一种五指毛桃组织培养方法与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种五指毛桃组织培养方法。


背景技术：

2.五指毛桃(ficus hirta vahl)，别名佛掌榕、粗叶榕，《广州植物志》广东通称“五爪龙”，又名五爪毛桃、五爪牛奶、土黄芪、南芪等。植物形态，小灌木或小乔木，全株茎果皮叶含乳液，根皮有香气。五指毛桃分布于我国南部及西南部，为岭南常用草药，以桑科榕属植物粗叶榕的根入药，其性平，味甘、辛，有健脾补肺、利湿舒筋之功，用于脾虚浮肿、食少无力、肺痨咳嗽、盗汗、风湿痹痛、食少腹胀、水肿、产后无乳等症。此外，五指毛桃又是一食药同源的植物，在广东地区民间用来煲汤。近年来，五指毛桃这一宝贵的植物资源引起了药学工作者的高度重视，对其化学成分、药理活性及其他方面的研究不断深入，并证实补骨脂素为五指毛桃的主要活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗凝血、抑制肿瘤、免疫调节等作用。具有健脾补肺，行气利湿之功效。
3.近年来，随着南药产业的发展，五指毛桃遭到滥采乱挖，野生资源面临枯竭，而且自然繁殖速度缓慢，应用推广五指毛桃林下经济间种是现代南药产业发展方向之一。传统的五指毛桃种苗通过种子播种繁育，育苗时间长，难以满足种苗供应需求，而且种苗的需求出现供不应求趋势。通过组织培养途径实现五指毛桃快速稳定繁殖，可满足日益增长的市场需求。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于，提供一种五指毛桃组织培养方法。
5.本发明的五指毛桃组织培养方法，包括：
6.选取五指毛桃顶芽作为外植体，将外植体洗净、消毒后冲洗，并吸干表面水分；
7.将外植体接种到丛生芽诱导培养基中，将诱导出的丛生芽继而转入丛生芽诱导培养基中，丛生芽不断增殖及生长，获得大量丛生芽及小苗，用于在增殖培养基继代增殖、生根培养；
8.将健壮小苗移转接至生根培养基上诱导生根，获得健壮的植株。
9.上述技术方案在一种实施方式中，所述将外植体洗净、消毒后冲洗，并吸干表面水分，包括：将外植体用清水洗净后放入已经消毒的培养容器内，置于超净工作台上，再用75％乙醇表面消毒1-2min，再以0.1％(w/v)hgcl2浸泡消毒，消毒时间为8-12min，最后用无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面水分。
10.上述技术方案在一种实施方式中，所述丛生芽诱导培养基为ms+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l。
11.上述技术方案在一种实施方式中，丛生芽不断增殖及生长，平均繁殖系数为5-8。
12.上述技术方案在一种实施方式中，所述增殖培养基为ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l。
13.上述技术方案在一种实施方式中，在增殖培养基反复继代培养，增殖倍数为6倍以上。
14.上述技术方案在一种实施方式中，所述生根培养基为1/2ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖40g/l+海藻酸0.5mg/l+0.25％活性炭+0.1％普罗丹叶面肥。
15.上述技术方案在一种实施方式中，将长至3-4cm的健壮小苗移至生根培养基上诱导生根，20-30d后，长成株高6-8cm，具2-3篷叶，2-3条根的植株，根系粗壮且分支多，获得健壮的植株。
16.上述技术方案在一种实施方式中，所述五指毛桃组织培养方法的培养条件为：温度为27℃
±
1℃，光源为日光灯，光照度为2000-3000lx，光照时间为12h
·
d-1。
17.上述技术方案在一种实施方式中，所述五指毛桃组织培养方法还包括：将株高6-8cm的健壮的植株继续培养，其在生根培养基上总培养时长30-50d时，获得五指毛桃瓶苗并移到大棚中，在自然光下炼苗，再置于阴凉通风的环境开盖炼苗，适时喷水，然后将生根苗移出瓶外，洗净根部培养基，将根部浸泡消毒，用清水洗净后移栽到预先消毒处理过的基质中，浇水淋透，适当保湿遮荫，并进行常规管理，之后组培苗移栽。
18.上述技术方案在一种实施方式中，在自然光下炼苗2-5d，再置于阴凉通风的环境开盖炼苗2-5d，适时喷水，然后将生根苗移出瓶外，洗净根部培养基，用0.1％多菌灵溶液将根部浸泡消毒5-10min，用清水洗净后移栽到预先消毒处理过的基质中，浇水淋透，适当保湿遮荫，自移栽到基质中12-18d时喷施一次营养液，并进行常规管理，自移栽到基质中25-35d后组培苗移栽。
19.相对于现有技术，本发明通过调整各培养阶段培养基组成，提升五指毛桃组织培养的诱导率、增殖系数和生根率以及移栽成活率，降低污染率与褐化率，提高五指毛桃的快繁效率。本发明的五指毛桃组织培养方法简便易操作，出苗率较高，植株健壮，缩短育苗时间，降低了育苗成本。
20.为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
21.图1是外植体接种示意图。
22.图2是增殖芽获得示意图。
23.图3是增殖过程示意图。
24.图4是丛生芽获得示意图。
25.图5是健壮苗体获得示意图。
26.图6是诱导生根示意图。
27.图7是移栽的种苗示意图。
28.图8是移栽种苗与普通种苗的对比示意图。
29.图9是五指毛桃移栽后的田地实拍图。
30.图10是本发明培养出的五指毛桃果实图。
具体实施方式
31.在本说明书中提到或者可能提到的上、下、左、右、前、后、正面、背面、顶部、底部等
方位用语是相对于其构造进行定义的，它们是相对的概念。因此，有可能会根据其所处不同位置、不同使用状态而进行相应地变化。所以，也不应当将这些或者其他的方位用语解释为限制性用语。
32.以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的实施方式的例子。
33.在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
34.本发明以五指毛桃顶芽作为外植体诱导丛生芽，最终实现植株再生，组培技术体系建立。
35.本发明的五指毛桃组织培养方法，包括：
36.步骤101，外植体选择及前期准备。
37.选取五指毛桃(ficus hirta vahl)顶芽作为外植体，将外植体洗净、消毒后冲洗，并吸干表面水分。
38.优选地，所述将外植体洗净、消毒后冲洗，并吸干表面水分，包括：将外植体用清水洗净后放入已经消毒的培养容器内，置于超净工作台上，再用75％乙醇表面消毒1-2min，再以0.1％(w/v)hgcl2浸泡消毒，消毒时间为8-12min，优选10min，最后用无菌水冲洗3-5遍，用无菌滤纸吸干表面水分。这样，能够保持较高的诱导率和较低的污染率。
39.培养条件说明：
40.基本培养基为ms或1/2ms培养基，附加蔗糖30mg/l或40mg/l(生根培养)、naa0.5mg/l、iba0.1mg/l，不同种类和浓度的6-ba(6-苄基腺嘌呤)，添加海藻酸0.5mg/l及0.1％普罗丹叶面肥，ph5.8，配制分装后，于1.05kg/cm压力，121℃条件下灭菌20min。上述培养条件，可使五指毛桃诱导率达到70％以上，平均芽高达到3cm以上。
41.下述步骤102-步骤103，以及步骤104中继续在生根培养基上的培养阶段的培养条件为：温度为27℃
±
1℃，光源为日光灯，具体选用led灯，光照度为2000-3000lx，光照时间为12h
·
d-1。可显著提高五指毛桃组织培养的增殖系数。
42.步骤102，丛生芽诱导、继代增殖培养。
43.请参阅图1-图5。将外植体接种到丛生芽诱导培养基中，将诱导出的丛生芽继而转入丛生芽诱导培养基中，待1周后芽生长成幼苗，茎杆粗短，叶色绿，每株丛生芽不断增殖及生长，平均繁殖系数为5-8，获得大量丛生芽及小苗，用于在增殖培养基继代增殖、生根培养。
44.优选地，所述丛生芽诱导培养基为ms+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l。经诱导可分化出大量丛生芽，诱根培养后能形成正常植株。可显著提高五指毛桃组织培养的诱导率。
45.适合外植体诱导的丛生芽诱导培养基为ms+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l，顶芽经诱导可分化出大量丛生芽，生根培养后能形成正常植株，建立了五指毛桃离体快速繁殖体系。因此，通常建议选择五指毛桃顶芽做为外植体。
46.优选地，所述增殖培养基为ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l。可显著提高五指毛桃组织培养的增殖系数。
47.植物生长调节剂的种类、水平以及相互组合的选择对组织的形成与分化十分重要。通过调节增殖培养基中激素的含量，使丛生芽增殖速度大大加快，增殖系数达6-8倍，增殖培养基选择ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l，可快速稳定获得大量所需的丛生芽。
48.步骤103，生根培养。
49.请参阅图6，将健壮小苗移转接至生根培养基上诱导生根，获得健壮的植株。
50.将长至3-4cm的健壮小苗移至生根培养基上诱导生根，20-30d后，长成株高6-8cm，具2-3篷叶，2-3条根的植株，生根率100％，根系粗壮且分支多，获得健壮的植株。
51.优选地，所述生根培养基为1/2ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖40g/l+海藻酸0.5mg/l+0.25％活性炭+0.1％普罗丹叶面肥。能够显著提升五指毛桃组培苗的生根率、根长和根数。
52.生根培养基选择1/2ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖40g/l+海藻酸0.5mg/l+0.25％活性炭+0.1％普罗丹叶面肥，减少了生根培养基中营养成分和糖含量，可促进生根，试验中发现，养分减半的1/2ms作为生根培养基生根率可达100％，根系生长粗壮。
53.步骤104，炼苗与移栽。
54.请参阅图7-图10。将株高6-8cm的健壮的植株继续培养，其在生根培养基上总培养时长30-50d时，获得五指毛桃瓶苗并移到大棚中，在自然光下炼苗，再置于阴凉通风的环境开盖炼苗，适时喷水，然后将生根苗移出瓶外，洗净根部培养基，将根部浸泡消毒，用清水洗净后移栽到预先消毒处理过的基质中，浇水淋透，适当保湿遮荫，并进行常规管理，之后组培苗移栽。
55.在具体实施时，优选地，在自然光下炼苗2-5d，再置于阴凉通风的环境开盖炼苗2-5d，适时喷水，然后将生根苗移出瓶外，洗净根部培养基，用0.1％多菌灵溶液将根部浸泡消毒5-10min，用清水洗净后移栽到预先消毒处理过的基质中，浇水淋透，适当保湿遮荫，自移栽到基质中12-18d时喷施一次营养液，并进行常规管理，自移栽到基质中25-35d后组培苗移栽。
56.组培苗移栽成活率达到90％以上，说明炼苗有利于试管苗的移栽。
57.本发明的五指毛桃组织培养方法的有益效果：
58.本发明以五指毛桃顶芽为外植体，确定了采用0.1％(w/v)hgcl2灭菌最适合的时长为10min；适合外植体顶芽诱导的丛生芽诱导培养基为ms+6-ba2.0mg/l+蔗糖30g/l，经诱导出大量丛生芽，生根培养后能形成正常植株，建立了五指毛桃离体快速繁殖体系。因此，通常建议选择五指毛桃顶芽做为外植体。
59.在植物组织培养中，植物生长调节剂的种类、水平以及相互组合的选择对组织的形成与分化十分重要。通过调节培养基中激素的含量，使丛生芽分化速度大大加快，繁殖系数达6-8倍，增殖培养基选择
60.ms+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l可获大量所需的丛生芽。
61.植物组织培养生根阶段，减少培养基中营养成分和糖含量可促进生根，生根培养基选择1/2ms+naa0.5mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖40g/l+海藻酸0.5mg/l+0.25％活性炭+0.1％普罗丹叶面肥。试验中发现，养分减半的1/2ms作为生根培养基生根率可达100％，长势良好。
62.通过炼苗，组培苗移栽成活率达到90％以上，试验说明炼苗有利于试管苗的移栽。
63.本发明通过调整各培养阶段培养基组成，提升五指毛桃组织培养的诱导率、增殖系数和生根率以及移栽成活率，降低污染率与褐化率，提高五指毛桃的快繁效率。本发明的五指毛桃组织培养方法简便易操作，出苗率较高，植株健壮，缩短育苗时间，降低了育苗成本。
64.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。