一种牛皮杜鹃叶片再生体系的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种牛皮杜鹃叶片再生体系的建立方法。
【背景技术】
[0002]杜鹃花是集观赏与药用为一体的中国十大传统名贵花丼之一，也是全球三大名花之一。我国是世界杜鹃花属植物分布的中心和发源地，约有野生杜鹃
花近600种，约占世界1000余种的60%左右。杜鹃花色艳丽、株型优美、花期早，是园林绿化的优质材料。随着人们开发力度的加大，植物种群的数量急剧下降。因此应该釆取一些必要的保护措施和方法，以维护野生种质资源的数量。
[0003]牛皮杜醒(TPAoi/oofeflt/ro/? chrysanthum Pall.)为杜醒花科杜醒花属常绿低矮小灌木，为国家三级保护濒危植物。春季山上积雪还未完全融化，牛皮杜鹃即开始综放，淡黄色的花冠，在绿叶的衬托下格外美观，为初春的风光增添一道靓丽的风景线。牛皮杜鹃在医药产业上也具有极大的开发潜力，其叶片含有丰富的药用成分，具有消炎止痛、抑制病菌发生、降血压、提高心脏功能、延缓衰老、抗癌抗病毒等功效，也可用于治疗心脑血管等疾病。牛皮杜鹃的野生资源极其有限，近年来，人们任意的采摘和盲目的挖掘，使其数量遭到了严重的破坏。杜鹃主要采用播种、扦插、嫁接等方式进行繁殖，但繁殖系数低，生长周期长，同时易受外界环境条件等因素的影响。而釆用组织培养的方法，繁殖系数高，可以在任意生长阶段进行选材扩繁，对杜鹃优良品种的选育和工厂化育苗提供了便利的条件。本发明以牛皮杜鹃叶片为外植体，经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了牛皮杜鹃叶片离体再生植株，建立了牛皮杜鹃叶片再生体系，为今后工厂化育苗及驯化栽培奠定坚实的基础。
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【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供出一种牛皮杜鹃叶片再生体系的建立方法，本发明以牛皮杜鹃叶片为外植体，经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了牛皮杜鹃叶片离体再生植株，建立了牛皮杜鹃叶片再生体系，从而实现了本发明的目的。
[0006]本发明的一种牛皮杜鹃叶片再生体系的建立方法，包括以下的步骤:
(O外植体消毒:采集牛皮杜鹃健康植株细嫩叶片，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗I?3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5?15s后用无菌水洗3?5次，再用0.1%升汞溶液消毒3?8min，用无菌水冲洗4?6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用O
[0007](2)分化培养:将经步骤(I)处理后的叶片叶柄切除，用无菌解剖刀在叶片上轻划几刀，以叶背面与培养基接触的方式接种于分化培养基中进行愈伤组织及丛生芽诱导。接种后先在25?28°C条件下全暗培养15?30天，然后置于每天光照10?16小时，光照强度为2000?40001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养25天后统计愈伤组织诱导率、40天后统计分化率。
[0008](3)增殖培养:将步骤(2)诱导分化产生的带有丛生芽的愈伤组织分割成0.5cm左右的小块并接种到继代培养培养基进行增殖培养。接种后先在25?28°C条件下全暗培养5?7天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养50天后以不定芽长度多1.0cm为有效芽统计增殖倍数。
[0009](4)生根培养:选取步骤(3)生长状态一致的组培苗，剪成2?3cm长的茎段并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养40天后观察苗的生长状况并统计生根率。
[0010](5)炼苗移栽:选取经生根培养后，根系发达且植株生长健壮的组培苗进行炼苗移栽，首先洗去组培苗基部附着的琼脂，之后将其移栽到事先浇透的河沙基质中，之后向小苗进行喷雾，搭建简易塑料拱棚，保证棚内空气相对湿度达100%，覆盖塑料薄膜，以保证炼苗期间棚内的湿度，之后逐渐掀膜通风透光并注意棚内的湿度，沙培15?25天后，将其移栽至由草炭土:腐殖土:珍珠岩=2:1:1组成的混合基质中，栽植后绕浇透水，日常养护时注意保证盆土湿润忌积水，并时常向叶片喷水，移栽20天后统计移栽成活率。
[0011]上述步骤(2)所述的分化培养基为:MS+0.5?2.0mg/L TDZ+0.1?1.0mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(3)所述的继代培养基为:MS+0.1?1.0mg/L TDZ+0.1?0.5mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]上述于步骤(4)所述的生根培养基为:1/2MS+1.0?3.0mg/L IBA+1.0?2.0mg/LABTi+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0014]与现有技术相比本发明的优点是:牛皮杜|$ (/PAot/oofe/?t/rο/? chrysanthum Pall.)为杜鹃花科杜鹃花属常绿低矮小灌木，为国家三级保护濒危植物。杜鹃采用常规的方法如播种、扦插、嫁接等方式进行繁殖，但繁殖系数低，生长周期长，同时易受外界环境条件等因素的影响。而釆用组织培养的方法，繁殖系数高，可以在任意生长阶段进行选材扩繁，对杜鹃优良品种的选育和工厂化育苗提供了便利的条件。本发明以牛皮杜鹃叶片为外植体，经过分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽等步骤获得了牛皮杜鹃叶片离体再生植株，建立了牛皮杜鹃叶片再生体系，为今后工厂化育苗及驯化栽培奠定坚实的基础，从而解决牛皮杜鹃引种驯化难度高的问题。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0016]实施例1
(O外植体消毒:采集牛皮杜鹃健康植株细嫩叶片，用软毛刷蘸洗衣粉水轻轻刷洗，自来水冲洗2h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒8s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，用无菌水冲洗5次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0017](2)分化培养:将经步骤(I)处理后的叶片叶柄切除，用无菌解剖刀在叶片上轻划几刀，以叶背面与培养基接触的方式接种于分化培养基中进行愈伤组织及丛生芽诱导。接种后先在25°C条件下全暗培养20天，然后置于每天光照14小时，光照强度为30001χ，置于培养温度为25°C的条件下培养25天后统计愈伤组织诱导率为96.97%,40天后统计分化率为 97.83%。所述的分化培养基为:MS+1.5mg/L TDZ+0.3mg/L IBA+25g/L 蔗糖+4.7g/L 琼月旨，pH为5.8。
[0018](3)增殖培养:将步骤(2)诱导分化产生的带有丛生芽的愈伤组织分割成0.5cm左右的小块并接种到继代培养培养基进行增殖培养。接种后先在25°C条件下全暗培养5天，然后置于每天光照14小时，光照强度为30001x，培养温度为25°C的条件下培养50天后以不定芽长度多1.0cm为有效芽统计增殖倍数为35.81。所述的继代培养基为:MS+0.5mg/LTDZ+0.lmg/L IBA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
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