专利名称：一种细菌灭幼蚊剂的双菌协同发酵法的制作方法
专利说明 本发明是一种微生物灭幼蚊剂的生产方法，更确切说，是一种细菌灭幼蚊剂的双菌协同发酵法。
目前，苏芸金杆菌血清型14(H14)和球形芽孢杆菌单独用于灭幼蚊虫已有重大突破，并已成为蚊虫防治的重要手段之一，随之上述两菌的单菌种发酵方法已广为人知。虽然上述两种菌种的每种菌通过单独菌种发酵制得的细菌灭幼蚊剂用于灭蚊幼虫均有一定效果，但仍存在下述缺点(1)H14用于灭蚊幼虫的致命缺点是无持效。(2)B.S存在杀虫谱窄，特别对伊蚊的效果极差和毒效发挥慢的缺点。
经检索未见有B.S和H14两菌混合发酵的报导。
本发明的目的是利用B.S与H14混合生长的相容性，研究成功一种B.S与H14两种菌种协同发酵方法，通过该发酵法使H14与B.S共生，进而制成一种新的细菌灭幼蚊剂，使它既具有H14杀虫谱广，毒效发挥快和毒效高的优点，同时也具有B.S残效长(21天以上)的优点;而且也克服了H14无持效和B.S杀虫谱窄、毒效发挥慢的局限性。
本发明的具体内容本发明宠统地说是采取深层发酵工艺，具体说可分为“一级发酵工艺”和“二级发酵工艺”两种工艺路线，说明书附
图1是本发明的二级发酵工艺路线图，附图2是本发明的一级发酵工艺路线图，下面参照附
图1和附图2将本发明的两种工艺路线的内容详述如下 一、二级发酵工艺本工艺路线是本发明的最佳工艺路线。
1.菌种斜面 (1)生产用菌种 A.苏芸金杆菌血清型14 1897株(简称H14)。
B.球形芽孢杆菌2362株，1593株，2297株，B.S-10株，B.SC8-41株(简称B.S)。
(2)菌种斜面培养基配方 A.培养基配方牛肉膏0.5%;蛋白胨1.0%;琼脂2.0-2.5%，其余为花生饼粕粉(豆饼粕粉、菜子饼粉、棉子饼粉亦可)水浸出液(简称花生饼粉浸液)， B.“花生饼粕粉水浸出液”的制备方法 在常温下，以花生饼粕粉∶水＝(5-15)∶100的比例，将花生饼粕粉浸泡24小时以上，然后用双层干净纱布过滤，过滤液用NaOH溶液将PH值调到7.0-9.0范围，此液即为所需用的花生饼粕粉水浸液，又称“花生饼粉浸液”。
(3)菌种斜面的培养条件及方法将H14和B.S两种菌的菌株分别单独接种于两个已灭菌，PH值为7-9的菌种斜面培养基上，接种完后将菌种斜面置于26-34℃的恒温培养箱内培养24-72小时，肉眼观察菌落生长丰富，性状良好，无噬菌斑，检验无杂菌，H14芽孢和伴孢晶体分离，其比例为1∶1或晶体更多些;B.S大部分形成孢子囊即可，以上之菌种为培养合格的菌种斜面。
2.摇瓶菌种 (1)摇瓶菌种的培养基配方牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，其余为花生饼浸液， (2)摇瓶菌种的培养条件及方法在≤30℃条件下，将上述培养好的菌种斜面接种于装有已灭菌，PH值为7-9“摇瓶菌种培养基”的三角瓶中，再将接好种的三角瓶置于转速为220转/分的旋转式摇床上(往复式摇床亦可)，在26℃-32℃下培养24-48小时，经检验菌种生长茂盛无杂菌即可。
3.种子罐包括种子罐培养基配方，发酵条件及方法， (1)种子罐培养基配方KH2PO40.1%，NaCl 0.2%，MgSO40.3%，甘油聚醚消沫剂0.5%，其余是花生饼粉浸液。
(2)种子罐发酵条件及方法将上述培养好的摇瓶菌种H14和B.S按种子罐培养基的0.1-1%量引种到装有已灭菌，PH值为7-9(7.8-8.7为最佳)“种子罐培养基”的两只体积结构相同的种子罐中，在罐温26-32℃(28℃为最佳)，罐压0.3-0.5公斤/厘米2，通气量0.8-1升/升/分，搅拌转速240转/分，培养时间≤8小时的情况下，经检验，菌种进入生长对数期，无杂菌，每视野菌量8-10个菌时为合格。
4.发酵罐包括发酵罐培养基配方，发酵条件及方法。
(1)发酵罐培养基配方与上述种子罐培养基配方相同。
(2)发酵罐的发酵条件及方法将上述种子罐已培养好的H14菌液按培养基量的0.1-1%先压入装有已灭菌，PH值7-9培养基的发酵罐中，罐压为0.3-0.5Kg/cm2，罐温26-30℃(28℃为最佳)通气量0.8-1升/升/分搅抖240转/分，发酵时间≤8小时(8小时为最佳)，再将上述种子罐已培养好的另一菌种B.S菌液与H14相同的量压入本罐中，使H14与B.S两种菌在同一发酵罐中进行协同发酵和共同生长，发酵时间达12小时(以H14菌发酵时间计)，发酵罐内的通风量增大至1-1.5升/升/分，发酵总时间为24-48小时，检查当两菌孢子形成率达80%以上时即可收获。
5.产品的后处理 (1)产品的浓缩为了使制品便于包装和储运，可用超滤薄膜过滤器或用刮板浓缩机将发酵原产品浓缩1-4倍(使用时再用水稀释5-10倍)。
(2)产品的防腐处理为了保障产品在长期储存过程中不变质，在产品浓缩后加入相当产品总量0.2%的苯甲酸钠搅匀，将产品进行包装(以塑料或玻璃容器为佳)。
6.产品质量检验 (1)检验H14与B.S之比例以H14∶B.S＝1∶1为最佳(参考值)。
(2)毒力效价测定参照WHO生物毒效测定方法进行，其结果应达到120-240Iu/mg为合格。
二.一级发酵工艺本工艺路线适合于发酵罐为100L-1000L的小型生产线。
1.菌种斜面“一级发酵工艺”的“生产用菌种”，“菌种斜面培养基配方”和“菌种斜面的培养条件及方法”均与前述“二级发酵工艺”的菌种斜面部分相同。
2.发酵罐包括培养基配方，发酵条件及方法。
可将上述培养好的菌种斜面即三角烧瓶液体菌种或茄子瓶菌苔菌种，分别采用下述两种不同方法接种于装有已灭菌，PH值为7-9培养基的发酵罐中(本培养基成分与“二级发酵工艺”发酵罐用培养基成份相同)， (1)先将H14和B.S两菌种混匀，倒入已准备好的无菌接种瓶中，然后再从无菌接种瓶引种到发酵罐中(与一般抗菌素发酵时的接种方法相同)，接种完后即开始发酵，发酵条件罐温26-34℃，罐压0.3-0.5Kg/cm2，通气量0.8-1升/升/分，搅拌转速260-450转/分(罐体小的转速要快一些)，发酵时间24-48小时，经检验当两种菌孢子形成率达80%以上时即可收获。
(2)在与上述(1)相同发酵条件的基础上，先将H14接种到发酵罐中之后，在间隔1-8小时之内(间隔8小时为最佳)再将B.S接种到发酵罐中，这样有利于两菌均衡生长，(B.S比H14具有较强生长势)，发酵时间以H14接种完计为24-48小时，经检验，当两菌孢子的形成率达80%以上时即可收获。
3.产品的后处理及产品质量检验均与“二级发酵工艺”中的“产品后处理及产品质量检验”的内容相同，故从略。
本发明的优点和特点 1.本发明对H14和B.S的混合生长的相容性为一新的发现，并利用两菌混合生长的相容性进行了双菌种协同发酵方法的研究，通过H14与B.S协同发酵生产出与B.S和H14单菌种灭幼蚊剂有实质性差别的本双菌灭幼蚊剂。
2.本发明生产的双菌灭幼蚊剂的突出优点具有H14和B.S的全部优点，即杀虫谱广、速效和长效的特点，又从根本上克服了B.S和H14的全部缺点，即B.S杀虫谱窄，作用缓慢和H14无持效的局限性，详见下表所列数据 单菌与双菌协同发酵毒力效率的比较(LC50) 3.本发明在生产中节约了设备投资、人工、原料和能耗，降低了产品成本，提高了经济效益。
本发明是在B.S和H14单菌生产的基础上，是在不增加设备、人工、原料和能耗的条件下生产出本双菌灭幼蚊剂的，而且本双菌灭幼蚊剂具备B.S和H14两种细菌灭幼蚊刘的优点和克服了它们各自的局限性，故使用本细菌灭幼蚊剂等于同时使用B.S和H14两种灭幼蚊剂的效果。因用量节约一半，所以设备投资、人工、原料和能耗等均能近一倍的下降。相形之下成本也会近一倍的下降。这样也明显的提高了生产厂家的经济效益。
4.本发明生产的双菌灭幼蚊剂由于克服了B.S和H14两种灭幼蚊剂的局限性，使产品的使用范围放宽得很广。例如本发明生产的双菌灭幼蚊剂特别适用稻田、沼泽等多蚊种孳生地，经实践证明，使用效果极好。
本发明的最佳实施例 1.菌种斜面 (1)生产用菌种H14和B.S。
(2)菌种斜面培养包括培养基配方、菌种培养条件及方法。
A.斜面培养基配方牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，琼脂2.5%，其余是花生饼粉浸液。
B.菌种斜面培养条件及方法将H14和B.S两菌分别单独接种于两只已灭菌PH值为7.8的斜面培养基上，接完种将斜面置于28℃±1℃培养箱内培养48小时，肉眼观察菌苔生长丰富，性状良好，无噬菌斑，检验无杂菌，H14芽孢和伴孢晶体分离，其比例为1∶1;B.S大部形成孢子囊。
2.摇瓶菌种包括摇瓶培养基配方，摇瓶菌种培养条件及方法。
(1)摇瓶培养基配方牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，其余是花生饼粉浸液， (2)摇瓶菌种培养条件及方法在≤30℃条件下，将上述“菌种斜面”接种于装有已灭菌，PH值为7.8“摇瓶培养基”的三角瓶中;接种后将三角瓶置于转速为220转/分的旋转式摇床上，在29℃±1℃下培养48小时，经检验孢子囊形成率达80%以上，无杂菌。
3.种子罐包括种子罐培养基配方，种子罐发酵条件及发酵方法。
(1)种子罐培养基配方KH2PO40.1%，NaCl 0.2% MgSO40.03%，甘油聚醚消沫剂0.1%。
(2)种子罐发酵条件及方法将上述制备的摇瓶菌种H14和B.S按种子罐培养基1%相同的量，先后相隔8小时，(H14先，B.S后)分别接种到装有已灭菌，PH值为7.8“种子罐培养基”的两只体积相同的种子罐中，在下述相同条件下罐温29±1℃、罐压0.4Kg/cm2，通气量1升/升/分，搅拌转速240转/分常开，各培养8小时，经检验，菌种进入生长对数期，无杂菌，每视野菌量10个菌。
4.发酵罐包括培养基配方，发酵罐的发酵条件及方法。
(1)培养基配方与本实施例“种子罐培养基”同。
(2)发酵罐的发酵条件及方法先将上述种子罐培养8小时合格的H14菌，压入装有已灭菌，PH值为7.8培养基的发酵罐中，在罐压0.5公斤/厘米2，罐温29±1℃，通气量1升/升/分，搅拌转速240转/分，发酵时间达8小时，再将上述另一只种子罐培养8小时合格的B.S菌与H14菌液量相同压入本发酵罐中，使H14与B.S两菌在同一发酵罐内进行协同发酵和共同生长;当发酵时间达12小时时(以H14发酵时间计)，通风量增大至1.5升/升/分，当发酵时间达48小时时(以H14发酵时间计)，孢子形成率达89%进行收获。
5.产品的后处理 (1)发酵液浓缩将发酵罐的发酵液用超滤薄膜过滤器浓缩4倍。
(2)防腐处理在已浓缩的发酵液中加入相当发酵液量的0.2%苯甲酸钠搅匀进行防腐，然后将产品装入塑料容器中。
6.产品质量检验 (1)检验H14和B.S的比例;经检验H14∶B.S＝1∶1(参考数)。
(2)参照WHO生物毒效测定方法进行毒力效价测定，其结果为240Iu/mg。
实施例的施用效果 1.本实施例产品的效果例如使用本实施例制做的产品10克相当于使用B.S10克和H1410克之和(共20克)的效果，由此可知，要近一倍的节约了设备投资、人工、原料等，故成本有近一倍的降低，同时也大幅度的提高了经济效益， 2.本实施例的产品适用范围广，经实验，本实施例产品特别适用于稻田、沼泽等多蚊种孳生地， 3.本实施例的产品经实验证明同时具有H14杀虫谱广，速效和B.S长效(21天以上)的特点;而且从根本上克服了B.S杀虫谱窄，作用缓慢和H14无持效的局限性，见下表所列数据
权利要求
1、一种细菌灭幼蚊剂的双菌协同发酵法其特征在于所述的双菌协同发酵法是利用H14和B.S两种菌混合共生的相容性，把H14和B.S放入同一只发酵罐中，采用深层发酵的“二级发酵工艺”或“一级发酵工艺”制得一种新的灭幼蚊剂，该灭幼蚊剂不但同时含H14和B.S两种菌，而且在使用效果上与H14或B.S单菌灭幼蚊剂都有实质性差别，上述两种发酵工艺包括
(一)二级发酵工艺
(1)菌种斜面，(2)摇瓶菌种，(3)种子罐，(4)发酵罐，(5)产品后处理(第一步浓缩，第二步防腐处理)，(6)产品质量检验。
(二)一级发酵工艺
(1)菌种斜面，(2)发酵罐，(3)产品后处理(第一步浓缩，第二步防腐处理)及产品质量检验。
2、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(一)二级发酵工艺的(1)菌种斜面其特征在于“菌种斜面”的
(1)斜面培养基配方牛肉膏0.5%;蛋白胨1.0%;琼脂2.0-2.5%，其余为花生饼粕粉(或豆饼粕粉，或菜子饼粉，或棉子饼粉)水浸出液。
(2)菌种斜面培养条件及方法将H14和B.S两种菌分别单独接种于两个装有已灭菌，PH值为7-9的“斜面培养基”上，接完种将斜面培养基置于培养箱内，在26-30℃下培养24-72小时，肉眼观察菌苔生长丰富，性状良好，无噬菌斑，检验无杂菌，H14芽孢和伴孢晶体分离，其比例为1∶1或晶体更多些;B.S大部分形成孢子囊即可。
3、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(一)二级发酵工艺的(2)摇瓶菌种其特征在于“摇瓶菌种”的
(1)摇瓶培养基配方
牛肉膏0.5%;蛋白胨1.0%;其余为花生饼粕粉的水浸出液(用棉子饼粉、豆饼粉、菜子饼粉均可)。
(2)摇瓶菌种培养条件及方法
在≤30℃条件下，将已培养好的“菌种斜面”接种于装有己灭菌，PH值7-9“摇瓶培养基的”三角瓶中，在26-30℃下将接好种的三角瓶置于摇床上培养24-48小时，检验菌种生长茂盛，无杂菌即可。
4、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(一)二级发酵工艺的(3)种子罐其特征在于“种子罐”的
(1)种子罐培养基配方
KH2PO40.1%;NaCl 0.2%; MgSO40.03%;甘油聚醚消沫剂0.1%，其余为花生饼粕粉(豆饼粉，菜子饼粕，棉子饼粉亦可)水浸出液。
(2)种子罐发酵条件及方法
将上述摇瓶菌种H14和B.S分别按种子罐培养基的0.1%～1%相同量引种到两支体积、结构相同的装有己灭菌，PH值为7-9(7.8～8.7为最佳)“种子罐培养基”的种子罐中;在罐温26-30℃(28℃为最佳)，罐压0.3-0.5公斤/厘米2，通气量0.8-1升/升/分，搅拌转速240转/分，常开，培养时间≤8小时;经检验，当菌种进入生长对数期，无杂菌，每视野量8-10个菌时即可。
5、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(一)二级发酵工艺的(4)发酵罐，其特征在于“发酵罐”的
(1)发酵罐培养基配方与“种子罐培养基配方”相同。
(2)发酵罐发酵条件及方法
先将上述种子罐已培养好的H14菌液按发酵罐液量的0.1-1.0%压入装有已灭菌，PH值为7-9发酵罐培养基的发酵罐中;在罐压0.3-0.5公斤/厘米2，罐温26℃-30℃(28℃为最佳)，通气量0.8-1升/升/分，搅拌转速240转/分，发酵时间在≤8小时内(以8小时为最佳)，再将种子罐已培养好的另一种B.S菌压入本发酵罐中，使H14与B.S两种菌在同一发酵罐中进行协同发酵和共同生长，当发酵时间(以H14菌发酵时间计)达12小时时，发酵罐的通气量增大至1-1.5升/升/分，发酵总时间为24-48小时(以H14菌发酵时间计)，且两菌孢子形成率达80%以上时，即可收获。
6、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(一)二级发酵工艺的(5)产品后处理(第一步浓缩，第二步防腐处理)方法，其特征在于“产品后处理”的
第一步浓缩可用“超滤薄膜过滤器”或用“刮板浓缩机”进行浓缩，将出发酵罐的产品浓缩1-4倍以便于产品的储运(使用时再用水稀释5-10倍)。
第二步防腐处理为了保障产品在长期储存中不变质，在产品经浓缩后再加入相当浓缩液量的0.2%苯甲酸钠搅匀进行防腐，然后包装。
7、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(一)二级发酵工艺的(6)产品质量检验其特征在于在产品质量检验包括
(1)检验H14与B.S的比例，以H14∶B.S＝1∶1为最佳(参考值)。
(2)毒力效价测定参照WHO生物毒效测定方法进行，浓缩后的制品应达到120-240Iu/mg。
8、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(二)一级发酵工艺的(1)菌种斜面，其特征在于“菌种斜面”的“培养基配方”和“菌种斜面培养条件及方法”与前述“二级发酵工艺”的相同。
9、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(二)一级发酵工艺的(2)发酵罐，其特征在于所述的“发酵罐”的
(1)发酵罐培养基配方与“二级发酵工艺”的发酵罐培养基配方相同。
(2)发酵罐的工艺方法将上述培养好的“菌种斜面”，即三角烧瓶液体菌种或茄子瓶菌苔菌种可分别采用下述两种不同方法接种于发酵罐中
A.先将H14和B.S两菌种混合后倒入已准备好的无菌接种瓶中，再从无菌接种瓶引种到发酵罐中(与一般抗菌素发酵时的接种方法类同);接种后即开始发酵，在罐温26-34℃，罐压0.3-0.5公斤/厘米2，通气量0.8-1升/升/分，搅抖260-450转/分(罐体小的转速要快些)条件下，培养24-48小时。
B.在与上述A相同发酵条件的基础上，先将H14接种于发酵罐中，然后在间隔1-8小时内(间隔8小时为最佳)，再将B.S接种于发酵罐中，发酵时间(以H14接种完计)24-48小时，经检验，两菌孢子形成率达80%以上即可收获。
10、按照权利要求1所述的双菌协同发酵法中(二)一级发酵工艺的(3)产品后处理(第一步浓缩，第二步防腐处理)及产品质量检验，其特征在于“一级发酵工艺”的“产品后处理(第一步浓缩，第二步防腐处理)”及“产品质量检验”与“二级发酵工艺”的“产品后处理(第一步浓缩，第二步防腐处理)”及“产品质量检验”方法相同。
全文摘要
一种细菌灭幼蚊剂的双菌协同发酵法是利用B.S格H14两菌混合生长的相容性，把H14和B.S放入同一只装有以花生饼粕粉浸出液为主成分的培养基的发酵罐中进行双菌协同发酵后，生产出一种与B.S或H14单菌灭幼蚊剂有实质差别的细菌灭幼蚊剂；该灭幼蚊剂同时具有H14杀虫谱广，速效和B.S长效的优点，也从根本上克服了B.S杀虫谱窄，作用缓慢和H14无持效的缺点。
文档编号A01N63/02GK1050667SQ9010538
公开日1991年4月17日 申请日期1990年8月28日 优先权日1990年8月28日
发明者陈世夫, 管玉霞, 李德臣, 武秀兰 申请人:山东省卫生防疫站