硫酸软骨素作为有效成分在制备植物免疫诱抗剂中的应用的制作方法

1.本发明属于农业生物农药技术领域，硫酸软骨素作为有效成分在制备植物免疫诱抗剂中的应用。


背景技术：

2.植物在其生长发育过程中经常会遭受生物或非生物因素的影响，在形态以及生理生化上发生改变，如萎蔫、坏死和畸形等，严重阻碍植物的正常生长。植物病毒是一类结构简单、形态各异的非细胞生物，寄生在植物体内，利用寄主细胞所提供的物质、能量和场所进行复制和繁殖。由于植物的免疫系统存在局限性，对植物病毒的防治较为困难
1.。在农业生产中，病毒病的危害程度仅次于真菌，是第二大类植物病害，也被称之为“植物癌症”2.，是植物病害研究的重点和难点问题。马铃薯(solanum tuberosum l.)是世界上最大的非谷类粮食作物，也是仅次于小麦、稻谷和玉米的全球第四大粮食作物。我国马铃薯的产量高，种植面积广，是全球最大的马铃薯生产国。马铃薯晚疫病(potato late blight)是由致病疫霉(phytophthora infestans)引起的一种毁灭性卵菌病害，被列为世界粮食作物第一大病害
3.。该病害在我国造成马铃薯减产20％左右，严重时可高达50％，甚至绝收
4.，造成了严重的经济损失并威胁了食品安全
5.。化学药剂防治上述病害是一种有效的手段，能够降低病害造成的损失，但长时间、大范围的使用，严重污染了土壤生态系统及周边生态环境。所以，寻找新型的抗病策略，研究植物本身抗病机制，从根本上提高植物的免疫能力，研发针对该病的新型、环保抗病试剂具有重要的应用价值和现实意义。
3.随着世界人口的增长，在控制植物病原体和提高粮食产量方面，迫切需要创造性和突破性的战略
6.。植物免疫诱抗剂是一类新概念农药，其通过激活植物的免疫系统并调节植物的新陈代谢，从而增强植物抗病和抗逆能力
7.。植物免疫诱抗剂本身没有直接的杀菌活性，主要通过促使植物利用自身的天然免疫系统来防治病害，而不依赖外源农药直接杀死病原体。生物源植物免疫诱抗剂不仅提高植物的抗病性，并具有刺激作物生长，提高产量及改善农产品品质，无残留等优点，对人、畜无毒，加工工艺简单，成本低、病菌不易对其产生抗药性，符合有效保护农业生物多样性的条件下实现绿色防控的思路，具有良好的开发应用潜力
8.。
4.硫酸软骨素(cs)是一种共价连接在蛋白质上，形成蛋白聚糖的结构复杂、线性、阴离子的一类糖胺聚糖，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和n-乙酰半乳糖胺(又称n-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上
9.。虽然多糖的主链结构并不复杂，但就硫酸化程度、硫酸基和两种差异向异构糖醛酸在链内的分布来说，呈现高度的不均一性。多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异互作来实现其生物学功能，同一个多糖链中存在不同结构的功能区，与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能。不同的结构序列的功能区与特定的蛋白结合发挥特异的功能。硫酸软骨素的精细结构决定着功能的特异性和与多种蛋白质分子的相互作用
10.。cs在动物各种正常的生理和病理过程中起着重要的作用，表现出多种生
物活性，如抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血栓、免疫原性不明显等。然而，cs在植物生理和病理方面的研究尚未报道。
5.中国专利文献cn108056101a(申请号：201610978760.9)公开了一种壳聚糖-褐藻酸纳米颗粒及其制备和应用，该专利文献制得的壳寡糖-褐藻酸纳米颗粒，具有诱导植物抗性和促进植物生长的活性，但是该专利文献中并未涉及硫酸软骨素在植物中的应用。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了硫酸软骨素作为有效成分在制备植物免疫诱抗剂中的应用。
7.本发明的目的是为了避免农药残留及化学药物试剂污染环境的问题，发掘无毒、无残留、保护人畜安全的生物源抗病毒剂，本发明提供了硫酸软骨素在诱导植物抗病害的新用途。
8.本发明的技术方案如下：
9.硫酸软骨素作为有效成分在制备植物诱抗剂中的应用。
10.根据本发明优选的，所述诱抗对象包括植物病毒、植物卵菌病害。
11.进一步优选的，植物病毒包括烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯y病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄退绿病毒。
12.进一步优选的，植物卵菌病害包括致病疫霉。
13.根据本发明优选的，所述植物包括烟草属、黄瓜属、茄属、番茄属。
14.进一步优选的，所述植物包括烟草、黄瓜、马铃薯、番茄。
15.一种植物诱抗剂，有效成分包含硫酸软骨素。
16.所述植物诱抗剂在植物种植中的应用。
17.根据本发明优选的，所述植物诱抗剂在抗植物病毒和/或植物卵菌病害中的应用。
18.根据本发明优选的，所述应用中，硫酸软骨素的使用浓度为20μg/ml～55μg/ml。
19.进一步优选的，硫酸软骨素的使用浓度为45-55μg/ml。
20.有益效果
21.1、本发明提供了硫酸软骨素(cs)作为生物源免疫诱抗剂在植物抗病害方面的新用途，硫酸软骨素能够诱导植物内源水杨酸的积累；激发活性氧爆发；提高植物对致病菌的抗性作用。
22.2、本发明中硫酸软骨素(cs)使用浓度在25μg/ml、50μg/ml均具有较好的预防效果，平均预防效果分别为：76.02％、85.84％，均高于对照50μg/ml壳寡糖(cos)的预防效果69.72％；综合分析，cs在25～50μg/ml的使用成本，低于壳寡糖(cos)，本发明提供的硫酸软骨素(cs)使用更经济。
附图说明
23.图1为以水处理为阴性对照，以壳寡糖(cos)为阳性对照，不同浓度硫酸软骨素(cs)处理后接种带gfp荧光标签的马铃薯x病毒(pvx-gfp)的防治效果图和病毒定量图；
24.图中：a为不同浓度cs处理后本生烟中荧光强度图；
25.b为qrt-pcr检测本生烟中gfp因表达量，bar值代表准差，***p≤0.001。
26.图2为硫酸软骨素(cs)处理后接种致病疫霉的防治效果图和疫霉定量图；
27.图中：a为cs处理后本生烟接种致病疫霉的表型图；
28.b为真菌检测试剂盒结合qrt-pcr检测本生烟中致病疫霉菌丝表达量，数据源于三次生物学实验，bar值代表标准差，***p≤0.001；
29.ck为喷施ddh2o对照组，cs为喷施50μg/ml的cs溶液组。
30.图3为硫酸软骨素(cs)处理后水杨酸(sa)含量的检测结果图与基因ics与pal的表达水平图；
31.图中：a为cs喷施处理后本生烟中sa的含量图；
32.b为qrt-pcr检测不同处理后本生烟中sa合成基因ics与pal的表达水平图。
33.图4为cs喷施处理不同时间dab染色结果图；
34.图中：a为cs促进本生烟过氧化氢的积累图；
35.b为cs处理24h后qrt-pcr检测基因cat、sod、apx、rboha、rbohb结果图，数据以平均值(n＝5)
±
sd表示，*p《0.05，**p《0.01；
36.ck为水对照组，cs为50μg/ml的cs溶液组。
具体实施方式
37.下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
38.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
39.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
40.主要材料来源
41.硫酸软骨素、壳寡糖购自青岛嘉味达生物科技有限公司。
42.实施例1
43.硫酸软骨素(cs)能够提高植物对病毒的抗性
44.先将含有蛭石与基质(体积比为1:2)的营养土搅拌均匀，放入一次性塑料小钵；在每个小钵中撒上3-4颗本生烟的种子，放于温室(24℃，14h光照，10h黑暗)中，盖上一层塑料薄膜培养。出苗后，将小苗移栽至塑料小钵中，每钵1株，放置于温室进行管理。选取4周苗龄的本生烟，喷施药剂，每个处理喷施10株，每株5ml。药剂喷施后2小时，接种带gfp荧光标签的马铃薯x病毒(pvx-gfp)接种液，摩擦接种，每株接种3个叶片，每个叶片50μl。接种5天后调查病情。
45.药剂处理为硫酸软骨素25μg/ml、硫酸软骨素50μg/ml、硫酸软骨素100μg/ml、硫酸软骨素200μg/ml、壳寡糖50μg/ml、清水对照共6个处理，每个处理3次重复，随机排列。
46.病毒的制备方法是：采集感染马铃薯x病毒(pvx)的本生烟叶，按鲜病叶：缓冲液＝1:20g/ml的重量体积比加缓冲液，缓冲液种类为pbs，其酸碱度为ph7.0，制得pvx病毒接种
液。
47.实验结果：观察表型(图1中的a)，并利用qrt-pcr检测不同处理pvx的含量(图1中的b)。结果显示cs使用浓度在25μg/ml和50μg/ml时平均预防效果分别为：76.02％、85.84％，均高于对照50μg/ml壳寡糖(cos)的预防效果69.72％。
48.实施例2
49.硫酸软骨素(cs)增强植物对致病疫霉的抗性
50.为探究cs是否能够增强植物对致病疫霉的抗性，本发明对苗龄一致，长势相同的本生烟喷施50μg/ml的cs溶液，并以喷施ddh2o为对照，24h后取相同位置的叶片放置在塑料皿中，将处理好的致病疫霉接种至叶片相同位置，重复三次。3d后观察不同实验组发病情况，发现cs处理本生烟叶片的枯黄程度较弱，病斑面积较小，而ddh2o处理的本生烟枯黄程度更为严重，病斑面积较大(图2中的a)，利用真菌定量试剂盒和qrt-pcr对不同处理本生烟叶片中的菌丝生长量进行定量检测。结果显示cs预处理的本生烟叶片中致病疫霉菌丝生长量显著低于ddh2o处理的本生烟(图2中的b)，与表型一致，表明cs能够增强植物对致病疫霉的抗性。
51.实施例3
52.(一)硫酸软骨素(cs)诱导水杨酸的积累
53.在先前的实验中已经证实cs能够促进植物抗病，为探究cs是否通过促进sa含量介导植物抗病，选取40株长势一致，苗龄相同的本生烟，20株喷施50μg/ml的cs溶液，另外20株喷施ddh2o作为对照，24h后取材，分别提取喷施水和cs的本生烟叶片提取物，用液相色谱法检测水杨酸(sa)的含量，具体方法如下：
54.(1)提取方法：取10.0g叶片充分研磨后，置于50ml的离心管中，加5％的三氯乙酸4.0ml，加水至20ml后再加入30ml乙醚，充分摇匀，浸提12h，于1000g下离心5.0min，取出上部乙醚相，水相再经乙醚重复提取2次，合并乙醚相，真空旋转蒸干后，加入1.0ml 50％甲醇+50％乙酸缓冲液(ph3.2)的混合液将其溶解，置于eppendorf管中保存，即为游离态sa样品。水相加18.5％的hcl至终浓度为3.2％，于80℃水浴中加热1h，冷却后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1ml 50％甲醇+50％乙酸缓冲液(ph3.2)的混合液溶解，置于eppendorf管中保存，即为结合态sa样品。结合态sa样品经0.22μm的微孔过滤器过滤后，用高效液相色谱(hplc)进行检测。
55.(2)测定含量
56.主要仪器：岛津高效液相色谱仪。
57.sa标准品，上海五联化工厂生产；甲醇为色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司生产；其余所用试剂均为分析纯。
58.hplc检测条件：c18柱，7.3mm
×
20cm；流动相:甲醇:乙酸缓冲液(ph3.2)＝50:50；岛津荧光检测器(激发波长为310nm，发射波长为415nm)；流速为1ml/min；进样量为20μl。
59.结果显示，cs预处理的本生烟中sa含量显著高于ddh2o预处理的对照组，表明cs能够促进本生烟中sa的积累继而促进对病原菌的抗性(图3中的a)。
60.(二)研究表明，植物通过两种通路合成sa：以分支酸为前体的异分支酸合成酶(isochorismate synthase，ics)途径和以苯丙氨酸为前体苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，pal)途径，上述实验已经证实cs能够促进本生烟中sa的积
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