专利名称：SARS病毒的siRNA靶序列文库与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种文库与应用，特别涉及一种siRNA靶序列文库与应用，尤其是涉及SARS病毒的siRNA靶序列文库及在筛选抗SARS病毒药物中的应用。
药物分子与病毒某些部位分子的特异识别是药物发挥作用的基础。这要求特异识别部位要具有一定的供识别用的信息量，同时这些部位对病毒的生命周期是重要的，受到攻击后病毒将无法增殖。显然病毒基因组RNA分子满足上述条件。近年来发展起来的RNA干扰技术提供了攻击病毒基因组RNA的有力工具。
1998年，美国科学家Andrew Fire和Craig Mello将体外转录得到的纯化的双链RNA注射线虫时发现，双链RNA的基因抑制效果远高于单链RNA的效果，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)(Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific geneticinterence by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature，1998，391(6669)806-811)。随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。最近德国科学家发现，哺乳动物细胞中存在着两条相互独立的干扰途径较长的双链RNA介导非特异干扰效应，可以导致整个细胞内蛋白质合成抑制和RNA降解。长度为21到25个碱基的所谓小干扰RNA(siRNA，smallinterfering RNA)介导特异性干扰反应，只降解与其负链高度互补的特定基因的mRNA(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)494)。目前，RNA干扰已经成为基因组中基因功能研究的有力工具，用于关闭特定基因的表达。同样，也成为疾病治疗的重要药物设计手段，在抗HIV(乙型肝炎病毒)和HCV(hepatitis C virus)的药物设计方面已经取得了进展(Jacque，J.M.，Triques，K.，Stevenson，M.，Modulation of HIV-1 replicationby RNA interference，Nature，2002，418(6896)435；Wilson，J.A.，Jayasena，S.，Khvorova，A.et al.，RNA interference blocks gene expression and RNAsynthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003，100(5)2783)。SARS病毒作为正链RNA病毒，其增殖过程中的一些特点表明它应该是RNA干扰的一个合适的应用对象。
SARS病毒入侵宿主细胞，首先是病毒的包膜与宿主细胞膜融合，然后病毒的正链基因组RNA链进入宿主细胞，并利用它为模版在宿主细胞的翻译机构中合成依赖RNA的RNA聚合酶。RNA聚合酶再以病毒正链RNA为模版互补合成出病毒负链RNA，病毒负链RNA在RNA聚合酶的作用下进一步生产出正链病毒基因组RNA和病毒的其它重要蛋白质的mRNA，然后利用宿主的翻译机构翻译出蛋白质(S，M，N，P)后组装成病毒颗粒，完成增殖过程。哺乳动物细胞中存在的由siRNA介导的干扰效应有很强的特异性，可以针对病毒增殖过程中产生的各种RNA发挥作用。
RNA是线性分子，由于可以通过回折使内部碱基配对形成发夹结构，RNA分子在细胞内的状态并非是一条线性链，而是具有复杂的二级结构。RNA二级结构中，配对的部分形成一段类似DNA的双螺旋，称为茎。不配对的部分称为环，环上的碱基尚未参与配对，称之为自由片段，如果仅仅打开4个以下的碱基对就可以成为自由片段，则称为准自由片段。茎部已经配对碱基片段失去了与siRNA相互识别的能力，只有当打开螺旋消除配对后才可能成为RNA干扰的作用位点。所以说，长度为21到25个碱基的自由片段与准自由片段才可能是高效的RNA干扰靶点。
发明创造内容本发明的目的是提供SARS病毒的siRNA靶序列文库。
本发明所提供的SARS病毒的siRNA靶序列文库，包括序列表中SEQ ID No1-27或与序列表中SEQ ID No1-27限定的RNA序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。
本发明将基因工程学及生物信息学有机结合，创造性地构建了SARS病毒的siRNA靶序列文库，该文库可用于筛选抗SARS病毒药物，具有重要的理论及现实意义。
在SARS基因组中，有若干个位置出现了与人的基因组中的片段相匹配的片段。作为特异降解RNA药物的siRNA，应该去掉那些可能与人基因组相匹配的片段，以保证对人是安全的。将SARS病毒基因组中的自由片段和准自由片段与人类基因组联配，剔除那些与人类基因组有较多(18个碱基以上)匹配的片段。
RNA中的碱基配对除了通常的A＝U和C＝G外，还允许U＝G配对，故病毒正链RNA与病毒负链RNA的A-U转换导致U的位置和数量变化，造成它们的二级结构可以有较大的差异。
一般的正链RNA病毒在增殖过程中，正链和亚基因组RNA的浓度要远大于负链的浓度，例如烟草花叶病毒，正负链的浓度可以相差100倍(Ishikawa.M，Meshi.T，Motoyoshi.F，et al.Specific Cessation of Minus Strand RNAAccumulation at an Early Stage of TMV Infection.J.Virol.，1991，65861-868)。如果SARS病毒的负链浓度远低于正链和其它亚基因组mRNA的浓度，则以SARS病毒负链RNA序列为目标的RNA干扰，其抗病毒效果要优于针对正链和亚基因组RNA的抗病毒效果。
研究发现，在3’端悬垂TT的siRNA具有较高的稳定性(Elbashir，S.M.，Harborth，J.，Lendeckel，W.et al.，Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediateRNA interference in cultured mammalian cells，Nature，2001，411(6836)494.)。这要求基因组上的靶片段的5’端为AA。
不同的SARS株之间存在一些位点的碱基变化(Results of multiple sequencealignment of 19 complete SARS coronavirus genome，athttp//antisars.cbi.pku.edu.cn/news/news.jsp？id＝114)，要得到广谱的抗SARS药物，应该尽量选择那些保守的位点。
根据上述考虑，制订了寻找高效RNA干涉位点的评分标准和筛选方法1)在SARS病毒基因组中筛选长度20-25个碱基的自由片段，每呈现1次自由片段加1分，允许自由片段中包含小于4个碱基对的颈，每个碱基对减0.1分，该项总得分称为呈现率；2)片段5’端为AA，加5分，该项得分称为稳定度；3)判断候选靶片段中是否有突变位点，每有一个位点变化减1分，该项得分称为保守度；所述选择剔除规则，是将较高(10以上)呈现率的自由片段与人类基因组做联配，剔除那些与人类基因组有较多(18个以上)匹配的片段。
根据上述评分标准和筛选规则，以SARS病毒多伦多株为基本材料，针对其病毒RNA正链和负链，从约6万个候选片段中根据分值筛选出了27个高效siRNA作用靶序列。根据正链和负链分别列于表1和表2根据靶序列片段的碱基排列，可以很容易设计出与之相互作用的siRNA。以靶序列5’-AAUUUUAAUUCCUUUAUACUU-3’为例，其对应的siRNA为5’-UUUUAAUUCCUUUAUACUUTT-3’3’-TTAAAAUUAAGGAAAUAUGAA-p-5’靶序列互补链5’端的p表示磷酸化，是高效发挥RNA干涉所需要的修饰(NykanenA，Haley B，Zamore P D.ATP requirements and small interferings RNA structure in theRNA interference pathway.Cell，2001，107(3)309-321)。由于在RNA中存在非正常的U＝G配对，所以，给定一条靶序列后可以设计出几个不同的siRNA分子，正常配对的那个siRNA的识别效率会高些。
表1正链上高效siRNA作用靶序列
表2负链上的高效siRNA作用靶序列
序列表<160>27<210>1<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>1aaacaauaauaaauuuuacug21<210>2<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>2uuguuucuguuaccuucucuu21<210>3<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>3aaucauuauuaaagacuguac21<210>4<211>23<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>4uacccagauccaucaagaauauu23<210>5<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>5uaucucaccuuauaauucaca21<210>6<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>6aauugccuuucuuuuacuauu21<210>7<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>7gacuacaaaagagaagcccca21<210>8<211>22<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>8aaccuucuacccaaaacuacaa22<210>9<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>9uuuucuuauuauuucuuacuc21<210>10<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>10auuauuaacaauucuacuaau21<210>11<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>11aaacaacuuagcucuaauuuu21<210>12<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>12auuaacaacacaguuuaugau21<210>13<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>13aauaugagcaauauauuaaau21<210>14<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>14aacgaacuaacuauuauuauu21<210>15<211>24<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>15aacgaacaugaaaauuauucucuu24<210>16<211>24<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>16aauuucuugaauuaccgcgacuac24<210>17<211>22<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>17aauugaucuaagaguaaaaaau22<210>18<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>18ugucaacacaaaguaaucacc21<210>19<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>19cucccuucgaauuguuauagu21<210>20<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>20aagacaucaaaaacaaaagug21<210>21<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>21acaccaucuaaagcuacaccc21<210>22<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>22aauuagauaagaguacaccaa21<210>23<211>21<2 12>RNA<213>SARS冠状病毒<400>23uagcaucacgaccacacacac21<210>24<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>24cuaguauaaaagaagaaucgg21<210>25<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>25aauuuuaauuccuuuauacuu21<210>26<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>26ccuucaauaacuaaauuuuca21<210>27<211>21<212>RNA<213>SARS冠状病毒<400>27agcuacacagauuuuaaaguu2权利要求
1.SARS病毒的siRNA靶序列文库，包括序列表中SEQ ID No1-27或与序列表中SEQ ID No1-27限定的RNA序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的SARS病毒的siRNA靶序列文库，其特征在于所述文库由序列表中SEQ ID No1-27组成。
3.权利要求1所述的SARS病毒的siRNA作用靶序列文库在筛选抗SARS病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种SARS病毒的siRNA靶序列文库与应用，目的是提供一种可用于筛选抗SARS病毒药物的siRNA靶序列文库。本发明所提供的SARS病毒的siRNA靶序列文库包括序列表中SEQ ID №1－27或与序列表中SEQ ID №1－27限定的RNA序列具有95％以上同源性的核苷酸序列。本发明的文库可用于筛选抗SARS病毒药物。
文档编号C12Q1/68GK1465584SQ0314670
公开日2004年1月7日 申请日期2003年7月9日 优先权日2003年7月9日
发明者纪丰民, 罗辽复 申请人:北京交通大学