血管发生的快速体内模型的制作方法
【专利说明】血管发生的快速体内模型
[0001] 本申请是基于申请日为2007年9月27日，优先权日为2006年9月27日，申请号 为200780036277. 8 (PCT/US2007/079753)，发明名称为："血管发生的快速体内模型"的专 利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请依据35U.S.C. § 119(e)要求2006年9月27日提交的美国申请流水号 60/848, 001和2006年10月12日提交的美国申请流水号60/851，601的优先权，并通过提 述并入上述两个申请的内容。
[0004] 在联邦政府资助的研究下做出的发明的权利声明
[0005] 此项工作得到了来自（美国）国立卫生院（NationalInstitutesofHealth)、 美国癌症学会（AmericanCancerSociety)、和（美国）国立癌症协会（NationalCancer Institute)的拨款的支持。美国政府对本发明具有某些权利。 发明领域
[0006] 本发明涉及用于研究生理现象及测定为调控生理现象而设计的药物和方案 的有效性的模型系统。具体而言，本发明关注一种动物模型，它可用来评估血管发生 (angiogenesis)及评估各种药物对其发展的影响。
[0007] 发明背景
[0008] 血管发生、血流、血管内肿瘤细胞运输、和外渗（extravasation)是肿瘤生长、进 展和转移中的关键步骤，因此全世界的药物发现研究项目也以它们为靶标。抗血管发生 性物质的发现和评估以前依赖于体内方法，诸如绒毛膜尿囊膜测定法、猴虹膜新血管形成 (neovascularization)模型、盘式（disc)血管发生测定法、和各种使用角膜来评估血管生 长的模型。这些模型在了解血管生长及其抑制的机制中发挥了重要作用。
[0009] 在我们的实验室中开发了一种新的用于将人肿瘤血管发生成像的转基因裸鼠。干 细胞标志物巢蛋白（nestin)在新生血管中表达，而在此转基因小鼠中，巢蛋白的一种调节 元件驱动绿色荧光蛋白（NDGFP)，使得新生血管能够通过它们的GFP表达来可视化。许多 表达红色荧光蛋白（RFP)的人和啮齿动物癌细胞系被植入ND-GFP裸鼠（nudemouce)中 并广泛生长。ND-GFP在正在增殖的内皮细胞中高度表达。通过双色荧光成像来可视化正 在生长的肿瘤中的新生血管。Amoh，Y.等，CancerRes. (2005)65:5352-5357。多柔比星 (doxorubicin)已被证明可抑制移植有B16F10-RFP鼠黑素瘤的ND-GFP小鼠中的新生肿瘤 血管发生及肿瘤生长。Amoh，Y.等，（见上文）2337-2343。
[0010] 另外，通过双色成像可视化了正位移植有表达RFP的MIAPaCa-2人胰腺癌的 ND-GFP转基因裸鼠中的初级（primary)肿瘤血管发生。吉西他滨（Gemcitabine)显著 降低了肿瘤中的平均新生血管密度且降低了肿瘤体积。这些结果首次证明了吉西他滨在 胰腺癌中不但是肿瘤生长的抑制剂，还是血管发生的抑制剂。Amoh,Y.等，J.Surg.Res. (2006) 132:164-169。在进一步的工作中，通过双色荧光成像可视化了ND-GFP转基因裸鼠 中XPA-1-RFP人胰腺癌的肝转移的血管发生。ND-GFP在正在增殖的内皮细胞和正在生长的 肝转移的新生血管中高度表达。通过ND-GFP表达容易地定量了肝转移中的新生血管密度。 吉西他滨显著降低了肝转移中的平均新生血管密度。Amoh，Y.等，AnticancerRes.(印刷 中）。
[0011] 2005年5月12日公布的PCT公开文本W0 2005/042715 (通过提述并入本申请） 也记载了关于可用于观察新血管形成的转基因动物的说明，其中荧光蛋白在巢蛋白衍生的 控制序列的控制下表达。
[0012] 发明公开
[0013] 本发明提供了上文所述血管发生检测系统的改进。在这种方法中，可以不依赖于 肿瘤移植来测量血管发生，这通过在转基因动物中皮下植入的药物投递基质中提供激励新 血管形成的适宜生长因子来实现，所述转基因动物在源自巢蛋白的控制序列的控制下生成 荧光蛋白。然后可以通过荧光显微术直接观察所述生长基质植入物中新血管的存在。可以 在同一动物中植入缺乏生长因子的对照基质，并且也可以观察各种药物和方案对新血管形 成的影响。
[0014] 本发明与血管发生的肿瘤模型相比是有优势的，因为宿主动物不必是免疫缺损的 (immunocompromised)。由于不需要导入异种生物材料（除了焚光蛋白本身），可以使用有 免疫活性的（immunocompetent)的受试者。通过适当选择基质，可以采用不引发免疫应答 的基质。
[0015] 如此，一方面，本发明涉及用于观察转基因动物中的新血管形成的方法，该方法包 括：
[0016] 通过焚光显微术直接观察所述动物中由植入皮下层（subcutis)中的生长基质中 荧光标记的细胞所形成的荧光标记的新生血管的存在、不存在或量；
[0017] 其中所述荧光是由所述细胞中表达的荧光蛋白生成的。
[0018] 在一个实施方案中，所述荧光蛋白的表达受到巢蛋白控制元件的控制。新血管形 成的量可以通过测量新生血管的长度来定量。典型地，采用包含生长因子的生长基质，以及 植入同一动物中用于比较的对照药物投递基质。
[0019] 另一方面，本发明涉及血管发生的转基因动物模型，该动物模型经修饰而在新生 血管形成细胞中表达荧光蛋白，且其中所述动物模型进一步包含植入皮下层中一个或多个 基质，其中至少一个基质包含至少一种激励血管发生的生长因子。在一个实施方案中，所述 荧光蛋白的表达处于源自巢蛋白的控制元件的控制之下。
[0020] 另一方面，本发明涉及鉴定调控血管发生的药物或方案的方法，其中该方法包括 将所述药物或方案施用于上文所述动物模型，观察当存在所述药物或方案时，与该药物或 方案不存在时相比，所述药物或方案对血管发生的存在、不存在或量的影响，由此鉴定调控 血管发生的药物或方案。
[0021] 附图简述
[0022]图1示意性显示了整个过程的一个例子。如该图第一部分所示，将Gelfoamft移植到小鼠的体侧皮下层中，其中该小鼠已过修饰而包含处于巢蛋白第二内含子增强子控 制下的绿色荧光蛋白核苷酸序列（ND-GFP转基因小鼠）。该移植后7天，创建皮瓣（skin flap)，该皮瓣含有已与先前存在的血管汇合（merge)的Gelfoam?,通过荧光显微术直接 测量皮瓣中的
[0023]图2显示了在各种条件下观察到的血管发生的比较。图2a显示了当Ge丨foam?含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)时，植入的Gelfoarn?中的血管发生。图2b显示了 不含bFGF的对照(Mfcam⑩中血管发生的缺失。图2c显示了多柔比星对含有bFGF的 Gelfoam?中的血管发生的影响。图2d是另一种对照，其显示了不含bFGF且用多柔比星 处理的对照中血管发生的缺失。
[0024]图3显示了冷冻的、血管化的Gelfoam?的组织化学切片中的荧光与内皮细胞标 志物⑶31的相关性。图3a显示了通过荧光测定的血管分布，而图3b显示了⑶31的分布。 [0025]图4显示了给小鼠植入含有各种成分的Gelfoam?:后7天平均新生血管长度（单 位为mm/mm2)的比较（对小鼠施用或不施用多柔比星）。
[0026] 本发明的最佳实施方式
[0027] 本发明为测量任何药物或方案对新血管系统（neovasculature)形成的影响提供 了便利且高效的模型。本文所述模型不依赖于与肿瘤形成和生长并发的血管发生，本文所 述模型单纯地（cleanly)在人工基质中诱导血管发生，如此可以测定药物或方案对血管发 生的特异性影响，并可以鉴定成功的方案和药物。所述模型可以是、但并非必须是免疫缺损 的。它是这样的转基因动物，在负责新生血管形成的内皮细胞中生成荧光蛋白。在这些细 胞中的表达是通过将编码荧光蛋白的核苷酸序列置于组织选择性启动子或其它组织选择 性控制序列的控制下来实现的。在本发明中特别有用的是源自巢蛋白的控制序列，但是也 可以使用内皮或其它血管形成细胞的其它控制序列。然后转基因动物会在适宜的血管形成 细胞中选择性生成荧光蛋白。然而，特异性不必是完全的，因为新生血管会生长成不提供背 景"噪音"的中性基质。
[0028] 所述动物模型是对此目的有用的任何物种，典型的是哺乳动物，诸如啮齿动物诸 如大鼠或小鼠、家兔、灵长动物、或其它合适的受试者。
[0029] 新血管系统将在激励下侵入合成基质，诸如Gel&am參（Upj〇hn)。本文 中列举Gelfoam?为例来进行说明，但是也可以使用其它基质，诸如Matrigel?(BD Biosciences)。基质仅须足够多孔以支持新血管形成，而且有足够保持力（retentive)，以 能够在皮下层中局部地供应生长因子。各种基质在本发明中是有用的。所述基质既充当新 血管系统的支架，又充当已知激励血管发生的生长因子的来源。典型地