发酵过程中压缩空气形成的剪切力容易引起游离态的银耳与香灰菌菌丝分开而导致银耳生长缓慢；当混合菌丝定植在麸皮上后，将银耳与香灰菌固定在麸皮中，不会受到空气剪切力的影响。
14.步骤c中，发酵罐为内腔容积50 l的食用菌专用气升式发酵罐，银耳液体菌种发酵罐培养的条件为：培养温度为20~22 ℃，通气量 l/min,溶氧量50~90%，利用空气喷嘴喷出高速的空气，以气泡式分散在液体中，通过气液密度差形成发酵罐内液体环流，促进银耳与香灰菌菌丝混合。
15.步骤c中，发酵罐加入液体培养基的量为发酵罐内腔容积的65~70 %。
16.步骤c的混合菌种接种量为，35 l 液体培养基中接种400~500 g 固体菌种。
17.进一步的，液体培养基的接种的具体步骤为：用75 %乙醇对银耳原种瓶四周表面进行消毒，酒精灯火焰对原种瓶瓶口进一步灭菌；在发酵罐接种口外圈凹槽倒入一些无水乙醇，点燃形成火焰圈；用接种铲将原种瓶中的固体菌种接种至液体培养基中。
18.本发明所取得的技术效果：（1）本发明提供了一种银耳液体菌种的制备方法，利用空气喷嘴喷出高速的空气，以气泡式分散在液体中，通过气液密度差形成发酵罐内液体环流，促进银耳与香灰菌菌丝混合，获得的菌种不需要人工搅拌，银耳与香灰菌菌丝分布均匀。
19.（2）与现有固体菌种相比，本发明所获得的液体菌种每接种一瓶栽培瓶所用的材料成本减少12%，人工成本减少约70%，接种速度增加至3倍。
20.（3）本发明所获得的液体菌种1-2天内即可萌发和定植，速度与现有固体菌种相当；8~9天菌丝长满栽培瓶，满瓶时间比现有固体菌种快1-2天；25~26天开始形成耳基，出耳时间比现有固体菌种快1-2天；所接种栽培瓶子实体成熟时间为43~45天，银耳栽培周期与固体菌种相当。
21.（4）本发明所获得的液体菌种所生产的银耳子实体蒂头很小，平均干重为固体菌种生产银耳蒂头的 50 ~70 %；所生产银耳子实体平均干重（去蒂头）与固体菌种生产银耳平均干重相当，或略高。
附图说明
22.图1 为实施例3制备的液体菌种图片；图2 为实施例3制备的液体菌种的菌丝显微照片（600 倍），包含香灰菌菌丝和银耳菌丝；图3 为实施例3制备的液体菌种接种至栽培瓶时照片（b），固体菌种（a）为对照；图4 为实施例3制备的液体菌种接种，菌丝长满栽培瓶时的照片（b），固体菌种（a）为对照；图5 为实施例3制备的液体菌种接种，原基形成时的照片（b），固体菌种（a）为对照；图6 所示为实施例3制备的液体菌种接种，子实体成熟时的照片（b），固体菌种（a）为对照。
具体实施方式
23.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行简单的改进都属于本发明要求保护的范围。
24.实施例1：一种银耳液体菌种的制备方法，采用原种作为生产银耳液体菌种的出发菌种，具体步骤包括：从子实体直径生长至5 ~ 7 cm的银耳原种中，选取香灰菌菌丝吃料快、长势均匀，白毛团胶质化快、出耳早，子实体朵形圆整、耳片伸展好，没有污染的菌种。在无菌条件下用接种刀将子实体和基质表面的老菌丝铲除，采用专用接种机先将子实体基部硬块基质打撒，再混匀菌种瓶的其他位置，通过旋转接种机的机头混合菌种，必要时使用接种勺辅助混合上下界面的菌种。每瓶原种混合3分钟。混合后的菌种在22℃下恒温培养箱中恢复培养1 天。
25.将新鲜麸皮烘干至含水量6%，经过剪切粉碎机重复粉碎15次，用高速分散粉碎机粉碎，粉碎一次后用200目的标准筛网过筛；未通过筛的细粉再用高速分散粉碎机粉碎和200目标准筛网过筛，如此重复，最终麸皮细粒粒径小于75 μm。
26.液体菌种配方如下：1000 ml培养基包含50 g 麸皮细粉、5 g 葡萄糖、8 g 蛋白胨、3 g 硫酸镁和5 g磷酸二氢钾。液体培养基的制备过程包括，将5 % 的麸皮细粉加配方量的水，煮沸35 min，两层纱布过滤，滤液中加入0.5 % 葡萄糖、 0.8 % 蛋白胨、0.3 % 硫酸镁、0.5 %磷酸二氢钾和0.3 % 植物油，搅拌均匀后在压力0.11 mpa, 121 ℃下灭菌30 min。
27.等上述灭菌好的液体培养基的稳定降低至25 ℃以下时，可以开始接种；用75 %乙醇对银耳原种瓶四周表面进行消毒，酒精灯火焰对原种瓶瓶口进一步灭菌；在发酵罐接种口外圈凹槽倒入一些无水乙醇，点燃形成火焰圈；用接种铲将原种瓶中的固体菌种接种至液体培养基中。
28.液体培养基接种好后，在22℃下恒温培养6天，培养过程中保持通气量 100l/min, 溶氧量50~90%，即得到银耳液体菌种。
29.实施例2：一种银耳液体菌种的制备方法，采用栽培种作为生产银耳液体菌种的出发菌种，具体步骤包括：从培养8~9天的银耳生产种中，选取香灰菌菌丝吃料快、长势均匀，白毛团健壮、数量多，均匀分布在菌种表面，没有污染的菌种。在无菌条件下用银耳专用接种机将生产种中的栽培基质混合均匀，必要时使用接种勺辅助混合上下界面的菌种，每瓶生产种混合2分钟。混合后的菌种在22℃下恒温培养箱中恢复培养1 天。
30.将新鲜麸皮烘干至含水量6%，经过剪切粉碎机重复粉碎15次，用高速分散粉碎机粉碎，粉碎一次后用200目的标准筛网过筛；未通过筛的细粉再用高速分散粉碎机粉碎和200目标准筛网过筛，如此重复，最终麸皮细粒粒径小于75 μm。
31.液体菌种配方如下：1000 ml培养基包含50 g 麸皮细粉、5 g 葡萄糖、8 g 蛋白胨、3 g 硫酸镁和5 g磷酸二氢钾。液体培养基的制备过程包括，将5 % 的麸皮细粉加配方量的水，煮沸35 min，两层纱布过滤，滤液中加入0.5 % 葡萄糖、 0.8 % 蛋白胨、0.3 % 硫酸镁、0.5 %磷酸二氢钾和0.3 % 植物油，搅拌均匀后在压力0.11 mpa, 121 ℃下灭菌30 min。
32.等上述灭菌好的液体培养基的稳定降低至25 ℃以下时，可以开始接种；用75 %乙醇对银耳原种瓶四周表面进行消毒，酒精灯火焰对原种瓶瓶口进一步灭菌；在发酵罐接种口外圈凹槽倒入一些无水乙醇，点燃形成火焰圈；用接种铲将原种瓶中的固体菌种接种至液体培养基中。
33.液体培养基接种好后，在22℃下恒温培养6天，培养过程中保持通气量 100l/min, 溶氧量50~90%，即得到银耳液体菌种。
34.实施例3：实施例1制备的10批液体菌种及其栽培银耳的效果，具体情况为：液体菌种絮状，呈浅黄色 （图 1），静止放置30分钟后分层不明显；显微镜下，菌丝球包含银耳菌丝和香灰菌菌丝，这两种菌丝相互缠绕在一起 （图 2）。
35.对照固体菌种：银耳固体菌种（栽培种）制作方法: 培养料配方为桦木科木屑 63% ~73%、麸皮 35% ~25%、石膏粉 2%，料水比1:1.5。将培养料拌匀，装瓶，料高7cm~10cm，在121
ꢀ°
c的高压灭菌中灭菌2h。用接种匙取3~5g银耳原种碎粒接种至培养料上表面，摇晃菌瓶使菌种分散至整个上表面。置于20~22 ℃、避光、空气清新的菌种室内培养7d~12d，香灰菌丝生长健壮、分布均匀、分泌黑色素，培养基表面出现许多白毛团，即成栽培种。
36.液体菌种和对照固体菌种接种的栽培瓶，接种处形态差异明显（图3）；液体菌种接种第2天，菌丝开始萌发，萌发速度与对照固体菌种相当；接种第9天，菌丝长满整个菌瓶（图4），比对照固体菌种快1天；接种第25天，接种处开始形成耳基（图5），现耳时间比对照固体菌种快1天；接种第45天，子实体成熟（图6），成熟时间与固体菌种相当。
37.随机挑取液体菌种和对照液体菌种接种的栽培瓶各20瓶，统计成熟子实体的重量。液体菌种生产银耳子实体蒂头平均干重为2.2 g，是对照固体菌种的54%；所生产银耳子实体（去蒂头）平均干重为 31.0 g，是对照固体菌种生产银耳平均干重的116% （表 1）。
38.10批菌种于2021年12月4日至12月16日完成制备，同一天接种至栽培瓶中。每批次菌种的接种量介于4336至41152瓶不等，共接种228738瓶，其中4903个栽培瓶无法出耳（坏品），45个栽培瓶生产子实体不正常（次品），成品率为97.84 %（表 2），满足规模化栽培银耳的要求。
39.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。