牧草盲蝽寄主植物挥发物的应用

1.本发明涉及植物病虫害防治技术领域，具体涉及牧草盲蝽寄主植物挥发物的应用。


背景技术：

2.牧草盲蝽lygus pratensis是新疆重要的农业害虫，20世纪50～70年代，牧草盲蝽严重为害棉花，百株虫量最多时可达190头，棉株被害率几乎100％，是造成棉花蕾铃脱落的主要原因，防治不及时的棉田，减产50％以上；到80～90年代，伴随新疆棉蚜、棉铃虫的爆发和相应的化学防治，牧草盲蝽得到兼治，种群数量减少危害减轻，成为次要害虫。进入21世纪，随着新疆农作物种植结构调整、耕作制度变革、特别是转基因棉的大面积种植，以及城镇化建设、气候条件的变化等因素，牧草盲蝽再度爆发成灾。大发生的棉田蕾铃被害率达56％，并向红枣、核桃、香梨等果园转移，果树受害加重，被害果实长大后形成“猴头果”、“疙瘩梨”，严重威胁着新疆棉花和林果产业的可持续发展。
3.植物挥发物在植食性昆虫的寄主选择过程中发挥着重要的作用。植食性昆虫最终能够找到并抵达寄主植物，往往是植物释放的挥发性物质在其中起到重要作用，帮助植食性昆虫对寄主植物进行定向。例如，马铃薯甲虫对马铃薯的寄主定向是依赖于马铃薯植株的叶片所产生的气味；小菜蛾plutella xylostella对十字花科植物散发的芥子油，即异硫氰酸酯具有定向行为；甘蓝中的反-2己烯醛、壬醛、苯甲醛、芳樟醇对斜纹夜蛾spodoptera liura有很强的吸引力。植物挥发性物质对盲蝽科昆虫的行为调控方面的研究近年来也明显增多。研究发现绿盲蝽雌虫对寄主植物挥发物表现敏感，而雄虫反应迟钝。孙鹏等研究表明，牧草盲蝽成虫对乙酸顺式-3-己烯酯和壬醛引发的eag反应值最大，且雌、雄间差异显著；嗅觉行为测定中，牧草盲蝽雌虫对壬醛、金合欢烯、α-蒎烯、1-石竹烯、乙酸顺式-3-己烯酯、2-甲基-1-醇的大部分浓度的行为反应差异显著，雄虫仅对α-蒎烯、壬醛的部分浓度的行为反应差异显著，这为研发牧草盲蝽引诱剂或趋避剂策略提供科学依据。
4.因此，筛选出对牧草盲蝽具有诱集作用的植物挥发物，可作为牧草盲蝽引诱剂，对牧草盲蝽的防治具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种牧草盲蝽寄主植物挥发物的应用，用以解决现有技术存在的问题。
6.为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种牧草盲蝽寄主植物挥发物在防治牧草盲蝽中的应用，所述牧草盲蝽寄主植物挥发物包括苯乙醛、罗勒烯、水杨酸甲酯、异硫氰酸丁酯、反式-2-己烯醇、芳樟醇中的任一种或几种。
7.进一步地，苯乙醛和/或异硫氰酸丁酯在防治牧草盲蝽雌虫中的应用。
8.进一步地，苯乙醛在防治牧草盲蝽雌虫中的应用。
9.进一步地，所述苯乙醛的浓度为100
±
10μl/ml。
10.进一步地，所述异硫氰酸丁酯的浓度为100
±
10μl/ml。
11.本发明的第二方面提供了如上所述的牧草盲蝽寄主植物挥发物在制备牧草盲蝽引诱剂中的应用。
12.本发明具有如下优点：
13.本发明通过对油菜、棉花、龙葵、灰绿藜、马齿苋这五种牧草盲蝽寄主植物的挥发性化学物质进行研究，筛选出对牧草盲蝽具有明显诱集作用的化合物，可作为牧草盲蝽引诱剂，为有效地控制牧草盲蝽提供了新的途径。
附图说明
14.图1分别是牧草盲蝽的5种寄主植物的挥发物gc-ms检测图谱，其中，a油菜；b灰绿藜；c马齿苋；d龙葵；e棉花。
15.图2是牧草盲蝽雌、雄虫对6种寄主植物挥发性物质的触角电位反应，其中，1异硫氰酸丁酯sec-butyl，2水杨酸甲酯methyl salicylate，3苯乙醛phenylacetaldehyde，4罗勒烯ocimene，5反式-2-己烯醇trans-2-hexen-1-ol，6芳樟醇linalool。
具体实施方式
16.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.以下实施例中：
18.供试材料
19.供试虫源：牧草盲蝽采自新疆生产建设兵团第一师十团路边杂草，将采集的成虫放入养虫笼中并将其置于人工气候箱中饲养。饲养条件为：温度27
±
1℃、湿度为60
±
5％、光照16:8(l:d)。
20.供试寄主植物：油菜、棉花、龙葵、灰绿藜、马齿苋。
21.仪器设备
22.气相色谱-三重四极杆质谱联用仪tsq 9000(thermo scientific，美国)，数显恒温水浴锅(olabo，山东)，手动spme进样器、50/30μm dvb/car/pdms萃取头(supelco，美国)，四臂嗅觉仪xl4-30-300(南京雪莱，中国)，真空泵(vacuum pump，tuthill，美国)，触角电位仪eag(syntech，德国)，等。
23.实施例1
24.寄主植物挥发物的分离鉴定
25.从田间采集的新鲜植物，使用湿润棉球包裹伤处，减少伤口产生的挥发物逸散。称取采摘的新鲜样本5.0g，放入100ml采样瓶中，密封，于40℃水浴中平衡20min，插入50/30μm dvb/car/pdms萃取头，40℃萃取40min，解析时间3min。取出后立即插入至gc-ms进样口，进样口温度250℃，进行挥发性物质的提取。
26.利用气相色谱-三重四极杆质谱联用仪进行挥发物的鉴定分析，检索谱库为nist。gc条件：db-5ms色谱柱(30m
×
0.25mm，0.25μm)；升温程序：初始温度为50℃，保持2min，以10
℃/min升至250℃，保持35min，共运行57min；载气为高纯氦气(99.999％)；不分流进样，流速1ml/min。ms条件：离子源为电子电离(electron ionization，ei)源，离子源温度为260℃；电子能量70ev；进样口温度250℃；溶剂延迟1min，扫描范围为50～500m/z。
27.利用gc-ms技术提取出5种寄主植物的挥发性物质后，同时使用计算机检索技术，鉴定分离的寄主植物化合物见图1。油菜共鉴定出化合物9种，灰绿藜9种，棉花11种；龙葵10种；马齿苋最少，鉴定出6种，共计25种，包括烷、醇、酯、醛类及其他种类的化合物。其中烷烃类有5种，醇类5种、醛类4种、萜烯类3种、酸类3种、酯类2种、硫化物2种、酮类1种。在5种寄主植物中，2-己烯醛为油菜、灰绿藜、马齿苋、龙葵4种植物共有；2,6,10-三甲基十四烷、罗勒烯为3种植物共有；苯乙醛、水杨酸甲酯、3-己烯-1-醇、顺-2-己烯-1-醇、二十碳五烯酸、反式-2-己烯-1-醇、1-戊烯-3-醇、1,4-戊二烯为两种寄主植物共有；其他未提到的化合物是各寄主植物独有的。
28.计算植物挥发物各组分的百分比含量，面积归一化法结果见表1。
29.表1寄主植物释放的挥发物种类及相对含量
30.[0031][0032]
注：a油菜；b灰绿藜；c马齿苋；d龙葵；e棉花
[0033]
油菜中，二甲基三硫相对含量达31.49％，二甲基四硫醚达23.63％，异硫氰酸丁酯4.12％；灰绿藜中，2-己烯醛相对含量达38.93％；棉花中，β-蒎烯相对含量达37.48％；龙葵中，顺-2-己烯-1-醇相对含量达10.87％；未列出的化合物，以其相对含量均小于3％的状态，存在于各寄主植物中。本发明选择6种气味化合物，购买标准品，详细信息见表2。
[0034]
表2标准化合物纯度及来源
[0035]
[0036][0037]
实施例2
[0038]
牧草盲蝽对化合物标准品的eag反应
[0039]
eag测定方法：用指形管套取一只6-10日龄的牧草盲蝽成虫，在体视显微镜下，将其以腹部朝上的状态置于冰面冻晕，沿牧草盲蝽前足腿节中部用双面刀片迅速向下切去，观察分离部位组织膜是否有溢出组织液，若发现组织膜有破裂，则需要重新准备；若组织膜没有破裂，则可进行下一步实验。之后将两根触角尖端切去很小一部分，然后用事先准备好的参考电极(毛细管中浸有0.9％的nacl溶液)对准切口处的组织膜轻轻地插入，插入时稍靠下部且不能插入太深，当感觉到轻微的阻力便停止，把带有头部的参比电极连接到eag微操作台上，先调节微操做台上的“上下左右前后”旋钮并用昆虫针辅助将一根触角拨入记录电极的毛细管中，再用昆虫针将另一根触角也轻轻拨入毛细管中。两个电极间用银丝来连接，按照以上步骤操作后，eag系统便连通了。
[0040]
eag系统连通后，设置空白对照-石蜡油，内参-叶醇，配制浓度为100μl/ml的内参、气味标样，以10μl的剂量进行测试。每头牧草盲蝽成虫按照“对照-参照-随机测试其余标准化合物-参照-对照”的顺序，进行测试。试验时，室内环境控制在温度25
±
2℃，湿度60-70％。通过以下公式：r＝(挥发物反应值-对照反应值)/(参照反应值-对照反应值)，r为挥发物的eag反应相对值。牧草盲蝽雌、雄成虫对6种寄主植物挥发性物质的触角电位反应的结果见图2，图中a、b字母不同表示在duncan氏新复极差法检验差异显著(p＜0.05)水平下具有显著性。
[0041]
由图2可知，牧草盲蝽雌、雄个体对各化合物的eag反应存在差异。eag值最高的是苯乙醛，eag值最低的是芳樟醇。雌虫eag值：苯乙醛＞罗勒烯＞水杨酸甲酯＞异硫氰酸丁酯＞反式-2-己烯醇＞芳樟醇；雄虫eag值：水杨酸甲酯＞罗勒烯＞苯乙醛＞反式-2-己烯醇＞异硫氰酸丁酯＞芳樟醇。对供试的同种化合物，雄虫eag值均小于雌虫。
[0042]
实施例3
[0043]
牧草盲蝽对化合物标准品的嗅觉趋向行为反应
[0044]
利用四臂嗅觉仪测定牧草盲蝽对牧草盲蝽成虫个体对反式2-己烯醇、苯乙醛、芳樟醇、罗勒烯、水杨酸甲酯、异硫氰酸丁酯的趋向性。将滤纸条(0.5cm
×
5cm)对折，滴10ul含单组分纯品的液体石蜡溶液，试验中的浓度均为100μl/ml，30s后把滤纸条放入广口瓶作为气味源，以液体石蜡为溶剂和对照。将单头牧草盲蝽成虫释放至放虫孔，当其处于中心区域时计时，观察牧草盲蝽成虫5min内的行为反应。牧草盲蝽放于中心圆内，若成虫越过某臂3cm且在此臂区域内停留5s以上，视为受到该方向上气味源的引诱而产生趋向行为。每头成虫只测试一次，每测试10头交换气体来向并更换胶管，测试20头时更换寄主植物。每组处理
测试牧草盲蝽雌雄成虫各60头，牧草盲蝽成虫饥饿5h后用于试验。测试后，用乙醇清洗四臂嗅觉仪、洗气瓶与连接胶管。用χ2检验牧草盲蝽成虫在两个味源间选择是否呈假设h0为50:50的理论分布，计算χ2值和相应的显著性水平p值。
[0045]
公式一：引诱率＝处理虫数/测试总虫数
×
100％
[0046]
公式二：趋避率＝对照虫数/测试总虫数
×
100％
[0047]
公式三：反应率＝(处理虫数+对照虫数)/测试总虫数
×
100％
[0048]
雌虫和雄虫对6种植物挥发物的行为反应结果见表3和表4。实验数据均采用spss22.0统计软件进行统计分析。
[0049]
表3牧草盲蝽雌虫对6种植物挥发物的行为反应
[0050][0051][0052]
注：显著性中*表示p﹤0.05，**表示p﹤0.01，ns表示p﹥0.05。
[0053]
表4牧草盲蝽雄虫对6种寄主植物挥发物质的行为反应
[0054][0055]
注：显著性中ns表示p﹥0.05。
[0056]
牧草盲蝽的趋向行为表明，在同种化合物下，雌虫比雄虫更容易受到挥发物引诱。经χ2检验分析，苯乙醛对雌虫的行为反应表现极显著差异(p＜0.01)，对异硫氰酸丁酯的行为反应差异表现显著(p＜0.05)；而牧草盲蝽雄虫对反式2-己烯醇、苯乙醛、芳樟醇、罗勒烯、水杨酸甲酯、异硫氰酸丁酯6种化合物的行为反应差异表现均不显著。
[0057]
本发明通过对比gc-ms图确定有活性的物质，检索谱库为nist，鉴定、筛选出活性物质后，研究了牧草盲蝽对各寄主植物挥发物质的趋性反应。结果表明，经gc-ms进行鉴定后发现，油菜鉴定出9种化合物、灰绿藜9种、棉花11种、龙葵10种、马齿苋6种。通过文献查阅及结合课题组前期研究成果，筛选了6种寄主植物挥发性物质测定牧草盲蝽的eag、趋向行为反应，结果表明，牧草盲蝽雌、雄个体对各化合物的eag反应存在差异，雄虫eag值均小于雌虫。eag值最高的是苯乙醛，eag值最低的是芳樟醇。雌虫eag值：苯乙醛＞罗勒烯＞水杨酸甲酯＞异硫氰酸丁酯＞反式-2-己烯醇＞芳樟醇；雄虫对各化合物的eag值差异不显著。苯乙醛对雌虫的行为反应表现极显著差异(p＜0.01)，对异硫氰酸丁酯的行为反应差异表现显著(p＜0.05)；雄虫对6种化合物的行为反应差异表现均不显著。
[0058]
结合牧草盲蝽对6种化合物的eag和行为反应，得出牧草盲蝽雌虫对苯乙醛有显著的选择性，这种能够调控牧草盲蝽雌虫趋向行为的化合物，是配置牧草盲蝽雌虫引诱剂的潜在候选组分，可设计牧草盲蝽雌虫趋向行为调控剂用于牧草盲蝽雌虫的测报及防治中。
[0059]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。