含有类黄酮醛类的驱避组合物的制作方法

专利名称：含有类黄酮醛类的驱避组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为害虫驱避剂的类黄酮醛类。本发明是通过作为驱蚊剂和用于农业害虫如蚜虫和蓟马的肉桂醛或α-己基肉桂醛的应用来举例说明的。背景今天在很多国家，疾病例如疟疾、媒体传染的出血性发热、蟑螂过敏症、污秽蚤症、腺鼠疫、蜱病毒症、立克次体、螺旋菌、住血吸虫病、和沙蝇热仍是在居民间引起严重疾病和许多死亡的原因。人们对于保护濒危物种关注的不断增长，以及公共卫生广谱性农药有效性呈下降性趋势，迫使科学家们去寻找可提供保护以免受疾病媒介侵害的其它经济方式。但是，对于许多较不发达的国家而言，农药的费用通常太高，且存在着媒介对这些化合物不断增长的抗性这一日益严重的问题。
当其它传统的媒介控制法不可行时，使用驱避剂是一种相当好的替代方法。对于哺乳动物的媒介靶体而言，将驱避剂适当地施用于皮肤或是衣服上是不昂贵，而且是降低噬血节肢动物叮咬活性和防止媒介疾病传播的实际方法。驱避剂对广范围的疾病媒介是有效的，而疫苗则须针对每一种疾病必须个别地开发出来，并且只有一少部分的疫苗对于通过媒介传染的疾病是有效的。通过媒介传播的疾病也会影响植物体。例如，荷兰榆树病破坏了遍及美国的数百万计的榆树。此病是由真菌所引起的，该真菌通过榆树对之有吸引力的特殊昆虫种类在树与树之间传播而造成病害感染。目前的预防法只所获得了有限的成功。因此需要一种对此破坏性植物病害有效的预防法。
取消在媒介控制和疾病预防上使用驱避剂通常是着眼于安全和费用方面的问题。例如，广泛使用的驱避剂之一是6-2-2驱避剂，它包含酞酸二甲酯、乙基己二醇和避蚊酮，比例为6∶2∶2。酞酸二甲酯和避蚊酮仍是限制使用，但在1991年美国环境保护局应有关的生产者的要求，取消所有乙基己二醇的注册。作此之举是因为有新的资料表明它有可能对胎儿发育有不利的影响。
另一例子，最有效的驱蚊剂之一是避蚊胺(N，N-二乙基-1，3-甲基苯甲酰胺)。局部使用时，此物质使其它驱避剂均黯然失色，在其发现近四十年后，它仍是当今使用的最主要的驱避剂。但近年来，氯菊酯-一种除虫菊的合成衍生物，大量地取代避蚊胺，用于衣服和其它纺织物品上。作为驱避剂，避蚊胺是高效的，但它也可能造成过敏和毒性影响，特别是当以高浓度重复用于皮肤上时。含有90％至99％避蚊胺的驱避剂制剂被认为是高浓度的，但含有50％或更少避蚊胺的驱避剂制剂被认为是与100％浓度同样有效。浓度33％的避蚊胺可有效地提供10到14小时的保护。然而，对于含有低浓度避蚊胺的产品，为了使可能的不良作用降至最低，建议在不再需要驱避剂时，赶紧用温和的肥皂清洗皮肤并用水清洗。这些建议通常不适于第三世界国家和军事用途。
现有一些局部施用于哺乳动物以及驱避昆虫使之不侵入居所和其它地区的驱避组合物。但许多这类局部施用组合物的安全性已受到质疑。此外，许多这类局部施用组合物的效果有限，特别是在受昆虫严重侵害的区域。哺乳动物外部昆虫侵害的处理，例如虱或蟹，通常涉及局部施用高毒杀虫组合物于皮肤或头皮。通常会产生刺激，且长期使用而引起的有害于健康的作用也是已知的。因此需要一种对哺乳动物安全有效的局部施用驱避组合物。防止昆虫进入的驱避组合物同样也是没有效果的。因为其高毒性，许多的这类已知驱避组合物在密闭的空间使用也是不安全的，特别是小孩和宠物可能进入而与之接触时。因此需要一种无刺激、无毒性且有效的驱避组合物。
树木和其他木本植物的昆虫侵害每年破坏数百万计的观赏树木和农作物。目前的处理只是部分成功，并会使得农产品作物无价值，因为它们存在残留毒性。因此，也需要一种驱避树木及木本灌木的昆虫侵害的相对无残留的、有效的方法。相关文献美国专利USP5,093,326公开了驱避组合物，其包括臭氧化的未饱合碳氢化合物，包括帖烯。美国专利USP5,365,017公开了具有增加的环阿屯醇水平之转基因植物的制备。与驱避制剂有关的文献包括Reifenrath等人(1989)，J.Am.Mosquito Control Association 545-61和Reifenrath (1995)Cosmetics & Toiletries Magazme 11085-93。
发明概述本发明提供含有类黄酮醛类的驱避组合物和使用这些组合物的方法。这些驱避组合物含有下述(1)中所示结构式的化合物

其中R表示-CH2OH或-CHO；n是从0至3的整数；而每个R1独立地表示OH或是含有从1至10个碳原子和从0至5个杂原子的有机取代基，其中在所述化合物的所有R1取代基中的碳原子和其它原子的总数不多于15；且R4表示氢或含有1至10个碳原子的有机取代基。这些化合物包括天然的化合物如肉桂醛。同样感兴趣的还有α取代的醛，如α-己基肉桂醛(HCA)。使用时，将化合物施用于表面上，如皮肤、衣服、树皮、栖息地等等希望驱避昆虫和其它害虫之处。本发明可用来例如预防因与携带疾病的昆虫媒介或其它害虫媒介接触而造成的疾病和感染。
具体实施方案描述本发明提供获得和/或维持一区域基本上没有昆虫或其它害虫的方法和组合物。与驱避害虫及引起疾病的生物体的方法一起提供的还有哺乳动物、鸟类、鱼类和它们的栖息地，以及种子、苗木、植物或植物部分如果实，它们基本上无病原生物体例如真菌、昆虫和其它害虫以及病毒、细菌、螺旋体和其它引起疾病的生物体、和吸树汁昆虫。将感兴趣的表面与足够驱除昆虫或其它害虫的量之类黄酮醛类接触。所施用的驱避剂的量将部分取决于表面的性质，且在某种程度上取决于所用的制剂和特定的化合物，且因此必须用具体的昆虫或其它害虫经验地决定最好的结果。
本发明的组合物和方法有几项优点是优于现有组合物和方法的。主要的优点在于本配方组合物成分一般是认为安全的(GRAS)且是许可用于食品的，例如，可在本发明制剂中找到用途的芳香醛类，如α-己基肉桂醛、肉桂醛和香草醛是GRAS合成的调味剂(21CFR§172.515)。HCA在1950年以前已普遍使用，且今天仍广泛用在化妆制剂上(肥皂、洗涤剂、霜剂、洗剂、香水)(香味原料专题，Food Cosmet.Toxicol.12suppl.，915，1974)。HCA在1965年得到FEMA的许可GRAS地位(香味提取物生产商联合会、调味成后应用水平的调查，No.2569，Fd.Technol.，Champaign，19(part 2)155，1965)，且被US FDA许可用于食品(21 CFR121，1164)。欧洲委员会(1970)(欧洲委员会，天然和人工调味物质，在社会和公共卫生领域的部分协议，Strasbourg，List A(1)，Series 1，no，129，p.55，1970)在许可的合成调味物质中包括1ppm水平的HCA。
在本发明制剂中可用作乳化剂的表面活性剂，如吐温(聚山梨酸酯)也已经用作食物添加剂，皂草苷也一样(它也得到GRAS地位)。此外，制剂的残留性可以想办法解决。由于可以获得短期残留，因此这对于害虫综合治理有着巨大利益的的公开制剂组分使用许可的GRAS和食物。病原生物体得以长期控制会产生与非转基因植物相比更健康的植物和宿主植物更高的产量。尤其是芳香醛具有积极的器官和嗅觉性能，这些性能在一些情况下可以改善处理的产品的香味和/或臭味，且可以消除与许多害虫驱避剂有关的不愉快气味。例如，α-己基肉桂醛(HCA)的气味被描述为带一些草本特点的花或茉莉样的气味(Technical DataSheet)。
对于植物而言，活性成分可以通过将负责合成各种醛类的一或多种基因引入植物细胞基因组，而由植物生产。因为许多式(1)的化合物，特别是式(3)和(4)的化合物是GRAS食物添加剂，因此使用转基因植物而非局部施用驱避剂于植物体，会降低对摄食植物组织或部分的田野工作者或动物、鱼类或鸟类所可能有的任何不良副作用。除此之外，现今的农药不能转移至例如根来处理根瘤蚜，本发明克服了这一缺点。同样，通过驱除携带疾病或破坏靶体的害虫媒介来避免侵害，会明显地降低将死于由害虫带来的疾病或被害虫的活动所伤害的靶体动物或植物的数目，例如被雌性地中海实蝇产卵于果实中所造成的伤害。
当用于包括人的动物时，本发明制剂是无毒的且在使用浓度下对皮肤无刺激。例如，α-己基肉桂醛(HCA)的大鼠口服LD50为3.1g/kg，经皮LD50大于3g/kg(Moreno，O.M Report to RIFM，March 24，1971)。在吸留的情况下，对未去毛或去毛的免子涂用24小时，发现HCA为纯化合物时有中度的刺激(Moreno)。当用其12％的凡士林膏试验时，对人受试验者的紧贴膏药试验(closed-patch test)48小时后，HCA不产生刺激，且在25位人受试验者上进行的最大限度试验中不产生敏感性(Kligman(1966)J.Invest.Dermatol.47393)。在100位人受试验者上进行的重复损害膏药试验(insult patch test)中，在邻苯二甲酸二乙酯中的20％HCA不产生阳性反应。在文献中可以找到18种芳香化合物的Jimbo制成表的过敏性数据。虽然肉桂醛在人的最大限度试验中有阳性反应，但HCA在此试验中的反应是阴性的。2％的HCA在100位湿疹和皮炎患者上的膏药试验结果是阴性的(0/100)。4位对2％肉桂醛敏感的患者，未见对2％的HCA有交互反应。对肉桂醛频繁报道的皮肤过敏可能是由于蛋白上的氨基酸与醛功能基团反应而刺激的。在相对于醛基的α位上的大烷基基团的取代(例如HCA的己基)，可以通过创造立体障碍以及减少醛碳原子的亲电性来降低这种反应。α-取代的肉桂醛的皮肤敏感性是不常见的。与肉桂醛相比，α-己基肉桂醛与胺的反应非常缓慢或甚至不反应。在用豚鼠作的最大限度试验研究中，Senma及其合作者报道有这么一种趋势，即，在肉桂醛的α位上取代烷基基团的烃的数目增加，则敏感性反应的速率降低。
本制剂也提供对多种生物体如真菌和昆虫的有效控制。已有报道说这些化合物对C.botulinum孢子萌发有抑制活性。BowlesMiller，G.Food Protection(1993)56788-794。这种多靶体效力减少了对意欲保护的植物或动物施用药剂的需求，且基本上消除使用杀虫剂的需要。在特殊的情况下，例如在昆虫破坏动物或植物部分或组织且第二种真菌或细菌疾病产生之时，本发明的这一方面尤为优越。
本发明制剂示于下述式(1)中。优选的制剂示于下述式(2)中

其中R1表示-CHO，R2表示-OH或含有1至10个碳原子的有机取代基，而R3表示甲氧基或含有1至10个碳原子的有机取代基，R4表示氢或含有1至10个碳原子的有机取代基。特别感兴趣的是类黄酮醛类，特别是芳香族醛类。使用于本发明的芳香族醛类的例子是肉桂醛(下述(3))

和松柏醛(下述(4))

其它感兴趣的化合物包括式(1)化合物的类似物如在α位由烷基如己基或支链烷基如戊基取代的化合物。通常在α位的基团是C-5至C-10。这些化合物包括α-己基肉桂醛和α-戊基肉桂醛。α-己基肉桂醛(HCA)的化学结构式示于下述(5)中

化学文摘服务社(Chemical Abstracts Service(CAS))的HCA名称是2-(苯基亚甲基)辛醛，CAS登记号是[101-86-0]。此化合物的化学名称也称作2-己基-3-苯基-2-丙醛。此化合物的分子式是C15H20O，分子量是216.3。HCA可以由Firmenich得到，其产品主要由(E)-顺式异构体(最高为93.8％)和(Z)-反式异构体(最高为6％)组成。其中的少量组分是辛醛的自醛醇缩合(1-1.5％)(PersonalCommunication，June Burkhardt，Firmenich，Plainsboro，New Jersey)。
这些化合物能单独使用或与其它活性或非活性物质组合使用，并能以含有此活性化合物的现有的最适合于特殊目的之浓缩液、溶液、悬浮液、粉末等等形式来进行喷雾、浇注、浸蘸、注射的方式施用。它们也可以以例如稀释溶液的形式或溶在适合的溶剂中，作为灌溉工作的一部分或作为单独的施用，直接施用至根际。
用作叶片喷雾时，虽然醛类可以单独加工，但它也可以通过包括乳化剂如吐温80而付诸实施。可以使用的其它洗涤剂包括阴离子洗涤剂如在美国申请专利4,978,686中所描述的那些。可单独或与洗涤剂结合使用的其它化合物包括从多种来源来的皂草苷，特别是从Yucca schidigera或Yucca valida来的皂草苷。一般说来，使用于此制剂的洗涤剂或其它试剂不减损类黄酮醛类的驱避特性，但确会增加此制剂实质上的特性(参见，例如，美国专利USP4,477,361)且能改进农药的特性，包括杀真菌剂特性(见下文)。附加的组分如多元酸盐类如碳酸氢钠、硫酸钠、磷酸钠或磷酸二氢钠的水溶液制备液可以包括在此制剂中，以增加此制剂的抗真菌特性。使用时，将所得的乳液稀释至适当浓度。
在优选的实施方案中，此制剂包括α-己基肉桂醛、肉桂醛和/或松柏醛，制剂中还包含作为乳化剂的吐温80或皂草苷，且能包括碳酸氢钠。用于驱除蝇、蚊、蚤、蜱、虱、蟑螂、两点叶螨、银叶粉虱(silverleafwhite flies)、蚜虫、叶蝉、蓟马和蚂蚁的优选制剂是10-5000ppm；用于蜱的为100-2500ppm。一般而言，在制剂中存在的醛类总量是2％或更少。此制剂在不使用抗氧化剂的情形下是有效的，虽然有些特殊的醛类含有与生俱来的抗氧化剂特性，例如，松柏醛。醇类如二元醇类，包括丙二醇，同样不是增加制剂的效力所需的，而且事实上可能对植物有害。
此制剂的稳定性可通过多种方法来评估，包括加速试验，在试验中感兴趣的制剂在一定时间内暴露于增高的温度下。制剂样品以一定的时间间隔取出，并用本领域技术人员已知的方法来进行化学分析，确定分解的速率和性质。例如，HCA可以用气液色谱(GLC)来分析，采用30米非极性聚二甲基硅烷毛细管柱(例如，HP-1，Hewlett-Packard，或SPB-1，Supelco)和火焰-离子检测器(PersonalCommunication)。采用氦作为载气(8ml/分钟)，柱温为大约240℃，(E)-顺式异构体(主要组分)的保留时间为大约6.0分钟，(Z)-反式异构体(少量组分)的保留时间为大约6.3分钟。
包括式(3)和/或式(4)和/或式(5)化合物的组合物的最有效量以及有用的其它式(1)化合物的量，可以采用本领域技术人员已知的用于评价化合物驱避效力的方案来确定。此方案的实施例示于下文中。这些方案也可以用来最佳化用于特定病原的采用式(1)或式(5)所包括之任一化合物的各个制剂，以及在使制剂的抗病原效果达到最大的同时，最佳化特定施用的各个制剂，使植物毒性或皮肤敏感性以及其它对于动物体的副作用降至最低。
在一些情况下，可以通过将一个或多个其它组分(即，除式(1)或式(5)化合物外的化合物)加入意欲改变其一些特殊方面的制剂中，从而增加制剂的效果。例如，对某一植物而言，如果使用时植物毒性大，则会希望降低植物毒性作用(植物毒性等级为2或更少，优选为1或更少，见下文)，或是希望增加制剂驱避作用，或是两者均有。优选的是，附加的组分在增加制剂驱避作用的同时，能使对植物体或动物体的副作用降至最低。特别感兴趣的是使用这样一或多种组分，它或它们是增加驱避性的且与之同时能使与特定的制剂有关的任何副作用降至最低的增效剂。“增效剂”是指这样一种组分，由于它的存在，使所期效果大于加合效果。在保存或增高制剂的所期效果的同时，可以对一或多种其它制剂成分的浓度作修改。特别感兴趣的是，向制剂中添加多种组分，使一给定的制剂中的一或多种其它成分的浓度降低，而与之同时基本上保持该制剂的效力。此种组分与制剂中的其它组分组合可以在混合和/或此组合物应用的任何适合阶段里完成。
优选的附加成分为皂草苷，因为它们可以代替表面活性剂作为乳化剂，且此外在所用的浓度下对至少相同的植物具有生长促进剂的作用。皂草苷是一类化合物，各由皂草配基部分和糖的一部分所组成。皂草配基可能是类固醇或三萜，且糖部分可以是葡萄糖、半乳糖、戊糖或甲基戊糖。S.Budavari，ed.，The Merck Index，11th ed.，Merck & Co.，Inc.，Rahway，N.J.，1990，p.1328。用于本发明的皂草苷可以或用本领域已知的方法从多种来源的多种植物部位生产或分离出来，植物部分包括果实、叶片、种子和/或根，所述的来源包括许多已知的产生皂草苷的植物，范围从丝兰、皂树、龙舌兰、菸草、甘草、大豆、人参和芦荀到芦荟木。与本发明一同使用的皂草苷优选是对人或高等动物无毒的。用于本发明的皂草苷最优选是无毒性的食物级品，其来源来自丝兰植物。更优选的皂草苷是来自Yucca schidigera或Y.valida以及它们的等同物。皂草苷一般是通过一种冷压萃取方法制得的且使用所得的液体萃取物。也可使用丝兰的纤维；典型地是将其日晒，研磨并且筛选大小。通常皂草苷的有效量是在0.01至0.1％的范围内，且最优选是约0.01％v/v的10°白利皂草苷萃取物水溶液。
已知有许多结构上相关的皂草苷，最多变的结构特征为糖基化型式。皂草苷也可能含有附加的修饰，例如萨洒皂草苷，它是带有附着的类固醇的皂草苷，且皂草苷的结构可以通过本领域已知的任一种酶的、化学的和/或机械方法修饰。来源于Yucca schidiger的皂草苷含有类固醇皂草苷，该类固醇皂草苷带有的主要皂草配基是萨洒皂草配基和惕告配基(tigogenin)。萨洒皂草苷水解时产生萨洒皂草配基(萨洒皂草配基5-β，20-βF，22-δF，25-βF；也被称作螺甾烷-3-β-01以及洋菝葜配基)、葡萄糖和半乳糖。萨洒皂草配基的分子式为C27H44O3。Nobel，Park S.，Agaves，Oxford Univ，Press，NewYork，1994。已知有多种结构上相关的皂草苷，最多变的结构特征是糖基化型式。S.Budavari ed.The Merck Index 11th ed.，MERck & Co.，Inc.，Rahway，N.J.1990，p.1328。皂草苷也可能含有附加的修饰，例如萨洒皂草苷，它是带有附着的类固醇的皂草苷，且皂草苷的结构可以通过本领域已知的任一种酶的、化学的和/或机械方法修饰。通常，皂草苷的有效量是约0.01至3％且优选是约0.25％v/v的10°白利皂草苷萃取物水溶液。10°白利是糖化学领域中的术语。白利度等于糖在溶液中的重量百分比。Hawley，ed.，简明化学词典，10th ed.，Van NostrandReinhold，New York，1981，P.149。
在制剂是用来制备种植易受特定病原感染的宿主植物的土地或其它生长底物的应用中，特别是在生长底物已经受到侵染时，可以将本发明制剂直接加到根际或底物或可以将其结合到一固体支持物或是将其包囊于缓释材料中，以驱除有害昆虫或其它害虫。当采用固体支持物时，应避免使用可导致活性醛类氧化的材料。可以使用的释放体系的例子包括淀粉-葡聚糖等等。其它的适宜材料的例子参见Yuan等人的基础和应用毒物学(1993)2083-87。
除前述式(1)、(2)、(3)、(4)和(5)的具体化合物外，任何这些化合物的前体，只要该前体在生物体系的作用下，产生与上述结构式相同的化合物，则被认为等同于本发明化合物。因此前体化合物应用于植物体部分或组织将会等同于本发明的实际应用。前体化合物之生物转换成类黄酮醛类已描述于例如美国专利USP5,149,715及其所引用的参考文献中。也可参见Casey和Dobb Enzyme Microb.Technol.(1992)14739-747。
本发明方法是通过将足够量的驱避剂引入至感兴趣之表面以驱除昆虫或其它害虫而实施的。此外，当感兴趣的表面是皮肤、皮毛、发、衣物等等时，施用可以通过用制剂与感兴趣的表面接触来进行，制剂是为感兴趣的表面而付诸实施的，从而使驱避量的制剂留在处理过的表面上，且以足以驱避敏感的昆虫或其它害虫的速率释放。含有驱避剂的制剂通常是通过局部应用而引入表面的。例如，以湿或干的制剂将制剂喷雾在表面和/或当感兴趣的表面适合时喷雾至下表面。适合施用的制剂是喷雾剂、粘着剂(stick)、和驱避油剂或膏剂。在一些情况下，可以用驱避制剂浸渍感兴趣的表面。另外，可将制剂以湿或干的形式施用至根际，在那儿它可以在根系的附近蒸发，并与聚生于根系的病原生物相作用。在一些情况下，可以将空气导入根系，以增加蒸发过程。为防止昆虫侵入一地区，可以将本发明组合物施用于此地区内的表面和/或周围，例如，可以将组合物施用于门、窗和建筑物的其它入口和/或这些入口周围的表面。
当感兴趣的表面是植物或植物部分时，驱避剂的存在可以是局部施用的结果，例如组合物可以经空中施用于作物，或是作为基因修饰宿主植物的成果，驱避剂可以由宿主植物合成。
本发明之芳香族和脂族的醛类能通过本领域技术人员已知的多种合成的方法制备出来。例如，参见J.March ed.，Appendix高级有机化学反应机理和结构，2nd Ed.，McGraw-Hill，New York，1977。肉桂醛能被合成地制备出来，例如通过肉桂醇的氧化作用(Traynelis et al.，美国化学联合会杂志(1964)86298)或通过苯乙烯和甲酰甲基苯胺的缩合作用(英国专利GB 504,125)。此醇类也可从自然来源分离。例如，肉桂醛分离自腐木真菌，密绒韧革菌(Stereumsubpileatum)。Birkinshaw et al.，Biochem.J.(1957)66188。α-己基肉桂醛(HCA)可以由稻获得，或按USPN 5,055,621中所描述的方法合成。
在植物中产生本发明制剂所需组分的优选方法是经重组DNA的方式，特别是通过在感兴趣的植物组织中，经本领域已知的技术所构建的转基因植物来改变至少一种式(1)、(2)、(3)、(4)和/或(5)的感兴趣化合物的水平。这些方法涉及用在植物细胞中有功能的表达盒、转录与转译起始调节区和转译与转录终止区来转化感兴趣的植物细胞，所述的表达盒是作为5′至3′方向转录的可操作连接组分包含于植物细胞中，而转录和转译起始调节区域在可读框5′内结合至编码和能够调制生产的DNA序列上和/或是为生产感兴趣化合物所需。由于感兴趣化合物生物合成中所涉及的酶浓度改变的结果，因此生产此化合物所需的酶的表达提供了化合物产量的增加。特别感兴趣的是在植物组织例如叶子、根、果实和种子内选择性控制肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA的生产。植物、植物部分、植物细胞、特定植物组织中的和/或与植物生长的特定阶段相关的感兴趣的化合物水平的控制，需要一或多个基因或编码基因或多种酶或酶途径或簇(cluster)，通过调制它们的表达，可经产生本发明制剂之一个或多个化合物。
此酶或此类酶可以在生物合成途径或降解途径中，并且能分别向上调或下调，即，调节固有或内源植物基因的表达。固有植物基因是对宿主植物基因组而言是天生的基因。内源植物基因是存在于所感兴趣的宿主植物基因组中的基因，它可能是固有植物基因或是由于植物感染的结果而存在的基因(例如病毒基因)，或自然地掺入植物基因组的基因。宿主植物也能通过重组方法来修饰或通过传统植物育种方法来引入一个或多个对宿主植物而言是外源的编码酶的基因，而所述的酶控制感兴趣的化合物水平和/或是在式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)的一或多个化合物的合成途径上的酶。“基因表达的调控”是指在转录、转译和/或转译后水平上控制感兴趣基因产物的生产。感兴趣化合物的水平是通过调控一或多个内源基因或转基因的表达来控制的，而这些基因编码一或多个合成感兴趣之化合物所需的酶。
调控在植物体中的基因表达的方法是本领域已知的。对植物体进行生长条件的改变或外用化合物可以影响基因的表达。在分子水平上，基因的表达基本上依赖于调节结构基因编码区表达的转录、转译和终止控制区。通过利用调节这些控制区的植物信号或直接对这些控制区进行重组操作，可以对(例如)控制肉桂醛水平所需的酶之编码基因的表达进行调控。在对植物体外源提供的转基因的应用中，该转基因将包含控制区，而该控制区是选择和设计来获得所需的组织和/或基因表达的水平和时间的。适宜的话，控制区对感兴趣的基因而言可能为同源的(天生的)或非同源的(非天生的)。“同源的”它的意思是控制区源自或基本上相似于通常与感兴趣的基因有关联的控制区。“非同源的”它的意思是控制区源自不同的核苷酸来源或序列或是基本上不同于通常与感兴趣的基因有关联之控制区。例如，如果与控制区相比，此编码酶的序列在来源上是非同源的，为了使此基因在感兴趣的植物细胞内有表达，则必须可操作地提供在这些植物细胞中有功能的转录和转译起始调节区或启动子，使之与编码序列连接。在植物体内有功能之转录和转译起始信号包括那些存在宿主植物体或其它植物种类基因，并在宿主植物体内直接组成性或选择性的表达。
特别感兴趣的是这类基因控制区，其选择性地调节在植物体、植物部分、植物细胞、特别的植物组织之结构基因的表达和/或是与植物生长的特定阶段有关。优选的是那些本领域已知的控制区，特别是转录控制区或启动子，其可以用来调制编码酶之基因的表达，而所述的酶是在植物、植物部分、植物细胞、特定的植物组织中控制式(1)、(2)、(3)、(4)化合物水平所需的和/或是与植物生长的特定阶段有关。例如，在果实中显示不同表达类型的启动子描述于美国专利USPN4,943,674和美国专利USPN 5,175,095中；在种子中的情形描述于美国专利USPN 5,315,001中；以及在快速发育组织及嫩芽中的情形描述于美国专利USPN 5,177,011中。
在感兴趣的组织内选择性控制肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA在植物中的生物合成，也将植物细胞用包含结构基因之编码DNA的表达盒来转化，其中结构基因是合成肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA所需的、并能够在感兴趣的组织中增加这些醛类水平的一个或多个酶的结构基因。特别感兴趣的是那些能够由通常见于植物细胞中的底物，代谢出感兴趣的肉桂醛和/或松柏醛和/或HCA生物合成所需的前体化合物的一个或多个酶的编码基因。更优选的是至少一种式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)化合物的转基因表达。
可以制备表达感兴趣基因的DNA构建体，该DNA构建体提供将表达盒整合入宿主植物的基因组内。整合可以本领域已知的转化体系例如土壤杆菌(Argobacterium)，电穿孔法或通过高速微粒介导转化法来完成。根据此应用，皂草苷或感兴趣的其它化合物之一可以在感兴趣的组织和/或特别的细胞器内优先地表达。组织特异性是通过使用具有所需表达条件之转录调节区来完成的。将酶转移至特定的胞器可通过使用适当的转移肽来完成。业已描述的DNA构建体的组织和胞器的特异表达的方法是本领域已知的。
为了确认感兴趣基因的调节和表达，有许多的技术可确定存在于植物细胞内的所需DNA序列是否已整合入基因组中并且被转录出来。这些技术如Northern印迹法可以用来检测编码所需酶的信使RNA。表达可以进一步通过分析酶活性或对蛋白质产物免疫分析来检测。更优选的是，存在于宿主植物体中的感兴趣化合物水平是用本领域已知的方法来测量。例如，所需的表型是，正如用感兴趣的基因表达所确定的，在感兴趣的植物组织内皂草苷的含量增加，和/或与对照植物相比，在植物宿主细胞中的HCA水平增加。
为了将本制剂的一或多个化合物引入到靶体生物体内，将靶体生物体暴露于此驱避制剂的至少一种成分，从而产生一种对控制感兴趣化合物水平的酶之编码基因进行表达的宿主植物。驱避制剂的至少一种成分可以通过植物宿主表达，并且任选驱避制剂的其它成分外源地应用于植物宿主，这样来组合地诱导出所需的驱避效果。
可以制备出一种转基因植物，该转基因植物具有增加的累积类黄酮醛类例如肉桂醛和松柏醛能力以提供抗植物害虫的自我保护作用或被用来当作萃取类黄酮醛类天然的来源并随后用作驱避剂。
类黄酮醛类的累积能通过下调特定植物基因的表达来获得，其中的基因是引起所需的醛类进一步代谢或从所需的醛类中转移走代谢中间产物的酶的编码基因。在肉桂醛的情况下，例如，累积涉及向下调节肉桂酸4-羟化酶(CA4H)和肉桂醇脱氢酶(CAD)。CA4H平常是从肉桂醛转移走一些肉桂酸，产生对-香豆酸，对-香豆酸本身是代谢中间体。单独降低CA4H活性不足以造成肉桂醛的累积，因为CAD可以快速地将肉桂醛转化成肉桂醇，然后肉桂醇逐渐并入木质素或以糖苷累积。同时降低CA4H和CAD两者的活性会造成由肉桂酸至肉桂醛代谢转变的增加且降低肉桂醛至肉桂醇的转化。一些肉桂醛逐渐并入木质素，但肉桂醛(或是游离的或是作为糖苷)也累积至超过正常水平，特别是在肉桂酸的生物合成增加时。这种情形发生在苯丙氨酸氨裂解酶(PAL；在一般的苯丙酸类代谢的第一和限速步骤，Hahlbrock andScheel(1989)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40347-369)活性高时，一种自然发生在植物体中的情形，它是对包括被真菌侵害和与受伤及昆虫吃咬的机械伤害的广泛刺激反应。
抑制在转基因植物体内的CAD活性已被提议作为在植物体内降低木质素的合成且由此改善饲料作物的消化力的方法(WO93/05159)。虽然这些实验表明木质素的生物合成已有质量上的改变，但无需作数量上的改变，但是并未清楚或使人认识到这样一种希求，即，累积肉桂醛可作为增加对昆虫和其它害虫驱避性的方法。
业已克隆出一些植物CA4H和CAD基因，并且其序列能自基因库(GeneBank)中得到。这些包括在不同植物种类间为保守的核苷酸序列的基因部分，可以直接用在植物表达载体上(反义或有义方向)，用以抑制相应的内源基因的表达(例如，Pear，等人The Plant CellAntisense Res.and Develop(1993)3181-190，Napoli，等人ThePlant Cell(1990)2279-289)。更优选的是，这些保守的基因序列可用于从意欲修饰的植物种类的cDNA文库分离出CA4H和CAD cDNA克隆。所得到的cDNA克隆或其中部分，之后被引入植物表达载体(反义或有义方向)且用于转化感兴趣的植物。根据本发明的DNA构建体优选包括一个至少50个碱基的序列，该序列与内源CD4H或CAD基因同源。
重组DNA分子可以通过将载体可操作地连接于有用的DNA片段以形成可用来作植物转化的质粒。能够由基因的克隆部分引导RNA表达的载体在本文中被称为“表达载体”。此表达载体含有包括启动子的控制元件。可用于在高等植物中表达基因的典型载体是在本领域所熟知的，且包括根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefeciens)Ti质粒所衍生的载体，这些衍生载体由Rogers等人在Methods in Enzymology(1987)153253-277中作了描述。用于提供引入基因强的组成性表达的普通启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(可得自Pharmacia，Piscataway，NJ)。可以使用组成性启动子(如CaMV35S)或可诱导或发育调节的启动子(如来自PAL基因或CA4H或CAD基因的启动子)。使用组成性启动子将容易影响植物体所有部分的功能，而使用可诱导性或发育调节的启动子，则具有反义或有义RNA只会在它所需的组织和条件下表达的优点。在本发明中，使用发育调节的启动子是优选的，因为已知苯基丙酸类生物合成的下调作用能够在含有异源PAL基因的转基因植物的发育中产生不良的副作用(Elkind，Y.等人1990)Proc.Nat.Acad.Sci.(1990)879057-9061。
有许多不同的转化方法可用于作为广泛的植物种类的例行转化作用。一种对于将DNA转移至双子叶植物特别有效的方法涉及使用土壤杆菌。在此方法中，将感兴趣的基因插入T-DNA区域边缘之间，该T-DNA区已用可选择的标记基因剪切成小的重组质粒(例如编码新霉素磷酸转移酶II或磷酯酰苏氨酰(phosphinothricin)乙酰转移酶)。然后将此重组质粒通过转化或是三亲代交配引入土壤杆菌宿主内。此携带感兴趣基因的土壤杆菌株通过将适宜的植物组织(例如叶盘)与此细胞从共同培养来转化植物组织。转化的细胞在组织培养中以适宜的筛选试剂筛选出来，并且植物体随后再生(参见Horsch.R.B.等人Science(1985)2271229-1231)。其它已用在转化植物细胞的方法，特别其它更难对付的作物之转化作用的方法包括biolistics和电穿孔法(详细方案参见Sanford等人(1993)Methods in Enzymology 217483-509；和Potter(1993)Methods in Enzymology 217461-478)。
一旦生产出转基因植物，就可用CA4H和CAD的传统酶分析来确定在不同转化体中所达到的抑制酶活性的水平。可能只有一小部分所产生的转化体具有足够低的酶残留活性去引起类黄酮醛类的累积，且在植物生长过程中不产生一些不良的副作用。为此，用抑制的CA4H和CAD生产所需转化体的优选方法是分别将这两种基因引入不同的转化体，之后通过标准的有性杂交将它们结合。这使得大量基因抑制水平的组合能同时被评估。
在转基因植物内过量产生类黄酮醛类的另一种办法是使用一类植物基因，这些植物基因赋与微生物宿主合成特定的类黄酮醛类能力。所得的微生物能用于在发酵体系中生产类黄酮醛类或是在活的或非活的微生物制备物中作为类黄酮醛类的天然运输体系。酵母菌，特别是啤酒糖酵母是此目之优选生物体，因为它已经作了高水平表达PAL的基因工程改造(Faulkener等人，(1994)Gene 14313020，)，且植物的肉桂酸4-羟化酶业已显示在酵母菌内是有功能的(Urban等人，(1994)Eur.J.Biochem 222843-850)。
PAL的表达引入了由苯丙氨酸产生肉桂酸的能力。需要两个另外的酶步骤从苯丙氨酸产生肉桂醛。在植物体，这些步骤由酶肉桂酸酯CoA连结酶(CL)和肉桂酰CoA还原酶(CCoAR)所催化，但4-香豆酸CoA连接酶(4CL)也能用肉桂酸当作底物(Knobloch和Hahlbrock(1977)Arch.Biochem.Biophys.184237-248)，4CL可以用来取代CL。多于20个克隆的PAL基因和多于6个4CL基因已经作了足够详细地描述(GeneBank)，足以利于它们在实施本发明时的使用。CCoAR的基因通过使用标准基因克隆技术来分离cDNA克隆而得到，所述的cDNA用作由N-末端的氨基酸序列、或肽片断、或纯化蛋白所衍生的探针序列。CCoAR已从如下物质中纯化出来并且作了部分特征描述大豆培养物(Wengenmater等人(1976)Eur.J.Biochem，65529-536；Luderitz和Grisebach(1981)Eur.J.Biochem，119115-124)，云杉形成层汁(Luderitz和Grisebach supra)，杨树木质部(Sarni等人(1984)Eur.J.Biochem，139259-265)和桉树(Eucalyptusgunnii)分化中的木质部(Goffner等人(1994)Plant Physiol.106625-632)。纯化优选方法是Goffner等人(同上)的方法，因为该方法可得到在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的单个蛋白质带，该带可作蛋白质序列分析。
通过标准的转化技术如电穿孔(Becker和Guarante(1991)Methods in Enzymol，194182-187)，将克隆出的基因引入标准的表达载体并转化微生物宿主，优选酵母。用标准的酶分析确定基因工程改造过的基因的功能性表达，并用类黄酮醛类的分析来选择有最大生产量的菌种。因为类黄酮醛类有抗微生物的特性，因此它优选使用这样的表达载体，即只会在生长循环的后期造成引入的基因表达或是对化学引诱物有响应的表达载体。也有可能希望在一固定的全细胞反应器(例如Evans等人(1987)Biotechnology and Bioengineering 301067-1072)中生长经基因工程改造过的微生物宿主，以此避免醛类在培养基内累积。
靶体昆虫和其它害虫是指那些为疾病生物体媒介的昆虫和害虫，疾病生物体如聚生于植物一部分的表面上的真菌，而植物则为真菌的诱发者。诱发者是指植物分泌真菌所需的营养物。真菌以其聚生的植物体部分的例子如下。果实上的黑斑病菌，花、根和叶片上的镰孢属(Fusariumsp.)，和根和叶片上的镰孢属(Fusarium spp.)和曲霉属(Aspergillus)。镰孢属引起一年生蔬菜和花卉、多年生草本观赏植物、栽培作物和含羞草之维管枯萎。不同的植物受真菌的特定类型或种侵害。轮枝孢属(棉黄轮枝孢和大丽轮枝孢)引起维管枯萎和聚生于根、花和叶片上。除此之外，下列也构成靶体生物体；多孢锈菌属(Phragmidium spp)；玫瑰双壳菌(Diplocaopan rosae)；单丝壳菌(Sphaerotheca tannosa)，Oibiapsis sicula；疫霉菌(Phytophthorataraesitica)；蔓延疫霉(Phytophthora infestans)；柄锈属(Pucciniaspp)；链格孢属(Alternaria sp)；Susaium spp；灰色葡萄孢(Botrytiscinera)；核盘菌(Sclerotinia homoeocarca)；Tricophytonmentagrophpytes；荷兰榆树病菌(Ceratocystis ulmi)和橡树枯萎病菌(C.fagacearum)。Ceratocystis引起维管枯萎，主要是树的。也包括蓝藻(Cyanobacteria)。可用本发明制剂驱避的这些疾病的媒介包括甲虫和胡蜂。靶体生物体包括昆虫，特别是直翅目；缨翅目，它包括水生象甲(water weevil)和蓟马；及同翅目，它包括蚜虫如根蚜和叶蚜、叶蝉、粉虱、绵蚧、蓟马、蝉、毛虫如黎豆夜蛾毛虫、苹蠹蛾、卷叶螟和蚧。其它的靶体生物体包括蛛形纲(特别是叶螨)、蝇类(家蝇)、蟑螂、腹足纲、蛾类和臭虫(温带臭虫(Cimex lectularis))及其相近的种类(鸡臭虫(Haematosiphon indorus Duges))和欧洲鸽臭虫(Cimexcolumbarius Jerjus)和燕臭虫(Oeciains vicarius Hrovath)。
同样特别感兴趣的是通过驱避根瘤蚜来避免在葡萄上受根瘤蚜的侵害。为了此应用，需要将此制剂释放至根瘤蚜通常栖息的植物根系。当以固体形式或微胶囊形式使用时，典型使用的剂量是1％至35％(w/w基准)的量级，意欲决定的最大负载为所选择的壳物质之函数。用分析化学技术决定和最佳化释放速率。为了定性，可以使用GC技术来决定释出之醛类的量。包囊(丸化)的产品样品与所选择的土壤混合并在不同时期采样以测量释放情况。另外，也可以分析从此制剂释放出的挥发性气体。为了测定叶面和滴灌溉应用的活性，也可将制剂经一定时间的稳定性用本领域技术人员已知的GC方法来评估。也可制备此制剂的甲醇或乙醇萃取液用于HPLC分析。然而，优选的驱避根瘤蚜和其它根部生长的害虫的方法是提供例如叶面施用的系统反应，将叶面施用的制剂转移至根系。对于具体的植物需要经验性地确定这类施用的时间，因为由叶面至根的水流是转移所需的。通常，这种流动在如下情况下最快在较凉的时间例如在傍晚时分，在夜间或在一清早的时间，和在果实生长前或后或植物发育时。
本发明制剂，特别是那些含有HCA的制剂，也可用于处理葡萄，以驱避蓟马、线虫和卷叶螟；玫瑰，以驱避蓟马和棉铃虫；牛，以驱避软蜱；人，以驱避蚊虫；苹果，以驱避苹蠹蛾；动物，以驱避蚤；蟑螂栖生地，以驱避或消除蟑螂滋生；和玉米，以驱避根蚜(root aphid)。
除了处理宿主植物，也可用本发明制剂来处理种子以驱避侵害种子和/或当作疾病生物体媒介的昆虫或其它害虫。可以用粉制剂来喷粉(可以吸附本制剂的无机材料，参见美国专利申请4,978,686)或在植物底物如蛭石中混合。在无菌的环境下由处理过的种子生长成的幼苗是不受真菌和昆虫的影响。另外，幼苗也可以用此制剂处理。在一些情况下，当柔弱嫩芽较可能显示植物毒性的症状时，需要调整处理的制剂，从而减少任何与处理有关的植物毒性。处理制剂也可以用于控制开花植物的传粉时间。例如，为防止或延迟传粉，将制剂以足以驱避蜜蜂和其它传粉昆虫的量施用。通过调节制剂的残留性，人们可以控制抑制传粉的时间长度。另一方面，对于植物而言，不管异花授粉是否是授精之所需，如果传粉昆虫被制剂所驱避，应当避免在此期间施用此制剂，为了决定具体昆虫对所要求的组合物之驱避性的敏感性，采用体内或体外试验，在试验中比较靶体害虫朝向行为，例如接近存在或不存在试验制剂的“诱饵”食物。经一段时间的制剂效果可以通过将观察时间延长直到只有少数试验昆虫(约少于50％)从诱饵的附近驱避走。对于病原媒介昆虫，90％或更大的驱避率通常是适宜的。对于普通的令人讨厌的害虫，降低到80％程度是适合的(例如在花园或食物区)。此制剂还需要评估其用在植物上的植物毒性和表皮敏感性，特别是用在人类的皮肤和/或衣服时；接触性皮炎和嗅觉敏感性采用本领域技术人员已知的皮肤敏感性试验来监测。同样，植物毒性检测可以采用本领域技术人员已知的方法来进行。植物毒性可以毒性严重性增加的顺序分级如下0-植物没有任何症状；1-下胚轴非常轻微的变棕(没有其它症状)；2-植物有一些枯萎，下面的叶片垂死，维管系统有一些变棕；3-整株植物枯萎，叶片垂死，下胚轴有外在和内在的症状；4-根坏死，植物垂死。优选的是，所用的制剂具有2级或更低的植物毒性等级，更优选1级或更低。
意欲作特殊应用的制剂组分可以如下确定首先，评估一浓度范围，该范围从给定的组分无活性至提供最大活性(剂量响应曲线)，然后将此组分分别和与给定制剂的感兴趣的其它组分组合进行评估。然后针对带或不带感兴趣的任何附加组分的系列稀释液的各个配方和组分，确定具体制剂对于给定的昆虫或其它害虫和宿主的驱避性和/或植物毒性和/或表皮影响。最佳采用本领域技术人员已知的技术用体外或体内试验计算。确定提供如下效果的制剂90％的驱避率，和/或对植物的植物毒性等级为2或更低，优选为1或更低，对动物和家禽基本上没有接触性皮炎。
以下例子是以说明而非以限制的方式给出。
实施例在下文中给出的实施例方案使用下列产品(1)肉桂醛，来自Spectrum Chemical Co.，New Jerscy，USA；(2)松柏醛，来自ADNI Chemical Co.，VF；(3)碳酸氢钠和吐温80，来自SpectrumChemical Co.，New Jerscy，USA。
实施例1蝇类(家蝇)此试验的目的是评估肉桂醛和α-己基肉桂醛对蝇类(家蝇)的驱避活性。二十只2-3日龄的雌蝇被放于62×62×34cm的笼子内，笼子带有325目的顶部筛网以允许空气的流通(Carolina BiologicalSupplies)。诱饵由甜牛奶(Carnation)(90％)加上葡萄糖(10％)和染料(溴酚蓝0.01％)及1毫升的制剂所做成，并放于3.5cm培养皿中，并置于松木笼内(Carolina Biological Supplies)，木笼有一从顶端钻下的一直径为1cm洞，以方便接近含有诱饵的笼子。装有5毫升水的直径3.5cm的培养皿放于笼中供给水分。24小时后，将蝇移出，并压碎在滤纸上，检查染料的存在，染料指示取食的活力。多于10％的蝇进入取食，则认为制剂缺少驱避活性。
实施例2蟑螂(德国小蠊)此试验的目的是评估肉桂醛对蟑螂(德国小蠊)的驱避活性。五十只蛹和体长1.5至3.5cm的成虫被放于62×62×34cm的笼子内，笼子带有325目的顶部筛网以允许空气的流通。笼子的内表面墙从地板5cm至10cm处用矿物油和石油胶(2∶3)的混合物处理以避免蟑螂逃走。蟑螂用狗食(Purina)、牛奶粉和水饲喂48小时，使之适应环境。两张Whatman滤纸“C”(4×4cm)对折两次，用钉书钉钉好，并用1毫升的每一种制剂浸湿。滤纸随后于空气中干燥。滤纸放进两个4cm×4cm×4cm的立方体内，各在地面(底)层带一单独0.75cm的门以便进入。两个藏匿盒放于14cm远的笼子地板底端。20小时后，将藏匿盒移走，并将且藏匿的蟑螂移走并计数。大于10％的蟑螂进入藏匿盒内则认为制剂缺少驱避活性。
实施例3蚜虫(甜菜蚜)此试验的目的是评估肉桂醛制剂对黑豆蚜虫的驱避活性。在温室内，让甜菜(Beta vulgaris)在7.5mm直径盆的培养土中生长。当植物达到三叶期时，随机选择八株植物。在分别的试验中，将四株植物作如下处理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐温80)；NaHCO3；吐温80；和空白配方。处理是叶面施用，用手动喷雾器(Gilmour)喷施5毫升的物质成细雾状。另四株植物则不处理，一株只用水喷雾。处理过和末处理的植物分别摆放成两行，A或B，处理或未处理，于60×60×30cm箱笼中，笼子带325目的筛网以允许空气的流通。在4、8和24小时，计数并记录处理和未处理的(A和B行)植物上的蚜虫数量。
实施例4银叶粉虱(红叶螨)此试验的目的是评估肉桂醛对银叶粉虱的驱避性。在温室内，让棉花在7.5mm直径盆的培养土中生长。当植物达到三叶期时，随机选择八株植物。在分别的试验中，将四株植物作如下处理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐温80)；NaHCO3；吐温80；和空白配方。处理将是叶面施用，用手动喷雾器(Gilmour)喷施5毫升的物质成细雾状。另四株植物则不处理，一株只用水喷雾。处理过和末处理的植物分别摆放成两行，A或B，处理或未处理，于60×60×30cm箱笼中，笼子带325目的筛网以允许空气的流通。在4、8和24小时，计数并记录处理和未处理的(A和B行)植物上存在的银叶粉虱数量。在48小时，计数并记录每一行植物上的卵数。
实施例5叶蝉类(大叶蝉科)此试验的目的是评估肉桂醛对叶蝉的驱避性。在温室内，让棉花在7.5mm直径盆的培养土中生长。当植物达到三叶期时，随机选择八株植物。在分别的试验中，将四株植物作如下处理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐温80)；NaHCO3；吐温80；和空白配方。处理是叶面施用，用手动喷雾器(Gilmour)喷施5毫升的物质成细雾状。另四株植物则不处理，一株只用水喷雾。处理过和末处理的植物分别摆放成两行，A或B，处理或未处理，于60×60×30cm箱笼中，笼子带325目的筛网以允许空气的流通。在4、8和24小时，计数并记录处理和未处理的(A和B行)植物上存在的叶蝉数量。在48小时，计数并记录每一行植物上的卵数。
实施例6蓟马(缨翅目)此试验的目的是评估肉桂醛对蓟马的驱避性。在温室内，让棉花在7.5mm直径盆的培养土中生长。当植物达到三叶期时，随机选择八株植物。在分别的试验中，将四株植物作如下处理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐温80)；NaHCO3；吐温80；和空白配方。处理是叶面施用，用手动喷雾器(Gilmour)喷施5毫升的物质成细雾状。另四株植物则不处理，一株只用水喷雾。处理过和末处理的植物分别摆放成两行，A或B，处理或未处理，于60×60×30cm箱笼中，笼子带325目的筛网以允许空气的流通。在4、8和24小时，计数并记录处理和未处理的(A和B行)植物上存在的蓟马数量。在48小时，计数并记录每一行植物(叶隙处)上的卵数。
实施例7两点叶螨(红叶螨)
此试验的目的是评估肉桂醛对叶蝉的驱避性。在温室内，让棉花在7.5mm直径盆的培养土中生长。当植物达到三叶期时，随机选择八株植物。在分别的试验中，将四株植物作如下处理50ppm的肉桂醛；50ppm的肉桂醛配方(NaHCO3+吐温80)；NaHCO3；吐温80；和空白配方。处理是叶面施用，用手动喷雾器(Gilmour)喷施5毫升的物质成细雾状。另四株植物则不处理，一株只用水喷雾。处理过和末处理的植物分别摆放成两行，A或B，处理或未处理，于60×60×30cm箱笼中，笼子带325目的筛网以允许空气的流通。在4、8和24小时，计数并记录处理和未处理的(A和B行)植物上存在的两点叶螨数量。在48小时，计数并记录每一行植物(叶隙处)上的卵数。
实施例8蚊子(埃及伊蚊)体外驱避性试验方法此试验的目的是评估肉桂醛对蚊子的驱避性。将二十只大致四日龄的未吸血雌蚊引入试验箱内。四毫升的试验制剂吸取放于16cm Whatman2号圆型滤纸上并于空气中干燥。试验用的试纸放置于通风入口箱中。使CO2经由水从气味测量箱风道的通风入口末端处由在出入口冒泡而入；并使用最低转速的风扇装置。捕集箱打开5分钟，之后关闭并计算及记录蚊子的数目。23％的避蚊胺被使用来当作阳性对照组。驱避性试验方法，田野试验此实验的目的是生物分析肉桂醛作为蚊子驱避剂的活性。自筛网材料的1mm尼龙蚊子笼门栓剪下两个直径18cm和两个直径16cm的环。处理环(16cm)浸于1毫升制剂内肉桂醛(2％)于2％吐温80和6％NaHCO3中，之后使之于空气中干燥2小时。十只来自KearneyAgricultural Center的蚊子控制研究实验室的未喂食雌蚊(埃及伊蚊)(5至7日龄)被引入两个Kearney(Fischer)一品脱蚊子纸盒内(对照和处理纸盒)。每一纸盒均用未处理的18cm环形筛网盖住并用镶边封住此品脱纸盒，盖子部分已除去。将处理的16cm环放于成年男性志愿者的一只脚上(事先以香皂和水清洗过)，将未处理的16cm环放于其另一只脚上。一品脱蚊子纸盒齐平放置，使有筛网的一边与脚的纱布接触5分钟。蚊子并没有直接与化合物接触。5分钟后，计数10只中的吸血/饱食蚊子数目，结果显示于表1，如下。总共评估三十只昆虫，只有两只末被肉桂醛制剂所驱除，而对照(未处理)组中为19只。
表1蚊子驱避性ProGuard方案 Kearney蚊虫研究实验室(10只蚊子中吸血/饱食的蚊子数)试验1试验2试验3总数肉桂醛制剂10/10 2/10 0/10 2/30对照(末处理) 5/10 7/10 7/10 19/301肉桂醛(2％)、2％吐温80和6％NaHCO3的水溶液与上面描述相似的方案用于测试α-己基肉桂醛。
实施例9鳞翅目产卵驱避性此实验的目的是决定肉桂醛对甜菜夜蛾成虫的驱除力。建一套装置，该装置进口迫使气流流过飞行笼中处理或未处理的盆栽植物。五株蕃茄植株在三叶期用5毫升不同浓度的化学配方和组分处理；之后放于此笼中。另五株蕃茄则以5毫升的水喷雾作对照，之后也放于笼中。在笼中释放40只待产卵的甜菜夜蛾(Spodoptera exigna)成虫。打开此装置上的排气扇，并且将低速直线气流流经作为化学制剂气体蒸发器的笼子。24小时后，在处理植物、未处理植物以及笼子壁上评估产卵蛋情形。
实施例10根瘤蚜-驱避性的蒸气试验此试验的目的是评估肉桂醛对根瘤蚜的蒸气驱避性。将带有能活的根瘤蚜卵(n-30)的葡萄根状茎的根块放置于50×9mm的盘中，其内表面是经过400毫升已知产物浓缩物处理。化学物质不直接放在根上，所以根部的吸收或代谢将不是影响因子。将此盘关上并用胶带封住。经过7天后，将这些盘打开，确定昆虫是否能孵化并于根部立足和发育，或是否有新孵化的根瘤蚜逃离根部和死亡。
实施例11在转基因植物体过量表达类黄酮醛类制备20微克的聚腺苷酸化RNA，并合成cDNA。将这部分克隆入λ-ZAP II载体内(一商业上可得到的克隆载体)。用寡核苷酸探针至少筛选500,000个重组体，所述的寡核苷酸探针是由如下两种序列设计的得自GeneBank的克隆CA4H和CAD基因的保守序列；及由想要的宿主植物纯化得到的蛋白质肽序列。选出强的杂交株，并用来研究此cDNA文库。对所得的克隆分析其序列，以确保将适当的基因序列以反义或有义的方向引入植物表达盒内。按照已公开的方法，将此反义和有义的构建体通过直接转化引入根癌土壤杆菌LBA4404内。烟草(品种Samsun)叶盘用已非常完善的公开方法进行转化(Horsch等人(1985)Science 2271229-1231)。含有CA4H或CAD构建体的植物用聚合酶链式反应(PCR)确认，并选出用于进一步的分析。
采用已已非常完善的公开分析方法，用来自转化的或未转化之对照植物的植物材料确定CA4H和CAD酶活性。选出CA4H和CAD的活性减少至低于对照植物所见的活性的20％的植物，用于进一步的分析。具有低的CA4H活性的植物与具有低的CAD活性的植物杂交，并通过PCR筛选遗传两种基因构建体的子代。采用标准的分开方法，分析带有抑制的CA4H和抑制的CAD活性之植物的类黄酮醛类的产量。之后，采用任一适宜的实施例，测试产生类黄酮醛类的植物对昆虫或其它害虫的驱避效力，例如用实施例3的方法，测验转基因棉花驱避蚜虫的能力。
实施例12在微生物体系中生产类黄酮醛类用萃取自六周龄的烟草茎之RNA产生一cDNA文库。制备20微克的聚腺苷酸化RNA，并合成cDNA。将这部分克隆入λ-ZAP II载体内(一商业上可得到的克隆载体)。用寡核苷酸探针至少筛选500,000个重组体，所述的寡核苷酸探针是由如下序列设计的采用Goffner等人的方案Plant Physiol.(1994)106625，由六周龄的烟草茎组织纯化出的CCoAr蛋白质肽序列。选出强的杂交株，并用来研究此cDNA文库。将得到的克隆分析其序列，确保对全长的cDNA插入体的鉴定，和将适当的CCoAR基因序列引入酵母表达载体pNTL8110(Faulkner等人(1994)Gene 14313-20)内。类酵母红冬孢(Rhodpsporidiumtoruloides)苯丙氨酸氨裂解酶的编码序列(PAL；GeneBank RHDPAL区)和欧芹4-香豆酸CoAl连接酶的编码序列(4CL；GeneBankPC4CL1AA区)均相似地引入等同的酵母菌表达载体。通过已已非常完善的公开方法(Becker，和Guarente(1991)Methods inEnzymology 194182-187；Simon，(1993)Method in Enzymol.217478-483)，用电穿孔法采用此PAL、4CL和CCoAR构建体转化啤酒糖酵母菌。转化体用缺乏亮氨酸的最小限度培养基来筛选。带有所有三种基因构建体的转化菌株用PCR确认，并选出用于进一步的分析。
采用已已非常完善的公开测定法，用来自转化或未转化对照菌株的萃取物确定PAL、4CL和CCoAR的酶活性。选出PAL、4CL和CCoAR的活性明显高于在对照菌株中所检测到背景活性的菌株，用于进一步的分析。用标准的公开方法，分析选出的菌株，选出生产显著量的肉桂醛的那些菌株，用于最佳化发酵条件。之后，用所描述的任一种方法，测试所得植物在驱避昆虫上的效力。
实施例13HCA作为昆虫驱避剂的活性此实验的目的是确定α-己基肉桂醛是否是一种有效的昆虫驱避剂。在FDA进行兔子的阴性皮肤刺激试验之后，在2至4位男性受试者的皮肤上进行评价。将1ml HCA擦涂在一只前臂上。带上手套保护未处理的手，而与之同时，将处理的手臂以大约30分钟的时间间隔暴露于装有大量(2,000-4,000只)未吸食的蚊子的笼子三分钟，直到有两处叮咬(在一个试验期中有两处叮咬或在二个连续的试验期中各有一处叮咬)。施用的时间间隔和有两处叮咬时被称作“保护时间”。对埃及伊蚊，HCA被定为3级(121-180分钟持续时间)。对四斑按蚊(Anopheles quadrimaculatus Say)，HCA被定为2级(31-60分钟)。
也在处理的衣服上作了HCA对埃及伊蚊效果的评价。在这些试验中，采用了女性的丝光棉长统袜。踝上的测定部分用HCA浸泡，其量相当于每2英尺3.3g。将此长统袜展开在架上，然后成排挂于室内。第一个试验在处理后24小时进行。将长统袜穿在手臂上，处理部分在前臂的中间。未处理的手用手套保护，并将穿长统袜和手臂暴露于试验笼一分钟。如果得到5处叮咬，处理则被认为是无效的。如果少于5处叮咬，则将暴露每日连续进行，直到第14天，之后以每周或每两周的间隔进行。HCA在此试验中被定为4级(有效期大于10天)，与避蚊胺的值相同。
这些试验证实本发明的肉桂醛和α-己基肉桂醛制剂对蚊子是有效的驱避剂。
在本说明书中提到的所有文献和申请专利指示与本发明有关的领域中技术人员的技术水平。所有的文献和申请专利均并入本文作为参考，这种并入等同于指明各单独的文件或申请专利具体和个别地并入作为参考。
本发明现已完全叙述完，对于本领域中普通技术人员而言，在不偏离本发明所附之权利要求书申请专利范围的精神和范围下能做许多改变和修正。
权利要求书按照条约第19条的修改1.一种驱避害虫的组合物，所述的驱避组合物包含为足以提供驱避害虫香味之浓度的至少一种类黄酮醛。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的类黄酮醛是肉桂醛、α-己基肉桂醛和/或松柏醛。
4.根据权利要求1-3之任一的组合物，其中所述的组合物还包含皂草苷。
5.一种从哺乳动物身体附近驱避害虫如昆虫的方法，所述的方法包含以不引起皮肤刺激的量局部施用根据权利要求1-4之任一的组合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的组合物形式选自由喷雾剂、粘着剂、驱避油剂和膏剂。
7.一种根据权利要求5或权利要求6的方法，其中所述的哺乳动物选自人、牛和羊。
8.一种根据权利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳动物是人且所述的害虫是蚤或蚊子。
9.一种根据权利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳动物是牛且所述的害虫是软蜱。
10.一种从植物附近驱避害虫的方法，所说的方法包含施用根据权利要求1-4之任一的组合物，其中所述的植物选自葡萄、玫瑰、苹果和玉米。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的植物是葡萄且所述的害虫是蓟马、线虫、根瘤蚜和卷叶螟。
12.一种根据权利要求10的方法，其中所述的植物是玫瑰且所述的害虫是蓟马或瓜蚜。
13.一种根据权利要求10的方法，其中所述的植物是苹果树且所述的害虫是苹蠹蛾。
14.一种根据权利要求10的方法，其中所述的植物是玉米且所述的害虫是根蚜。
15.一种防止昆虫侵入一区域的方法，所述的方法是根据权利要求1-2、4和18-20之一的组合物施用于所述的侵入附近。
16.根据权利要求15的方法，其中所述的昆虫是蟑螂。
17.一种防止树受害虫侵害的方法，所述的方法包括将所述的树干与根据权利要求1-2、4和18-21之任一的组合物接触。
18.一种驱避害虫的组合物，所述的组合物包含皂草苷和为足以提供驱避害虫香味之浓度的至少一种类黄酮醛。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述的类黄酮醛选自肉桂醛、α-己基肉桂醛和松柏醛。
20.一种驱避害虫的组合物，所述的驱避组合物包含足以提供驱避害虫香味之浓度的α-己基肉桂醛和松柏醛的至少一种。
21.一种防止树木被害虫侵害的方法，所述的方法包含将所述的树干与一组组合物接触，该组合物包含为足以提供避害虫之浓度的至少一种黄酮醛。
权利要求
1.一种驱避害虫的组合物，所述的驱避组合物包含为足以提供驱避害虫香味之浓度的至少一种类黄酮醛。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的类黄酮醛是肉桂醛、α-己基肉桂醛和/或松柏醛。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述的浓度对总的组合物而言是10-5000ppm。
4.根据权利要求1-3之任一的组合物，其中所述的组合物还包含皂草苷。
5.一种从哺乳动物身体附近驱避害虫如昆虫的方法，所述的方法包含以不引起皮肤刺激的量局部施用根据权利要求1-4之任一的组合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的组合物形式选自由喷雾剂、粘着剂、驱避油剂和膏剂。
7.一种根据权利要求5或权利要求6的方法，其中所述的哺乳动物选自人、牛和羊。
8.一种根据权利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳动物是人且所述的害虫是蚤或蚊子。
9.一种根据权利要求5-7之任一的方法，其中所述的哺乳动物是牛且所述的害虫是软蜱。
10.一种从植物附近驱避害虫的方法，所说的方法包含施用根据权利要求1-4之任一的组合物，其中所述的植物选自葡萄、玫瑰、苹果和玉米。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的植物是玫瑰且所述的害虫是蓟马、线虫、根瘤蚜和卷叶螟。
12.一种根据权利要求10的方法，其中所述的植物是玫瑰且所述的害虫是瓜蚜。
13.一种根据权利要求10的方法，其中所述的植物是苹果树且所述的害虫是苹蠹蛾。
14.一种根据权利要求10的方法，其中所述的植物是玉米且所述的害虫是根蚜。
15.一种防止昆虫侵入一区域的方法，所述的方法是将根据权利要求1-4之一的组合物施用于所述的侵入附近。
16.权利要求15的方法，其中所说的昆虫是蟑螂。
17.一种防止林木被害虫侵害的方法，所说方法包括将所述树的树干与根据权利要求1-4任一的组合物接触。
全文摘要
本发明提供含有肉桂醛、α－已基肉桂醛和/松柏醛的驱避组合物及其作为害虫驱避剂应用的方法,害虫包括蝇、蟑螂、蚜虫、银叶粉虱、蚊、蜱、蚤、叶蝉、蓟马、二点叶螨、蜗牛、蛞蝓、叮咬蠓、蠼螋和蛾。
文档编号A01N35/02GK1179699SQ95195443
公开日1998年4月22日 申请日期1995年12月29日 优先权日1995年12月29日
发明者洛夫·W·爱默生, 小布来德福特·G·克兰德尔 申请人:普罗嘉德公司