一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法

1.本发明属于云南独蒜兰培养技术领域，特别是涉及一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法。


背景技术：

2.云南独蒜兰〔pleione yunnanensis(rolfe)rolfe〕，为兰科独蒜兰属的一种半附生兰，国内主要产于四川、贵州和云南，假鳞茎为中药山慈菇的主要来源之一。云南独蒜兰为《中国药典》收载品种，具有清热解毒、止咳化痰，止血生肌。主治肺结核，百日咳，气管炎，痈肿，消化道出血，外伤出血等。近年来，由于其含有抗肿瘤的活性，云南独蒜兰市场需求量不断增加。但其种子小，自然状态下很难成功萌发及生长，加之野生资源破坏严重，所以通过组织培养是获得大量完整再生植株的重要技术手段，亦是缓解资源环境压力的主要途径。
3.近年来有不少关于独蒜兰组织培养方面的报道，但是组培出来的种苗在炼苗过程中出现的问题还是较多，最根本的原因是其炼苗成活率和成苗率低，从而影响其种苗质量和产业化发展。
4.现有的云南独蒜兰和独蒜兰组培都是与传统的组培方式一致，无菌萌发、增殖培养、生根培养和炼苗，但是在组培过程中其组培苗假鳞茎过小，而叶片和须根较多，从而影响炼苗成活率和成苗率，传统组培出来的组培苗在最后的生根培养后，假鳞茎基本上只有1-2mm大小，每个培养瓶也只有 30-35棵苗，通过延长其培养时间虽然能够部分增大假鳞茎，时间也需要 50-60天，但是延长培养并不会导致假鳞茎数量的增加，使得后期炼苗成活率和成苗率仍然不高。为此，我们提供了一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法，用以解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法，解决了现有的云南独蒜兰和独蒜兰组培都是与传统的组培方式一致，在组培过程中其组培苗假鳞茎过小，而叶片和须根较多，从而影响炼苗成活率和成苗率的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明为一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法，包括如下步骤：
8.步骤一、将云南独蒜兰开花后5-7天进行自交授粉获得蒴果，以云南独蒜兰成熟且未开裂的蒴果作为外植体；
9.步骤二、对作为外植体的蒴果进行消毒杀菌，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分进行备用；
10.步骤三、剖开无菌蒴果取出种子，将种子播于培养基上并分散均匀，完成接种后将其置于培养室中培养，诱导种子萌发阶段避光培养，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养；
11.步骤四、在播种40d-50d后原球茎开始分化出叶，同时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物，原球茎经增殖培养30d后原球茎都能长出第1片叶芽，本阶段采用光照培养；
12.步骤五、选择大小适合的原球茎接种到不同激素种类和浓度的培养基上，对继代增殖原球茎进行叶芽诱导和丛芽增殖，本阶段采用光照培养；
13.步骤六、选取经叶芽诱导、丛芽增殖的小苗用于生根壮苗培养，本阶段采用光照培养；
14.步骤七、把生根培养好的培养瓶苗放置在可以控制光照、温度的培养室中进行再次培养，再次培养分为三个阶段，第一阶段将温度控制在35℃，无光照的环境中培养25-30天，让高温抑制云南独蒜兰组培苗的生长，使叶子的光合作用降低，让原有的叶子黄化，把营养全部供给给假鳞茎，让假鳞茎膨大，等到叶子全部枯萎；第二阶段将培养温度降低至20℃继续培养 25-30天，直至独蒜兰假鳞茎旁边有新的假鳞茎长出并出现新的芽点，第三阶段将培养温度提高至25℃继续培养25-30天；
15.步骤八、把再次培养好的云南独蒜兰组培苗经过除培养基、消毒和分拣处理，置于炼苗棚中进行炼苗培养。
16.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤一具体为：把4-5月开花的云南独蒜兰在5-7天内进行自交授粉，授粉成功的继续培养4-5个月获得蒴果，以云南独蒜兰成熟且未开裂的蒴果为外植体。
17.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤二具体为：用适量清水加洗洁剂洗涤蒴果6min，然后用无菌水冲净蒴果表面的洗洁精，在超净工作台上将洗涤后的蒴果用75％的酒精进行表面消毒处理30s，再用0.1％的氯化汞消毒15min，然后用无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分后备用。
18.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤三具体为：超净工作台上用消毒后的手术刀将消毒处理过的蒴果两端切除，纵向剖开蒴果，将种子播于萌发培养基上，轻轻晃动培养瓶使种子均匀散布，完成接种后将其置于培养室培养，诱导种子萌发阶段避光培养，温度为25℃，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养，温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。
19.作为本发明一种优选技术方案，用于种子萌发培养的所述培养基由以下几种组分构成：40g/l ms，0.25mg/l 6-ba，1.0mg/l naa，1.0g/l蛋白胨，1.0g/l炭粉，该培养基的ph为5.8-6.0。
20.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤四中的培养条件为：温度 25℃，光照时间10h/d，光照强度1500lx；培养基由以下几种组分构成：40g/l ms，1.5mg/l 6-ba，0.75mg/l naa，1.0g/l蛋白胨，该培养基的ph为5.8-6.0。
21.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤五中的培养条件为：温度 25℃，光照时间12h/d，光照强度1200lx；培养基由以下几种组分构成：40g/l ms，1.5mg/l 6-ba，0.75mg/l naa，1.0g/l蛋白胨，该培养基的ph为5.8-6.0。
22.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤六中的培养条件为：温度 25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx；培养基由以下几种组分构成：40g/l ms，0.25mg/l 6-ba，1.0mg/l naa，50g/l香蕉，1.0g/l炭粉，该培养基的ph为5.8-6.0。
23.作为本发明一种优选技术方案，所述步骤七中第一阶段的培养条件为：无光照，温度控制在35℃；第二阶段的培养条件为：光照时间8h/d，光照强度1000lx，温度控制在20℃；第三阶段的培养条件为：光照时间12h/d，光照强度1500lx，温度控制在25℃。
24.本发明具有以下有益效果：
25.1、本发明通过提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法的应用，使得云南独蒜兰组培苗炼苗成苗率提高35％，成苗率提高20％，有效解决了独蒜兰炼苗成活率和成苗率低的问题，提高了云南独蒜兰种苗经济效益，为云南独蒜兰今后大规模种植提供优质种苗打下基础。
26.2、本发明通过云南独蒜兰种子无菌萌发获得原球茎，原球茎经过增殖长叶、生根培养获得组培苗，对组培苗进行高温、暗环境、光环境、变温的再次培养，从而获得云南独蒜兰组培苗假鳞茎较大和数量较多的要求。
27.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明为一种提高云南独蒜兰组培苗假鳞茎膨大和数量的方法，包括如下步骤：
30.步骤一、获得外植体：把4-5月开花的云南独蒜兰(rolfe)进行自交授粉，培养4-5个月获得蒴果，以云南独蒜兰成熟且未开裂的蒴果为外植体；
31.步骤二、外植体消毒：用适量清水加洗洁剂洗涤蒴果6min，然后用无菌水冲净蒴果表面的洗洁精，在超净工作台上将洗涤后的蒴果用75％的酒精进行表面消毒处理3min，再用0.1％的升汞(hgcl2)消毒10min，然后用无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分后备用；
32.步骤三、接种培养：超净工作台上用消毒后的手术刀将消毒处理过的蒴果两端切除，纵向剖开蒴果，将种子播于培养基上，轻轻晃动培养瓶使种子均匀散布。完成接种后将其置于培养室培养，诱导种子萌发阶段避光培养，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养；
33.步骤四、原球茎继代培养：在播种40d-50d后原球茎开始分化出叶，同时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物，此时的原球茎经过继代培养，有利于原球茎的增殖，生长速度加快，本阶段采用光照培养；
34.步骤五、原球茎经增殖培养30d后原球茎都能长出第1片叶芽，但丛生芽数量相对较少，叶片弱小，此时，需对继代增殖原球茎进行叶芽诱导、丛芽增殖，选用不同激素种类和浓度的培养基进行培养，选择大小适合的原球茎用于接种，本阶段采用光照培养；
35.步骤六、生根壮苗培养：选取经叶芽诱导、丛芽增殖的小苗用于生根壮苗培养，所选材料要求大小和长度，生长状况一致的小苗。完成接种后将材料移至培养室中，采用光照培养；
36.步骤七、再次培养：次阶段最为关键，把生根培养好的培养瓶苗放置在可以控制光照、温度的培养室中进行再次培养，再次培养分为三个阶段，第一阶段将温度控制在35℃，
无光照的环境中，让高温抑制云南独蒜兰组培苗的生长，使叶子的光合作用降低，让原有的叶子黄化，把营养全部供给给假鳞茎，让假鳞茎膨大，等到叶子全部枯萎，时间需要25-30天；第二阶段将培养温度降低至20℃继续培养25-30天，发现在独蒜兰假鳞茎旁边有新的假鳞茎长出并出现新的芽点后开始进行第三阶段的培养，第三阶段将培养温度提高至25℃继续培养25-30天，经过再次培养，云南独蒜兰组培苗假鳞茎由原来的1-2mm增大至5-6mm,假鳞茎数量也由原来的30-35个增加至50-60个，不进行再次培养和进行再次培养的效果对比见表1所示；
37.表1不进行再次培养和进行再次培养的效果对比
[0038][0039]
步骤八、炼苗：把再次培养好的云南独蒜兰组培苗经过除培养基、消毒、分拣等步骤，在炼苗棚中进行炼苗培养，通过炼苗对比，云南独蒜兰假鳞茎大小为1-2mm时，炼苗成活率为60％，成苗率为70％，而假鳞茎大小为5-6mm时，炼苗成活率达到95％，成苗率达到90％，不同假鳞茎大小对炼苗成活率和成苗率的影响见表2所示。
[0040]
表2不同假鳞茎大小对炼苗成活率和成苗率的影响
[0041]
假鳞茎大小(mm)炼苗成活率(％)炼苗成苗率(％)0.05-0.1437000.1-0.251730.2-0.355750.3-0.464780.4-0.578820.5-0.69590
[0042]
进一步地，所述步骤三中的培养条件为：温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx，此阶段用于种子萌发培养的所述培养基由以下几种组分构成：ms(40g/l)+6-ba(0.25mg/l)+naa(1.0mg/l)+1.0g/l蛋白胨 +1.0g/l炭粉，该培养基的ph为5.8-6.0。
[0043]
进一步地，所述步骤四中的培养条件为：温度25℃，光照时间10h/d，光照强度1500lx；培养基由以下几种组分构成：ms(40g/l)+6-ba(1.5mg/l) +naa(0.75mg/l)+1.0g/l蛋白胨，该培养基的ph为5.8-6.0，该培养基用于原球茎的继代培养和增殖。
[0044]
进一步地，所述步骤五中的培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1200lx；培养基由以下几种组分构成：ms(40g/l)+6-ba(1.5mg/l) +naa(0.75mg/l)+1.0g/l蛋白胨，该培养基的ph为5.8-6.0，该培养基用于原球茎的继代培养和增殖。
[0045]
进一步地，所述步骤六中的培养条件为：温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx；培养基由以下几种组分构成：ms(40g/l)+6-ba (0.25mg/l)+naa(1.0mg/l)+香蕉(50g/l)+1.0g/l炭粉，该培养基的 ph为5.8-6.0。
[0046]
进一步地，所述步骤七中第一阶段的培养条件为：无光照，温度控制在35℃；第二
阶段的培养条件为：光照时间8h/d，光照强度1000lx，温度控制在20℃；第三阶段的培养条件为：光照时间12h/d，光照强度1500lx，温度控制在25℃。上述各个培养基中的ms指基本培养基，其是只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合成培养基；naa指人工合成激素萘乙酸，6-ba指6-苄氨基嘌呤。
[0047]
通过本发明，云南独蒜兰组培苗炼苗成苗率提高35％，成苗率提高 20％，有效解决独蒜兰炼苗成活率和成苗率低的问题，为云南独蒜兰今后大规模种植提供优质种苗打下基础。
[0048]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0049]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。