一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法
一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法。
【背景技术】
[0002]芝麻(Sesamum indicumL，2η = 26)属胡麻科胡麻属，是我国重要的优质油料作物和优势出口农产品。然而，由于栽培物种在长期进化和人工选择中，原本存在于野生物种的许多优良基因被淘汰，导致杂交亲本间遗传基础越来越狭窄，遗传的多样性越来越贫乏。现有芝麻栽培品种抗病耐渍性较差，易受环境条件的影响，产量的稳定性不佳，特别是遇到多雨年份，芝麻涝害严重、枯萎病和茎点枯病的发生，致使大面积枯死，产量和品质大幅度降低，严重影响芝麻生产的发展。
[0003]芝麻属中的有些野生种具有高抗病抗逆耐渍等特性，将野生种极为丰富的遗传多样性和宝贵的抗病虫、抗逆境的基因导入栽培种可以增加栽培种资源的遗传多样性，对创制优良新种质和培育新品种具有重要意义，是解决芝麻产量低而不稳的一条有效途径。
[0004]近二十年来，国内外学者先后就芝麻属远缘杂交技术开展了大量研究，但是采用常规的杂交方法，芝麻野生种与栽培种种间杂交并不能获得种间杂交F1后代。如TarihalRamesh等用‘野芝I号’ (S.radiatum)做母本与栽培品种正反交结果得到的种子没有发芽；刘红艳等用‘刚果野芝麻’和‘野芝I号’进行正反种间杂交，未能得到F1植株。
[0005]幼胚(珠)离体培养技术是通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需的营养物质，促使幼胚发育成植株，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，为创造遗传新种质提供一条重要途径。目前，采用常规方法进行亲缘关系较远的芝麻种属间杂交不易成功，芝麻在进行远缘杂交时普遍存在杂交不结实，结蒴率低和结籽率低，杂种胚不发育等现象。因此，利用幼胚挽救离体培养技术，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，进行芝麻栽培品种的种质改良，是提高芝麻品种抗性特征的重要技术途径。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，解决了野生种芝麻(s.radiatum, 2n = 64)与栽培品种芝麻(2n = 26)进行远缘杂交时存在的杂交不结实，杂种胚败育，无法获得杂种F1植株等问题。
[0007]为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为:
[0008]—种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，包括如下步骤:
[0009](I)亲本材料准备:母本选用芝麻栽培品种(2n = 26)，父本选用芝麻野生种(S.radiatum, 2n = 64)，精选无病饱满的父母本籽粒以备种植；
[0010](2)远缘杂交:当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊；用父本杂交授粉；
[0011](3)胚珠的剥取:取步骤⑵杂交授粉后生长发育了 10?18天的幼蒴，用清水将幼蒴表面冲洗干净，然后在无菌条件下对幼蒴表面进行消毒并用无菌水漂洗，最后切开幼蒴，轻轻剥出胚珠；
[0012](4)幼胚挽救离体诱导培养:在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d和光照强度1500?20001ux条件下离体诱导培养，使胚珠萌发得到幼胚；
[0013](5)幼胚的分化培养:将步骤⑷得到的幼胚接种到分化培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d和光照强度1500?20001ux条件下分化培养直至幼胚发育成杂种F1幼苗；
[0014](6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存:在无菌条件下，从培养基中取出杂种F #力苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种匕植株后放在人工气候培养箱中保存；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整的杂种F1植株并保存。
[0015]上述方案中，步骤(3)所述取杂交授粉后生长发育了 12d?18d的幼蒴。
[0016]上述方案中，所述MS诱导培养基为:在MS基本培养基中添加0.3?0.5mg/L赤霉素、0.5?lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0017]上述方案中，所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.3?0.6mg/L IBAWI哚丁酸)、0.5?0.8mg/L AgN03、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0018]上述方案中，步骤(4)所述离体诱导培养的培养时间为25?30d ;步骤(5)所述分化培养的培养时间为25?30d。
[0019]上述方案中，所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.2?0.5mg/L NAA (萘乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0020]上述方案中，所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加1.5?3mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、I?2mg/L IAA (吲哚乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0021]上述方案中，所述幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养至形成完整的杂种F1植株的时间为20d?30d。
[0022]上述方案中，所述幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中扩繁直至诱导分化出顶芽的时间为14d?20d。
[0023]上述方案中，所述杂种株的移栽种植方法为:将步骤(6)得到的杂种F i植株在室内自然光下开瓶炼苗2?3d，取出杂种F1植株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到按质量比计泥炭:珍珠岩:蛭石=1:1:1的穴盘中，置于27?30°C温度、保持60?70%相对湿度条件下培养30d后带土移栽，即下地种植。
[0024]本发明还结合了分子鉴定法和细胞学鉴定法对芝麻野生种和栽培种远缘杂交获得的杂种匕植株的真实性进行判断，具体的鉴定方法为:
[0025](I)分子鉴定:分别提取父本野生种(S.radiatum, 2n = 64)、母本栽培品种(2n = 26)及杂种？4直株的基因组DNA，将其分别作为模板，用SSR引物HS073 (GenBank, JP643611):正向引物序列:5’ -CCGAAGGGATAGATCGACAT-3’、反向引物序列:5’-ATCTTCCCTCCCTTTTCTGC-3’进行PCR反应，然后将PCR反应产物进行凝胶电泳分析；在凝胶成像仪上照相观察；根据在杂种F1植株的凝胶电泳带型上有无亲本的特异扩增条带，在早期鉴定杂种F1植株是否为真杂种:若杂种F ^直株的电泳带型上有母本栽培种的特异性扩增条带190bp、父本野生种的特异性扩增条带170bp，则可以判断该杂种匕植株为真杂种，若没有则为假杂种。
[0026](2)细胞学鉴定:取亲本及杂种F1植株的根尖，用0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理4h，然后用卡诺固定液固定，固定时频繁更换固定液直至材料褪色完全，放置冰箱中保存备用；制片时，取出固定好的根尖，用lmol/L的盐酸，60°C水浴处理4.5min进行水解，解离后放入蒸馏水中漂洗3次，用改良石炭酸品红染色Smin至子房呈紫红色，压片，选取有丝分裂中期相较好的细胞在Olympus显微镜下观察，统计其染色体的数目，进一步鉴定杂种F1真实性，真杂种的染色体数目应该为45条染色体。
[0027]芝麻种间远缘杂交对于引入芝麻野生种优良基因，拓宽芝麻栽培种的遗传基础，促进种间的基因交流，创造新的芝麻中间类型具有重大意义；但进行芝麻种间远缘杂交时，若父母本亲缘关系较远、遗传差异较大、亲本之间染色体数目严重不对等、染色体结构不协调等将导致种间的远缘杂交不容易获得成功，杂种胚容易在早期发生败育，难以获得杂交后代F1植株。本发明将染色体数目相差大的亲本，即芝麻野生种(S.radiatum, 2n = 64)与栽培种(2n = 26)进行种间远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服受精后发育障碍，杂种胚败育无法获得杂种F1植株等问题，同时芝麻野生种(Sesamum radiatum, 2n = 64)具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，有效的改良了芝麻栽培品种的种质。因此，本发明所述的利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种芝麻与栽培种远缘杂交后代的方法具有实际的应用价值。
[0028]本发明的有益效果:
[0029](I)本发明选用染色体数目相差较大的亲本，即母本选用芝麻栽培种(2n = 26)、父本选用芝麻野生种(S.radiatum, 2n = 64)进行种间远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服了亲缘关系较远的芝麻种间远缘杂交容易发生幼胚败育而无法获得杂种F1植株的问题，同时芝麻野生种(Sesamum radiatum, 2n = 64)具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，可以有效改良芝麻栽培品种的种质；
[0030](2)本发明通过选择合适的幼胚挽救接种时期和离体诱导培养条件，杂种幼胚经挽救离体诱导培养后可以被诱导萌发，然后经过继代、增殖培养萌发成杂种F1植株，本发明方法克服了芝麻种间杂交的不亲和性，利用挽救离体诱导培养获得杂种F1植株，并且还可以对杂种F1植株进行繁殖和长期保存，为转移和利用芝麻野生种的优良基因提供了便利条件；
[0031](3)本发明提供了一套完整的利用幼胚离体挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻的远缘杂交后代(杂种F1植株)的方法，同时还提供了杂种F1植株的繁殖、保存和鉴定方法，对丰富芝麻品种的遗传基础、优化育种技术将发挥重要的积极作用。
【附图说明】
[0032]图1为幼胚挽救离体诱导萌发获得幼胚的图片。
[0033]图2为幼胚萌发的分化培养图片。
[0034]图3为获得杂种F1植株的图片。
[0035]图4为亲本与杂种F1植株的SSR标记鉴定电泳图，其中1、2、3均代表杂种F:植株。
[0036]图5为亲本与杂种匕根尖染色体数目观察图:栽培品种(左)、杂种F1植株(中)与芝麻野生种(右)。
[0037]图6为栽培品种(左)、杂种F1植株(中)与芝麻野生种(右)株型的对比图。
【具体实施方式】
[0038]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0039]实施例1
[0040]一种利用幼胚挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻远缘杂交后代的方法，包括如下步骤:(I)亲本材料准备:母本选用从播种至开花期为40-50天的综合性状较好的栽培品种“中芝14”;父本选用野生种“野芝5号”(S.radiatum, 2n = 64)为材料，精选无病饱满的籽粒以备种植；
[0041](2)远缘杂交:当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊，挂牌；用父本授粉，记录杂交花数，授粉结蒴数；
[0042](3)胚珠的剥取:分别选择杂交授粉后12d?18d发育时期的幼蒴，用清水将其表面冲洗干净，在超净工作台下用75%酒精将幼蒴表面消毒30s，再用3%的次氯酸钠消毒8?10分钟，然后用无菌水漂洗幼蒴2?3次，每次5?8分钟；在灭菌纸上用刀切开幼蒴，轻轻剥出杂种胚珠；
[0043](4
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后代的方法。
【背景技术】
[0002]芝麻(Sesamum indicumL，2η = 26)属胡麻科胡麻属，是我国重要的优质油料作物和优势出口农产品。然而，由于栽培物种在长期进化和人工选择中，原本存在于野生物种的许多优良基因被淘汰，导致杂交亲本间遗传基础越来越狭窄，遗传的多样性越来越贫乏。现有芝麻栽培品种抗病耐渍性较差，易受环境条件的影响，产量的稳定性不佳，特别是遇到多雨年份，芝麻涝害严重、枯萎病和茎点枯病的发生，致使大面积枯死，产量和品质大幅度降低，严重影响芝麻生产的发展。
[0003]芝麻属中的有些野生种具有高抗病抗逆耐渍等特性，将野生种极为丰富的遗传多样性和宝贵的抗病虫、抗逆境的基因导入栽培种可以增加栽培种资源的遗传多样性，对创制优良新种质和培育新品种具有重要意义，是解决芝麻产量低而不稳的一条有效途径。
[0004]近二十年来，国内外学者先后就芝麻属远缘杂交技术开展了大量研究，但是采用常规的杂交方法，芝麻野生种与栽培种种间杂交并不能获得种间杂交F1后代。如TarihalRamesh等用‘野芝I号’ (S.radiatum)做母本与栽培品种正反交结果得到的种子没有发芽；刘红艳等用‘刚果野芝麻’和‘野芝I号’进行正反种间杂交，未能得到F1植株。
[0005]幼胚(珠)离体培养技术是通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需的营养物质，促使幼胚发育成植株，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，为创造遗传新种质提供一条重要途径。目前，采用常规方法进行亲缘关系较远的芝麻种属间杂交不易成功，芝麻在进行远缘杂交时普遍存在杂交不结实，结蒴率低和结籽率低，杂种胚不发育等现象。因此，利用幼胚挽救离体培养技术，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，进行芝麻栽培品种的种质改良，是提高芝麻品种抗性特征的重要技术途径。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，解决了野生种芝麻(s.radiatum, 2n = 64)与栽培品种芝麻(2n = 26)进行远缘杂交时存在的杂交不结实，杂种胚败育，无法获得杂种F1植株等问题。
[0007]为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为:
[0008]—种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，包括如下步骤:
[0009](I)亲本材料准备:母本选用芝麻栽培品种(2n = 26)，父本选用芝麻野生种(S.radiatum, 2n = 64)，精选无病饱满的父母本籽粒以备种植；
[0010](2)远缘杂交:当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊；用父本杂交授粉；
[0011](3)胚珠的剥取:取步骤⑵杂交授粉后生长发育了 10?18天的幼蒴，用清水将幼蒴表面冲洗干净，然后在无菌条件下对幼蒴表面进行消毒并用无菌水漂洗，最后切开幼蒴，轻轻剥出胚珠；
[0012](4)幼胚挽救离体诱导培养:在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d和光照强度1500?20001ux条件下离体诱导培养，使胚珠萌发得到幼胚；
[0013](5)幼胚的分化培养:将步骤⑷得到的幼胚接种到分化培养基中，在温度28?30°C、光周期8?16h/d和光照强度1500?20001ux条件下分化培养直至幼胚发育成杂种F1幼苗；
[0014](6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存:在无菌条件下，从培养基中取出杂种F #力苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种匕植株后放在人工气候培养箱中保存；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整的杂种F1植株并保存。
[0015]上述方案中，步骤(3)所述取杂交授粉后生长发育了 12d?18d的幼蒴。
[0016]上述方案中，所述MS诱导培养基为:在MS基本培养基中添加0.3?0.5mg/L赤霉素、0.5?lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0017]上述方案中，所述分化培养基为:在MS基本培养基中添加0.3?0.6mg/L IBAWI哚丁酸)、0.5?0.8mg/L AgN03、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0018]上述方案中，步骤(4)所述离体诱导培养的培养时间为25?30d ;步骤(5)所述分化培养的培养时间为25?30d。
[0019]上述方案中，所述生根培养基为:在MS基本培养基中添加0.2?0.5mg/L NAA (萘乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0020]上述方案中，所述增殖培养基为:在MS基本培养基中添加1.5?3mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、I?2mg/L IAA (吲哚乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0021]上述方案中，所述幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养至形成完整的杂种F1植株的时间为20d?30d。
[0022]上述方案中，所述幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中扩繁直至诱导分化出顶芽的时间为14d?20d。
[0023]上述方案中，所述杂种株的移栽种植方法为:将步骤(6)得到的杂种F i植株在室内自然光下开瓶炼苗2?3d，取出杂种F1植株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到按质量比计泥炭:珍珠岩:蛭石=1:1:1的穴盘中，置于27?30°C温度、保持60?70%相对湿度条件下培养30d后带土移栽，即下地种植。
[0024]本发明还结合了分子鉴定法和细胞学鉴定法对芝麻野生种和栽培种远缘杂交获得的杂种匕植株的真实性进行判断，具体的鉴定方法为:
[0025](I)分子鉴定:分别提取父本野生种(S.radiatum, 2n = 64)、母本栽培品种(2n = 26)及杂种？4直株的基因组DNA，将其分别作为模板，用SSR引物HS073 (GenBank, JP643611):正向引物序列:5’ -CCGAAGGGATAGATCGACAT-3’、反向引物序列:5’-ATCTTCCCTCCCTTTTCTGC-3’进行PCR反应，然后将PCR反应产物进行凝胶电泳分析；在凝胶成像仪上照相观察；根据在杂种F1植株的凝胶电泳带型上有无亲本的特异扩增条带，在早期鉴定杂种F1植株是否为真杂种:若杂种F ^直株的电泳带型上有母本栽培种的特异性扩增条带190bp、父本野生种的特异性扩增条带170bp，则可以判断该杂种匕植株为真杂种，若没有则为假杂种。
[0026](2)细胞学鉴定:取亲本及杂种F1植株的根尖，用0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理4h，然后用卡诺固定液固定，固定时频繁更换固定液直至材料褪色完全，放置冰箱中保存备用；制片时，取出固定好的根尖，用lmol/L的盐酸，60°C水浴处理4.5min进行水解，解离后放入蒸馏水中漂洗3次，用改良石炭酸品红染色Smin至子房呈紫红色，压片，选取有丝分裂中期相较好的细胞在Olympus显微镜下观察，统计其染色体的数目，进一步鉴定杂种F1真实性，真杂种的染色体数目应该为45条染色体。
[0027]芝麻种间远缘杂交对于引入芝麻野生种优良基因，拓宽芝麻栽培种的遗传基础，促进种间的基因交流，创造新的芝麻中间类型具有重大意义；但进行芝麻种间远缘杂交时，若父母本亲缘关系较远、遗传差异较大、亲本之间染色体数目严重不对等、染色体结构不协调等将导致种间的远缘杂交不容易获得成功，杂种胚容易在早期发生败育，难以获得杂交后代F1植株。本发明将染色体数目相差大的亲本，即芝麻野生种(S.radiatum, 2n = 64)与栽培种(2n = 26)进行种间远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服受精后发育障碍，杂种胚败育无法获得杂种F1植株等问题，同时芝麻野生种(Sesamum radiatum, 2n = 64)具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，有效的改良了芝麻栽培品种的种质。因此，本发明所述的利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种芝麻与栽培种远缘杂交后代的方法具有实际的应用价值。
[0028]本发明的有益效果:
[0029](I)本发明选用染色体数目相差较大的亲本，即母本选用芝麻栽培种(2n = 26)、父本选用芝麻野生种(S.radiatum, 2n = 64)进行种间远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服了亲缘关系较远的芝麻种间远缘杂交容易发生幼胚败育而无法获得杂种F1植株的问题，同时芝麻野生种(Sesamum radiatum, 2n = 64)具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，可以有效改良芝麻栽培品种的种质；
[0030](2)本发明通过选择合适的幼胚挽救接种时期和离体诱导培养条件，杂种幼胚经挽救离体诱导培养后可以被诱导萌发，然后经过继代、增殖培养萌发成杂种F1植株，本发明方法克服了芝麻种间杂交的不亲和性，利用挽救离体诱导培养获得杂种F1植株，并且还可以对杂种F1植株进行繁殖和长期保存，为转移和利用芝麻野生种的优良基因提供了便利条件；
[0031](3)本发明提供了一套完整的利用幼胚离体挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻的远缘杂交后代(杂种F1植株)的方法，同时还提供了杂种F1植株的繁殖、保存和鉴定方法，对丰富芝麻品种的遗传基础、优化育种技术将发挥重要的积极作用。
【附图说明】
[0032]图1为幼胚挽救离体诱导萌发获得幼胚的图片。
[0033]图2为幼胚萌发的分化培养图片。
[0034]图3为获得杂种F1植株的图片。
[0035]图4为亲本与杂种F1植株的SSR标记鉴定电泳图，其中1、2、3均代表杂种F:植株。
[0036]图5为亲本与杂种匕根尖染色体数目观察图:栽培品种(左)、杂种F1植株(中)与芝麻野生种(右)。
[0037]图6为栽培品种(左)、杂种F1植株(中)与芝麻野生种(右)株型的对比图。
【具体实施方式】
[0038]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0039]实施例1
[0040]一种利用幼胚挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻远缘杂交后代的方法，包括如下步骤:(I)亲本材料准备:母本选用从播种至开花期为40-50天的综合性状较好的栽培品种“中芝14”;父本选用野生种“野芝5号”(S.radiatum, 2n = 64)为材料，精选无病饱满的籽粒以备种植；
[0041](2)远缘杂交:当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊，挂牌；用父本授粉，记录杂交花数，授粉结蒴数；
[0042](3)胚珠的剥取:分别选择杂交授粉后12d?18d发育时期的幼蒴，用清水将其表面冲洗干净，在超净工作台下用75%酒精将幼蒴表面消毒30s，再用3%的次氯酸钠消毒8?10分钟，然后用无菌水漂洗幼蒴2?3次，每次5?8分钟；在灭菌纸上用刀切开幼蒴，轻轻剥出杂种胚珠；
[0043](4
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0访客 来自[中国] 2022年08月22日 15:44我发现了一株野生芝麻苗，已结果，有研究价值吗18371230519
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