专利名称：使用2价金属的核酸捕获方法
技术领域：
本发明涉及使用以2价金属离子为介质的核酸缔合体或2价金属离子固定化基材等的核酸捕获方法。
背景技术：
在生物技术或临床诊断等领域，从含有核酸的试样配制核酸是一项重要的技术。例如在基因重组技术中，需要单独分离载体DNA或要克隆的DNA的双链，在遗传病或癌基因方面若要进行基因检查，需要从血液中的白细胞等中提取核酸。
一般来说，核算并不作为游离分子存在，而是存在于如细菌、细胞、病毒粒子等中，由蛋白质、脂质及糖构成的细胞膜或细胞壁所覆盖。另外，核酸本身与组蛋白等形成复合体。若要提取以如此状态存在的核酸，需要如下操作破坏覆盖核酸的细胞膜或细胞壁，促使所述复合体的蛋白质变性或分解，使之可溶化、使核酸游离，提取游离的核酸。
作为从细胞调制核酸的方法，通常的方法是将含细胞的试样用SDS或蛋白酶K处理、可溶化之后，用苯酚变性去除蛋白质，以精制核酸(Molecular Cloning 2ndEdition，9.16-9.23，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。但是，由于该方法费功夫和时间，因此需要更简便的方法。
作为用于分离核酸的更为简便的方法，例如，WO99/22021揭示了使用二氧化硅的方法。用该方法，首先用离液剂处理，溶解细胞，使核酸游离。然后，将核酸吸附到由二氧化硅或其衍生物构成的核酸结合性载体上，用离液剂或有机溶剂离心清洗该载体。最后，用低盐缓冲液溶出核酸。该方法与苯酚法相比虽然简便，但尚具有含多个工序、需要离心操作的缺点。另外，由于使用了强烈阻碍PCR等酶反应的高离液盐或乙醇，需要完全去除这些物质，因此存在操作变得繁杂、费时间等的缺点。
日本专利公开公报特公平8-24583号、特开平8-280384号等揭示了使用如白细胞分离过滤器的细胞吸附型纤维集合体从末梢血白细胞调制核酸的方法。在日本专利公开公报特公平8-24583号所记载的方法中，首先使血液通过白细胞分离过滤器，使血液中的白细胞吸附到过滤器上，与血液中的其他成分分离。使TE(10mM Tris；1mM EDTA；pH7.6)流过、清洗该过滤器，去除血红蛋白等的蛋白质。如此分离清洗的白细胞与过滤器一起冻结在例如-80℃中，然后放置于室温中将白细胞解冻。然后在纤维状物质中加入TE-mix(TE、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、pH7.5)，从纤维状物质中回收吸附在过滤器的纤维状物质上的白细胞。然而，在日本专利特公平8-24583号公报中揭示了以下方法按照已有的技术(苯酚处理)进行从回收的白细胞提取基因组DNA的操作。即，在白细胞中加入十二烷基硫酸钠(SDS)等的表面活性剂和蛋白分解酶(蛋白酶K)，在65℃中培养15小时，在其中加入RNA分解酶(核糖核酸酶A)在37℃培养1小时之后，用苯酚试剂处理，用乙醇沉淀、精制DNA。
在日本专利特开平8-280384号公报所揭示的方法有吸附有核细胞后，取出有核细胞中的核酸或蛋白质。作为取出核酸或蛋白质的方法，公开了在极细纤维集合体上结合细胞后，原封不动地通过细胞溶解液进行溶解，或进行破碎。该方法的优点是可以将吸附的细胞原封不动地进行破碎、溶解处理。由于可以无需解吸所吸附的细胞而对其进行破碎或溶解，因此比对所吸附的细胞进行解吸的方法更容易实施。然而，在该公报中，对于细胞溶解后的核酸精制，也只沿用已有的技术，而未揭示新的方法。即，用蒸馏水或表面活性剂处理吸附了细胞的极细纤维集合体，用普通的苯酚-氯仿法从通过极细纤维集合体的细胞溶解液中精制核酸。
如上所述，在从末梢血白细胞精制核酸的方法方面，采用类似白细胞分离过滤器的细胞吸附型纤维集合体已经公知，上述方法不过是使用过滤器进行至白细胞的分离或核酸提取的步骤为止，而之后的核酸精制工序采用了已有的核酸精制法。因此，存在核酸的精制工序变复杂，费时间和功夫的缺点。
作为更加简便的方法，WO00/21973揭示了采用过滤器从细胞直接精制核酸的方法。该方法包含如下工序(1)首先，将含有细胞的试样经过过滤器，使细胞吸附在过滤器上。(2)然后，溶解吸附在过滤器上的细胞，(3)用过滤器过滤。(4)清洗吸附到过滤器上的核酸。(5)最后，从过滤器中溶出核酸。若从40℃加温至125℃，则吸附的核酸会溶出，溶出缓冲液的pH为5至11的范围，盐浓度可高可低。精制的核酸的A260/A280为1.8，可以作为PCR的模板使用。在WO00/21973中，虽然作为可用于精制核酸的目的的过滤器的例子，列举了Whatman GF/D variant filters，另一方面，作为不可使用的例子列举了WhatmanGF/C variant filters，但适用于该方法的过滤器必须是，即使将精制DNA在过滤器通过，也不会捕获到精制DNA。另外，在该方法中，若溶解细胞之后通过过滤器，则DNA的收率降低80％，因此并不实用。再有，采用该方法从血液调制核酸时，实验者需要在溶解白细胞之前使红细胞溶血。加之，在如上所述将细胞吸附到过滤器之后进行精制的方法中，存在必须根据细胞的种类选择过滤器的缺点。
作为克服这些缺点的更简便的方法，WO03/006650揭示了采用无纺布分离、扩增及检测核酸的方法。该方法包含，首先使细胞抽出液接触无纺布，将细胞提取液中的核酸吸附到无纺布上，然后在该无纺布上加入用于扩增核酸的溶液，将吸附到该无纺布上的核酸作为模板扩增核酸的工序。用该方法无需采用任何特别的试剂，通过使试样中的核酸接触无纺布上这样非常简便的方法，可以在无纺布上精制核酸。另外，在无纺布上精制的核酸通过接触核酸合成反应液，可以原封不动进行扩增反应，核酸的检测非常简便。然而，在捕获比较低浓度(1pg/mL～100pg/mL)的核酸时，该方法存在由于试样中共存的蛋白质如白蛋白或球蛋白等的影响从而捕获率大幅降低的缺点。
另一方面，作为用于离析核酸的方法使用2价金属离子的例子，已知的有例如采用二氧化硅的方法(WO99/22021)。在该方法中，首先用离液剂(chaotropic reagent)处理细胞，溶解细胞，游离核酸。然后，将核酸吸附到由二氧化硅或其衍生物构成的核酸结合性载体上，用离液剂或有机溶剂将该载体进行离心清洗。最后，用低盐缓冲液将核酸溶出。在该方法中，为了在核酸吸附到载体上时维持核酸的固定化，作为对溶液的添加物采用含有镁的各种盐类。
该方法并不是作为将离子每固定化于基材侧、捕获液相侧的核酸的手段使用，也不是将镁离子用作为分离核酸的主要手段。日本专利特愿平5-164841号公报中揭示了使用镁盐从蛋白质分离双链核酸的方法。在该方法中，通过将含有pK小于9的羟基取代芳香族部分的聚合物作为基材使用，在该基材上使pH7～10、一价或多价的阳离子共存，使含有核酸与蛋白质的液相接触，从而在使蛋白质及单链核酸结合到基材上，将未结合于基材上的双链核酸从液相分离。该方法不含在pH12以上的高碱性条件下使试样变性的工序，另外，并不是将镁作为核酸捕获剂积极地在固定化于基材上。还有，该方法并不是在pH12以上的高碱性条件下使镁离子与核酸共存，并结合于基材上。
发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于提供一种从含核酸的试样中捕获、回收核酸的方法，该方法比已有的方法更简便且高收率。本发明进一步的目的在于提供一种可用于已有的核酸扩增技术的、迅速且简便的核酸调制法。
解决课题的手段本发明者认真研究的结果，发现在试样中添加氯化镁等的镁化合物之后，若通过加入氢氧化钠等的碱，将pH提高到14附近，则即使在蛋白质共存的试样中核酸对无纺布的捕获效率也会戏剧性地回复。进一步研究的结果，令人吃惊的是，发现在高碱性条件下核酸通过2价金属离子，更理想的是通过镁离子的特异作用而形成缔合体、及通过形成该缔合体，核酸的外观尺寸增大，在过滤器上的捕获效率提高，可以高收率地从含核酸的试样捕获核酸。
另外，本发明者在含有核酸的试样中添加氢氧化钠，从而调制将pH提高到14附近的试样，使该试样通过固定化了镁的无纺布，则吃惊的是发现，在蛋白质共存的试样中核酸对无纺布的捕获效率戏剧性地提高。本发明者进一步研究的结果，发现在高碱性条件下变性为单链的核酸与镁的结合力非常高，液相核酸容易被固相的镁捕获。本发明基于这些发现而完成。
即，根据本发明提供将试样中的核酸捕获到固相基材表面上的方法及检测试样中的核酸的方法，其中，将试样中的核酸捕获到固相基材表面上的方法捕获包括将该试样调整到pH12以上的工序和下述某一项工序使固定化在固相基材表面上的、至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合，捕获核酸的工序，或使至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合之后，使核酸接触固相基材表面而捕获的工序；检测试样中的核酸的方法包括将试样调整到pH12以上的工序和下述某一项工序将该试样调整到pH12以上的工序和下述某一项工序使固定化在固相基材表面上的、至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合，捕获核酸的工序，或使至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合之后，使核酸接触固相基材表面而捕获的工序；而且还包括以该捕获的核酸为模板使特定碱基序列的核酸扩增，并对其进行检测的工序。
在这些方法中，最好是所述至少1种2价金属离子为镁。
以下，将上述本发明大致分为3个形态进行说明。
根据第1形态，提供一种将核酸捕获到固相基材表面上的方法，该方法包括使pH调整为12以上的试样接触固相基材表面，该试样含有核酸及2价金属离子化合物，所述2价金属离子化合物最好是镁化合物。
典型地，该方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加2价金属化合物，最好是镁化合物的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加碱，将试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸的缔合体的工序，及(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序。
另外，其它典型的方法中，至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加2价金属化合物，最好是镁化合物，形成试样中的核酸的缔合体的工序；及(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序。
从其它观点来看，本发明提供一种检测核酸的方法，该方法包括，使含有核酸及2价金属化合物，最好是镁化合物的、pH调整为12以上的试样接触固相基材表面，以在该固相基材表面上被捕获的核酸为模板，使特定碱基序列的核酸扩增并对其进行检测的工序。
典型地，该方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加2价金属化合物，最好是镁化合物的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加碱，将试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序；(d)使含有可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测。
另外，其它典型的形态，至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加2价金属化合物，最好是镁化合物，形成试样中的核酸的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序；(d)使含有可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液接触工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
还有，在其他形态中，上述工序(d)及(e)，可以用如下工序替代(d’)使核酸从工序(c)中得到的固相基材表面溶出，在得到的溶出液中加入含有可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液，以该溶出液中的核酸为模版扩增具有特定碱基序列的核酸；及(e’)对具有在工序(d’)中扩增的特定碱基序列的核酸的工序进行检测。在上述的溶出工序中，最好能进行热溶出、表面活性剂溶出、或EDTA溶出。
根据上述各发明的理想的形态，提供一种通过过滤，在固相基材表面捕获核酸的缔合体的上述的方法；及固相基材为过滤器的上述方法。
根据第2形态，提供一种在固相基材表面捕获核酸的方法，该方法包括使含有核酸和2价金属化合物及对2价金属离子具有亲和性的高分子化合物的、pH调整为12以上的试样接触固相基材表面的工序。
典型地，该方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物的工序；(b)将工序(a)中得到的试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸与至少1种2价金属化合物及高分子化合物的缔合体的工序；及(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的缔合体的工序。
另外，其它典型的方法，至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物，形成试样中的核酸与至少1种2价金属化合物及高分子化合物的缔合体的工序；以及(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的缔合体的工序。
还有，根据本发明其他形态，提供一种检测核酸的方法，该方法包括使含有核酸和2价金属化合物及对2价金属离子具有亲和性的高分子化合物的、pH调整为12以上的试样，接触固相基材表面，以在该固相基材表面所捕获的核酸为模板，使特定碱基序列的核酸扩增并对其进行检测的工序。
典型地，该方法至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物的工序；(b)将工序(a)中得到的试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸与至少1种2价金属化合物及高分子化合物的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的缔合体的工序；(d)使含有适于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板，扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
另外，其他典型的形态，至少包括(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物，形成试样中的核酸与至少1种2价金属化合物及高分子化合物的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的缔合体的工序；(d)使含有适于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板，扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
在第3形态中，提供一种在固相基材表面捕获核酸的方法，该方法包括使含有核酸的、pH12以上的试样与将2价金属离子、最好是将镁离子固定化的固相基材表面接触的工序。
典型的该方法，至少包括如下工序(a)将2价金属离子，最好是将镁离子，在固相基材表面上固定化的工序；(b)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；及(c)使在工序(b)得到的试样接触在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序。
从其它观点来看，提供一种检测核酸的方法，该方法包括使含有核酸的、pH调整为12以上的试样接触将2价金属离子、最好是将镁离子固定化的固相基材表面，以在该固相基材表面上所捕获的核酸为模板，使特定碱基序列的核酸扩增并对其进行检测的工序。
典型地，该方法至少包括如下工序(a)将2价金属离子，最好是将镁离子，在固相基材表面上固定化的工序；(b)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(c)使在工序(b)得到的试样接触在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序。
(d)使含有可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。另外，在其他典型的形态，至少包括下述工序(a)将2价金属离子，最好是将镁离子，在固相基材表面上固定化的工序；(b)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(c)使在工序(b)得到的试样与在工序(a)中得到的固相基材表面接触，在固相基材表面捕获核酸的工序。
(d)使核酸从工序(c)得到的固相基材表面溶出，在得到的溶出液中添加含有可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液，以在该溶出液中的核酸为模板，扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。在上述的溶出工序中，最好能进行热溶出、表面活性剂溶出或EDTA溶出。
根据上述本发明的理想形态，提供包括如下的方法通过过滤，在固相基材表面捕获核酸的上述方法；及上述方法中，固相基材为过滤器；固相基材包含具有可以将2价金属离子，最好是镁离子，固定化的残基的高分子；能够将2价金属离子，最好是镁离子，固定化的残基为羧基；以及，将固相基材层多层化的固相基材，其中，所述固相基材层是固相基材将2价金属离子，最好是镁离子固定化的固相基材层。
还有，从其它观点来看，根据本发明，提供核酸的捕获用具，所述核酸的捕获用具包含在其表面上固定化2价金属离子，最好是镁离子的固相基材；及提供核酸的捕获用具，所述核酸的捕获用具包含具有可在其表面上固定化2价金属离子，最好是镁离子的残基的固相基材。
另外，根据本发明，提供，核酸的检测套装，包括(a)在其表面上固定化有2价金属离子，最好是镁离子的固相基材；及(b)可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶中的至少一种。
发明效果本发明在核酸的捕获、浓缩及分离精制上无需特别的装置，就可以简便地捕获核酸，扩增、检测捕获的核酸。通过2价金属离子，最好是通过镁离子捕获在固相基材表面上捕获的核酸，可以原封不动作为核酸合成反应的模板使用，更进一步，可以通过表面活性剂、热或螯合剂等的作用很容易地从固相基材表面溶出，所以可以简便得到含有核酸的溶出液，进行核酸合成及检测反应。另外，通过以2价金属离子，最好是镁离子形成缔合体而捕获到固相基材表面上的核酸，可以原封不动作为核酸合成反应的模板使用，更进一步，可以通过表面活性剂、热或螯合剂等的作用很容易地从固相基材表面溶出，所以可以简便得到含有核酸的溶出液，进行核酸合成及检测反应。
图1是显示在实施例中使用的无纺布固定化的柱的结构的图。
图2是显示无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间的比较结果的图。纵轴表示浊度变为0.1为止的经过时间。
图3是显示在镁离子固定化无纺布中的核酸捕获效果(无纺布表面的荧光强度)的图。
图4是显示比较(镁吸附到聚合物涂层非织造布与多层化过滤器的效果)无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间的图。纵轴表示浊度变为0.1为止的经过时间，(1)至(5)表示无纺布的状态。
图5是表示比较(试样有无碱处理的比较)无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间的图。纵轴表示浊度变为0.1为止的经过时间，(1)及(2)表示无纺布的状态。
图6是显示测定例5中得到的无纺布表面的荧光强度的结果的图(生理盐水试样)。图中的数字表示荧光强度，(1)至(3)表示吸附到无纺布上的试样编号。
图7是显示测定例6中得到的无纺布表面的荧光强度的结果的图(NaOH处理试样)。图中的数字表示荧光强度，(1)至(4)表示吸附到无纺布上的试样编号。
图8是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(确认添加氯化镁带来的效果)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间，(1)至(3)表示吸附到无纺布上的试样编号。
图9是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(讨论氯化镁的添加浓度)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。
图10是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(讨论试样pH的影响)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。
图11是显示在例10中碱性条件下的琼脂糖凝胶电泳结果的图(镁的添加效果)。第1列λDNA、第2列λDNA+0.3％BSA、第3列λDNA+1mM MaCl2、第4列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2、第5列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2+1mM EDTA。
图12显示在例11中碱性条件下的琼脂糖凝胶电泳结果的图(镁的添加浓度的影响)。5％琼脂糖、0.05N NaOH、第1列λDNA+0.1mM MaCl2、第2列λDNA+0.2mM MaCl2、第3列λDNA+0.3mM MaCl2、第4列λDNA+0.4mM MaCl2、第5列λDNA+0.5mM MaCl2。
图13是显示在例11中pH8条件下的琼脂糖凝胶电泳结果的图(镁的添加效果)。第1列λDNA、第2列λDNA+0.3％BSA、第3列λDNA+1mM MaCl2、第4列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2、第5列λDNA+0.3％BSA+1mM MaCl2+EDTA。
图14是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(固定化各种二价金属离子的无纺布的比较)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。
图15是显示在无纺布上捕获的DNA的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的结果的图(1％琼脂糖)。第1～4列是使用的无纺布上有无固定化的镁离子、及吸取的样品的顺序。
第1列未固定化、BCG菌基因组200pg/生理盐水/0.2N NaOH第2列未固定化、BCG菌基因组200pg+0.3％HSA/生理盐水/0.2N NaOH第3列镁固定化、BCG菌基因组200pg/生理盐水/0.2N NaOH
第4列镁固定化、BCG菌基因组200pg+0.3％HSA/生理盐水/0.2N NaOH。
图16是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(EDTA及锶的添加效果)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。(1)至(5)表示吸附到无纺布上的各试样。
图17是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(对尿试样的镁固定化无纺布的核酸捕获效果)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。横轴表示在无纺布上吸取的各试样。图中左侧蓝色斜线的柱表示未处理的无纺布、右侧红色柱表示将镁固定化的无纺布。
图18是表示将非织布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(含BSA的清洗液对捕获核酸捕获后的无纺布的效果)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。横轴表示含在清洗液中的BSA的浓度。
图19是表示将无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间进行比较的结果的图(金属离子亲和性高分子的添加效果)。纵轴表示在LAMP扩增反应中，伴随焦磷酸镁生成的浊度(在650nm的吸光度)变为0.1为止的时间。(1)至(4)表示吸附到无纺布上的各试样。
具体实施例方式
在本发明中，作为含有核酸的试样，可以举例如从含有细胞的试样中破坏细胞而调制的细胞提取液。在本说明书中，所谓细胞意味着真核细胞、原核细胞或病毒，尤其包括人体细胞、人末梢血白细胞、成为感染症起因的真菌、细菌或病毒。试样的种类无特别限定，只要是例如血液、尿、髓液、咳痰、体液、细胞浮游液或细胞培养液等含有细胞的试样，则其种类无特别限定。另外，试样也可以是实施过某种处理的处理液。作为处理的方法，可以举例如，将咳痰等粘性高的试样通过咳痰处理剂溶解等的方法。
所谓细胞提取液是含有破坏细胞而得到的细胞组成成分的混合物。一般来说，细胞提取液可以使细胞溶解液作用于含有细胞的试样进行调制。细胞溶解液是，用于破坏细胞，提取核酸的溶液，根据需要含有表面活性剂或酶等，但无需含有这些物质的一部分或全部。作为酶，可以使用蛋白质分解酶，如蛋白酶K等，但是也可以根据细胞种类使用溶菌酶、溶葡萄菌素(葡萄球菌属)、β1，3-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、甲壳质酶(真菌类)等。在最好去除RNA时，只要加入诸如核糖核酸酶A(RNase A)的RNA分解酶即可。另外，也可以不含如上所述的酶。在动物细胞中，可以仅接触低张液就使细胞破裂。另外，细胞提取液也可以在含有细胞的试样中施加超声波、或用均化器破碎等施加物理力而制成。
2价金属化合物只要是可以向溶液中的核酸供给2价金属离子的物质，则其种类无特别限定。如2价金属盐或2价金属高分子络合物等就适合。作为2价金属盐，较好的是如氯化物、硫酸盐或硝酸盐等。作为2价金属，较好的是如锌、锰、镁等。最理想的是镁。2价金属化合物也可以是在调整pH为12以上之前加入到细胞溶解液等的试样中，或也可以是将试样调整为pH12以上之后，在试样接触过滤器等的固相基材表面之前加入。促进核酸的缔合的2价金属化合物的浓度范围并无特别限定，较好的是如0.1mM以上。
在本发明中，用于将试样调整为pH12以上的试剂并无特别限定，如氢氧化钠、氢氧化钾等的强碱比较适合。通过添加适量的该强碱水溶液，可以将试样的pH调整为12以上。
作为使含有核酸的试样接触固相基材表面的手段，可以举例如，使试样溶液流过固相基材表面之上，或将试样溶液吸取到固相基材表面或通过加压等使试样溶液透过，或将固相基材浸到试样溶液中等的手段。
固相基材的材质及形状无特别限定，但可以使用如多孔质的片状基材，较好的是可以使用过滤器。过滤器的形状及材质无特别限定，但可以例示如无纺布、织造布、薄膜过滤器、空心线过滤器、烧结过滤器、玻璃纤维过滤器等。较好的是将由无纺布构成的过滤器作为固相基材使用。所谓无纺布是用机械的、热的、化学的手段将短纤维或长丝连接或混杂制成片状或网状的结构体(第2版纤维便览纤维学会编丸善)。无纺布可以用各种方法生产，但基本工序包括网(以存有纤维方向的程度齐全的纤维块的片状物)的形成工序和网的粘附工序、以及完成工序。作为无纺布，可以使用从天然纤维到化学纤维的各种纤维，但通常用的是棉、人造丝、聚酯、聚丙烯、或尼龙等，作为其他纤维也使用丙烯酸、维尼纶、玻璃纤维、纸浆或碳纤维等。较好的是可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯构成的无纺布。形成网的方式大体可分为湿式、干式、及直接式。直接式是又称为纺丝直接式的方法，包括收集从溶融高分子溶液纺丝的纤维、直接织网的工序。作为直接式中所含的方法可以举例如，水刺(spun lace)法、纺粘(spun bound)法、熔喷法、针刺法、缝编法(stitchbound)等，但在本发明中最适合的是用熔喷法制成的超极细纤维无纺布。
将2价金属离子在固相基材表面固定化的手段并无特别限定，可以举例如将2价金属离子在具有与2价金属离子形成络合物的配位基的固相基材表面上进行固定化。通常，作为可以与2价金属形成络合物的配位基，可以例示乙醇、苯酚、烯醇、羧酸、醛、酮、醌、醚、酯、酰胺、亚硝基化合物、硝基化合物、N-氧化物、磺酸、次磷酸、亚磷酸、胂酸、伯胺、仲胺、叔胺、偶氮基化合物、希夫氏碱、肟、亚氨或烯胺等，可以组合这些配位基的一种或2种以上进行2价金属离子的固定。作为具有这些配位基的固相基材，可以举例如涂覆有机或无机合成高分子、天然高分子、或将这些进行化学修饰的高分子、或具有这些基团的高分子的固相基材等。
通过以被固相基材表面捕获的核酸为模板扩增特定碱基序列的核酸，可以判断试样中是否存在具有该特定碱基序列的核酸，由此可以检测试样中所含的具有特定碱基序列的核酸。对于核酸的扩增，可以使用PCR代表的扩增特定目的核酸序列的方法，除PCR之外也可以使用连接酶链式反应(LCR)、转录-介导扩增(TMA)、分支DNA(bDNA)测定、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、循环探针技术(CPT)、Q-β复制酶扩增技术、滚动循环扩增技术(RCAT)、环介导等温扩增(LAMP)、等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(ISCAN)等的方法。不过、核酸的扩增方法不限定于这些。Q-β复制酶扩增技术、RCAT、NASBA、SDA、TMA、LAMP、ISCAN等可以用等温(规定温度)进行扩增反应，其他的PCR、LCR等可以用热循环(温度循环)进行扩增反应。
所谓用于核酸扩增的核酸合成反应是使用DNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶、反转录酶、链上取代型DNA聚合酶等，引物特异性地引起5’-3’DNA或RNA合成的反应。在本说明书中，核酸是包括DNA及RNA以及含有非天然型的核酸碱基的DNA及RNA的概念。作为DNA聚合酶，可以举例如Klenow片段、T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等，但不限定于这些。另外，在用依靠引物和DNA聚合酶的核酸延伸反应检测特定碱基序列的方法中，有例如前述的SNPs型技术的高温测序法(pyrosequencing method)、引物延伸法、LAMP法等。
作为检测具有扩增的特定碱基序列的方法，有例如，根据波长650nm的光的透光度，即浊度的变化检测伴随核酸的合成反应生成的焦磷酸和镁的反应物的沉淀的方法、或根据在含有插入性荧光色素的反应液中，伴随插入到扩增的核酸中，荧光强度发生变化检测的方法等。作为插入性荧光色素，可以举例如菲啶溴红(ethidium bromide)、吖啶橙、bisbentimide、二氨苯基吲哚、放线菌素、噻唑、或色霉素或它们的衍生物等。
作为对2价金属具有亲和性的高分子，可以使用例如在侧链具有可以与2价金属形成络合物的配位基的高分子。通常，作为可以与2价金属形成络合物的配位基，可以例示醇、苯酚、烯醇、羧酸、醛、酮、醌、醚、酯、酰胺、亚硝基化合物、硝基化合物、N-氧化物、磺酸、次磷酸、亚磷酸、胂酸、伯胺、仲胺、叔胺、偶氮基化合物、希夫氏碱、肟、亚氨或烯胺等。对2价金属有亲和性的高分子，也可以具有2种以上这些配位基。作为具有这些配位基的高分子，可以举例如有机或无机合成高分子或天然高分子或将这些化学修饰的高分子等。
以下，对上述本发明的3个形态分别进行更具体的说明，但本发明的范围不限定于下述说明的特定部分。
作为已知方法，若在过滤器中使用无纺布(聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)无纺布、A040C01旭化成株式会社)，观测在无纺布上核酸的捕获效率，则仅在试样含适当盐的精制DNA溶液时非常高，但若试样中有蛋白质共存，则极端地低。与此相对，若在同样的试样中添加作为2价金属化合物的氯化镁之后，通过加入氢氧化钠将试样的pH提高到12以上，则核酸对无纺布的捕获效率戏剧性地恢复。若对无纺布上捕获的核酸进行同样的研究显示，使之进行LAMP扩增反应，比较其反应时间，则通过在碱性条件下使镁化合物共存，核酸的扩增反应时间大幅缩短，成为扩增模板的核酸有效地被过滤器捕获。
本发明的方法的特征之一在于，不使用高离液盐或乙醇、苯酚、氯仿等的有机溶剂，而是通过添加所谓2价金属化合物及碱溶液的非常廉价、普通的试剂，可以简便、迅速且有效地从含有蛋白质等的试样中捕获核酸。
此外，另一个特征在于，在碱性条件下，在固形基材表面捕获到包含在添加有2价金属化合物的试样中的核酸之后，可以无需溶出核酸，就直接进行PCR等的核酸合成反应或接下来的特定核酸碱基序列的检测。即，可以在相同的过滤器上实现从核酸的提取及精制到核酸合成，或者从核酸的提取及精制到特定的核酸碱基序列的检测。根据该特征，可以显著地将从试样中提取核酸到检测的全部工序简单化，进而，由于不需要溶出操作，因此可以显著缩短处理时间。另外，通过将作为固相基材的无纺布配置为阵列状，或在相同的无纺布上呈阵列状地点上(spot)核酸，也可以简单地进行多项目检测。
作为2价金属化合物的添加量，虽然多多益善，但是在碱性条件下2价金属离子通常形成氢氧化物。例如，已知，氢氧化镁对水的溶解度非常低，为1mM以下左右。2价金属化合物的添加量应当斟酌氢氧化物的溶解度而适当地确定。例如，若镁化合物的添加量为1mM以上，则在使用过滤器作为固相基材吸取试样时，会存在因氢氧化物的堵塞而吸取阻力增大，难以在过滤器上的捕获核酸。不过，对于吸取阻力的情况，可以通过加大过滤器的孔径来对应。因此，镁化合物的添加量的上限不仅如此。另一方面，作为本发明的特征，可以举例如通过添加非常低浓度的2价金属化合物，可以达到提高核酸在过滤器上的捕获效率。这在避免因氢氧化物沉淀引起过滤器堵塞这一点上非常适宜。如作为添加镁化合物的浓度为0.01mM以上、更好的是0.1mM以上。
此外，显示对于本发明的另一特征的试样的高pH条件，添加2价金属化合物引起的核酸的捕获效率提高效果可以在pH12以上的情况下达到。如，最好在试样中添加氢氧化钠等的强碱，调制为pH14左右。对于氢氧化钠等碱的浓度，也根据捕获的过滤器等固相基材的耐碱强度而有所不同，但最好在如50mM以上、1M以下。通过将核酸捕获后的过滤器用中性条件的缓冲液清洗，可以降低过滤器表面及内部的pH，也可以向各种酶反应等提供捕获的核酸。
对于2价金属离子与核酸之间的相互作用已经进行了很多研究，但由于几乎所有的金属离子在高pH下成为氢氧化物、形成沉淀，所以没有研究在高pH条件下核酸与金属离子之间的相互作用的例子。在本发明中得到启示，通过添加镁化合物，在碱凝胶电泳中，泳动度越降低，核酸的大小、形态就越发生变化。在高pH条件下由于核酸以镁离子为介质缔合，所以外观上的分子量增大起来，在将过滤器等的固相基材作为过滤材料使用时，核酸的捕获效率提高。在pH11以下不能实质性地观察到上述效果。对于核酸与镁之间的相互作用，已知通常结合于双链核酸的磷酸基上，但在高pH条件下在不至于形成氢氧化物沉淀的浓度中，尚没有关于镁离子促使核酸之间缔合的现象的报告。此外，也尚没有在过滤器等的固相基材上捕获如此缔合的核酸的例子。
此外，对于在高pH条件下凭借2价金属离子形成的核酸的缔合体，已知由于加入EDTA从而妨碍了缔合。缔合的形成很容易被EDTA等螯合剂的添加所阻碍，或缔合体被破坏，捕获效率降低。根据试样，在生物体来源的成分中有可能含有各种有机酸类等的、对金属离子具有螯合性能的成分。对该问题，可以通过在高pH下过量添加对氢氧化物的溶解度高的金属化合物来避免。作为在高pH下对氢氧化物的溶解度高的金属，可以举例如碱性金属或碱性土类金属。如，对含有0.1mM的镁化合物的试样中添加1mM的EDTA之后，若添加10mM的锶化合物，则可以从pH调整为12以上的试样中有效地捕获核酸。
再有，作为本发明的方法的特征之一，可以举列如凭借2价金属离子形成的核酸的缔合体，其形成由于添加对2价金属离子具有亲合性的高分子而有所促进。发现，如在含有血清等的高浓度的蛋白质(7％左右)的试样中，2价金属离子与核酸的缔合体的形成效率降低，核酸对固相基材的捕获率降低。启示若在该试样中添加对2价金属离子有亲合性的高分子，则2价金属离子与核酸的缔合体的形成效率上升，核酸在固相基材的捕获率提高。
通常，在细胞提取液中除核酸之外还含有生物体试样来源的蛋白质。通过在试样中添加蛋白酶K(终浓度0.1mg/ml)，也可以去除蛋白质，但由于试样的处理工序增加，所以一般来讲并不理想。在本发明的方法中，由于在蛋白质共存下可以在固相基材上有效捕获核酸，所以通常不需要在核酸捕获之前用蛋白酶k处理试样的工序。可是，也存在这样一种情况含有高浓度的蛋白质的试样，如血液等的清况下，若使用PET无纺布构成的过滤器作为固相基材，则引起堵塞的可能性很高，所以为更安全地吸取，最好添加蛋白酶k。在本发明中，由于以2价金属离子为介质形成核酸的缔合体，该缔合体的尺寸增大，因此也可以加大用于核酸捕获的过滤器的孔径。因此，也可以用孔径更大的过滤器减小堵塞。
另外，本发明的方法的其他特征在于，使核酸从细胞游离，以溶液状态接触固相基材表面，所以可以应用于任何种类的细胞，是实用性很高的方法。如上所述，作为细胞，可以用于捕获人白细胞之类的真核细胞、大肠菌之类的原核细胞、或病毒等的核酸。在将细胞捕获到直接过滤器等的固相基材并溶解的方法中，需要根据细胞的种类优化过滤器的特性或吸附条件。另外，由于必须在不破坏细胞的情况下结合于过滤器上，所以过滤的流速有限，通常需要缓慢通过过滤器。在本发明的方法中将过滤器作为固相基材使用时，由于使细胞提取液等的试样以溶液状态通过过滤器，所以可以加快流速。
此外，在本发明的方法中，将由无纺布构成的过滤器作为固相基材使用时，在碱性条件下以2价金属离子为介质形成的核酸的缔合体，仅仅使试样溶液通过过滤器就很容易地在过滤器上捕获到。只要是在过滤器的缔合体保持能力的范围内，试样中所含的细胞数量或试样容量就无限制。另一方面，使如FTATM那样的细胞溶液渗进基材后溶解细胞的方法中，由于基材可吸收的试样容量为处理量的上限，因此对从大容量试样中提取核酸的目的不太合适。如，自细胞浓度低的大容量的试样中，欲回收试样中所含的全细胞的核酸的情况，需要用离心等其他手段预先浓缩细胞。在本发明的方法中使用过滤器作为固相基材时，没有这样的对试样容量的限制。另外，由于无纺布可以处理单位面积上的大量细胞或大容量试样，因此可以容易地增加每单位面积的核酸固定量(核酸密度)。因此，由无纺布构成的过滤器最能适用于本发明的方法。若核酸在过滤器上的固定量多，则检测也变得容易，所以在例如利用核酸扩增反应的感染症诊断这样要求高灵敏度的情况下，或者核酸扩增不理想的检查中，比较容易得到试样，且在用过滤器处理大量试样时等，本发明的方法特别有用。
另外，只要试样中的核酸不分解，就可以使用以任意手段保存的试样进行本发明的方法。如，作为含细胞的试样，既可以使用刚摄取或调制后不久的试样，也可以用冷冻保存的试样。血液的情况，无论使用新鲜血还是冷冻保存的血，都可以捕获及检测核酸。
根据本发明的其他的形态，对于由无纺布构成的过滤器，用低浓度(0.1mM左右)氯化镁的1N氢氧化钠溶液事先在无纺布通过之后，若将用氢氧化钠处理的、含蛋白质的核酸试样在该无纺布上通过，则核酸对于无纺布的捕获率戏剧性地回复。另一方面，即使用相同浓度的氯化镁水溶液事先在无纺布通过，核酸的捕获率也不恢复。即，这表示若使镁吸附到无纺布上，需要碱性条件。
通常，PET无纺布在高pH条件下易被水解，在水解后的PET表面上羧基、氢氧基等的存在比例增加。2价金属离子被推定为在PET无纺布上配位于具有如此螯合性能的官能团并固定于无纺布上的，因此在本发明中，在固相上固定的2价金属离子担当着捕获试样液相中的核酸的主要作用。如，用0.125N的氢氧化钠溶液水解由无纺布构成的过滤器之后，若使调制为pH12以上的、含有蛋白质的核酸试样通过浸渍于镁、锌、锰等的2价金属化合物水溶液中、在过滤器上固定这些2价金属离子的无纺布，则核酸在无纺布的捕获率戏剧性地提高。还有在其他的形态中，即使在无纺布上涂布含有大量具有螯合性能的羧基的聚-L-谷氨酸，使含有2价金属离子的水溶液通过，也可以制作将2价金属离子固定化的过滤器。此外，通过调制将该过滤器层叠2张至4张的多层化过滤器，固定于固相基材上的2价金属离子的量增大，可以成比例地提高核酸的捕获效率。
另一方面，即使采用将2价金属离子固定化的无纺布，在蛋白质共存下，对于未进行碱性处理的试样，不能在无纺布上有效捕获核酸。这表示，固定于固相基材上的2价金属离子欲与液相中的核酸结合，则需要核酸在碱性条件下变性。从这些事情显示，2价金属离子和核酸在高pH条件下结合力非常高。
在本发明的方法中，其特征在于，使调高pH、碱性变性的核酸接触将2价金属离子固定化的无纺布等的固相基材，通过该手段，即使在含有蛋白质的试样中也可以实现非常高的捕获效率。再有，显示若将在碱性条件下变性的核酸在无纺布上通过，对在无纺布捕获的核酸进行LAMP扩增反应，则将2价金属离子固定化的无纺布与未固定化的无纺布相比，核酸的扩增反应时间大幅缩短，成为扩增模板的核酸则有效地被无纺布捕获。此外，捕获核酸后，通过用中性条件的缓冲液清洗过滤器，可以下调过滤器附近的pH，向各种酶反应提供捕获的核酸。
此外，作为以无纺布为代表的固相基材，将过滤器类浸渍于核酸的扩增反应溶液中进行扩增反应时，存在如下情况通过核酸的扩增酶等吸附到过滤器上，反应效率以一定的比例降低。在捕获核酸的过滤器上事先涂布酶吸附抑制剂，可以抑制因核酸扩增酶等吸附到过滤器上而生成的反应效率的降低。作为酶吸附抑制剂可以举例如牛血清白蛋白等。
实施例以下，根据实施例进一步具体说明本发明。只是，这些实施例仅用于说明，而非限制本发明的技术的范围。
例1无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间的比较(镁吸附条件)剪下直径5mm的圆盘状的无纺布，切断2个yellow tip(QSP Pipet tip yellow 1～200μL)，在其中夹入无纺布，制作在前端将无纺布固定化的柱。作为无纺布，使用旭化成株式会社的产品A040C01(以下称“无纺布固定化柱”)。柱的结构示于图1。试样为20pg淋菌来源精制基因组DNA(ATCC700825)，溶解于1mL生理盐水或0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理盐水溶液中。碱性处理为，在该试样中添加150μl 8N NaOH，最终浓度为1N。在无纺布固定化柱上连接10ml的泰尔茂注射器，将各试样全部吸取。对于图2中，(3)及(4)的实验，在吸取试样之前分别将0.1mM氯化镁(WAKO)的1N NaOH溶液或水溶液各1ml通过无纺布固定化柱。吸取试样之后，再吸取1mlTBS缓冲液(10mlTris-HClpH8.0、150mMNaCl)进行清洗。
LAMP反应进行如下所谓用于LAMP反应的内侧引物表示FIP引物和BIP引物。FIP引物是在5’侧具有与目的核酸序列的外链相同的、称为F1c的序列及在3’侧具有与目的核酸序列的内链互补的、称为F2的序列的寡核苷酸，BIP引物是在5’侧具有与目的核酸序列的内链相同的、称为B1c的序列，及在3’侧具有与目的核酸序列的外链互补的、称为B2的序列的寡核苷酸。所谓外侧引物是表示F3引物和B3引物，F3引物是与目的核酸序列的内链互补的寡核苷酸，B3引物是与目的核酸的外链互补的寡核苷酸。环状引物表示FL引物和BL引物，促进根据LAMP反应的核酸的扩增反应。FL引物是具有，与F2c序列和F1c序列之间的序列互补的序列的寡核苷酸，其中，F2c序列是与F2序列互补的序列，BL引物是具有，与B2c序列与B1c序列之间的序列互补的序列的寡核苷酸，其中，B2c序列是与B2序列互补。这些内侧引物、外侧引物及环状引物的设计方法，公开于Web网站http//www.eiken.co.ip/中。作为扩增核酸的LAMP反应的目的序列，选择淋菌的ORF1(Genebankaccession No.S86113)基因，设计LAMP反应的扩增寡核苷酸引物。设计序列编号1的FIP引物、序列编号2的BIP引物、序列编号3的F3引物、序列编号4的B3引物，序列编号5的F环状引物、序列编号6的B环状引物，委托日本bioservice公司进行化学合成。
在LAMP扩增的反应液中，各含有F3引物和B3引物2.5μM、FIP引物和BIP引物各20μM、FL引物和BL引物各30μM、1.4mM dNTPs、0.8M三甲铵基乙内盐、20mMtris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％吐温20、6.4单元的Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，加入Mg SO4至浓度为8mM。将清洗之后的无纺布固定化柱设置为使无纺布部分在放入50μl上述LAMP扩增反应液的Loopamp反应试管(荣研化学)中，无纺布部分浸渍于反应液中。将无纺布固定化柱与放入有LAMP反应液的Loopamp反应试管在离心机(puchi-Hachi，トミ一工业)中轻轻离心处理5秒之后，设置LoopAmp终点浊度计LA-200(TERAMECKS)，使在64℃反应1小时，同时测定浊度变化。在LAMP扩增反应中，以伴随焦磷酸镁的生成而产生的浊度(在650nm处的吸光度)成为0.1为止的时间为纵轴进行比较。
结果示于表2。由该表可知，在含有BSA的样品中，在无纺布上的核酸的扩增时间延迟，即核酸的捕获率很低。另一方面显示，若事先吸取氯化镁的NaOH溶液，则扩增时间与不含BSA的样品一样缩短，核酸的捕获率很高。但是未在氯化镁水溶液中见到该效果。在图2中，(1)至(4)表示吸取到无纺布的试样，每个试样进行N＝3次吸取及测定的结果。
(1)淋菌精制基因组DNA20pg/生理盐水/1N NaOH(2)淋菌精制基因组DNA20pg+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH(3)吸取0.1mM MgCl2/1N NaOH之后，淋菌精制基因组DNA20pg+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH(4)吸取0.1mM MgCl2/生理盐水之后，淋菌精制基因组DNA+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH例2核酸在镁吸附无纺布上的捕获效率室温条件下，将无纺布(A040C01)在0.1％聚-L-谷氨酸(SIGMA，以下称PLG)的水溶液中浸渍一晚，之后使之干燥进行涂布。将20ng/μl Cy3荧光标记(Mirus)的λDNA(TAKARA)溶解于1ml0.3％BSA生理盐水溶液中。碱性处理为，在该试样中添加75μl8N NaOH，最终成为0.5N NaOH溶液中。DNA的标记化，按照Mirus Label IT Cy3 LabelingKit所附协议进行。在固定无纺布的柱上连接10ml的泰尔茂注射器，将各试样全部吸取。每个样品各进行2次实验。图3中，对于(2)，在涂布有0.1％PLG的无纺布吸取试样之前预先吸取好1ml 100mM MgCl2水溶液。吸取全部样品后，分解柱，取出无纺布，从荧光测定用载玻片(MATSUNAMI)的内侧使用隐形胶带粘贴。将粘贴有无纺布的载玻片设置在微阵列扫描仪(GSI LUMONICS ScanArrayLite)上，进行荧光影像及荧光强度的测定。
结果示于图3。从图中可知使含BSA的试样直接通过无纺布的，几乎未观测到在无纺布上的核酸捕获，受共存的蛋白质的影响，DNA对无纺布上的捕获效率显著降低。另一方面，关于在涂布PLG的无纺布上吸附有镁的不织布，即便在含有BSA的样品中，核酸也能有效地被无纺布捕获到。图3中的数字表示荧光强度，(1)及(2)表示无纺布的种类，每种点样2次(N＝2)。
例3无纺布上DNA的LAMP扩增反应时间的比较(聚合物涂层无纺布和多层化过滤器的效果)作为试样，采用将20pg淋菌来源的精制基因组DNA(ATCC700825)溶解于1ml生理盐水或0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理盐水溶液的试样。在无纺布涂布PLG聚合物同例2。将涂布PLG的无纺布层叠2张或4张，如例1的图1那样夹入yellow-tip中，制作了多层化过滤器。对于正控制以外的试样，如同例2，在吸取试样之前事先吸取好1ml100mM MgCl2水溶液。无纺布固定化柱上连接10ml的泰尔茂注射器，将各试样全部吸取。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应的浊度测定全部同例1。
结果示于图4。纵轴为在LAMP扩增反应中伴随焦磷酸镁生成的浊度(650nm处的吸光度)成为0.1为止的时间。在接触镁溶液的无纺布之中，涂布PLG的无纺布的核酸捕获效率增高，启示羧基对镁的吸附有用。此外，已表明通过将过滤器多层化，核酸的捕获率增高。图4中的数字表示荧光强度，对(1)至(5)每个进行N＝3次的吸取及测定。
(1)无纺布(1张.未处理)、淋菌精制基因组DNA20pg/生理盐水/1N NaOH[正控制](2)无纺布(1张.未处理)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因组DNA20pg+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH(3)无纺布(1张.涂布0.1％聚-L-谷氨酸)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因组DNA20pg+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH(4)无纺布(2张.涂布0.1％聚-L-谷氨酸)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因组DNA20pg+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH(5)无纺布(4张.涂布0.1％聚-L-谷氨酸)、吸取100mM MgCl2水溶液后，淋菌精制基因组DNA20pg+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH例4镁吸附无纺布上的核酸扩增效率(试样有无碱性处理的影响)试样为，20pg淋菌来源精制DNA(ATCC700825)溶解于1mL0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理盐水溶液中。碱性处理时，在该试样中添加150μ18N NaOH，使最终浓度为1N。对于同例2一样涂布PLG的无纺布，在吸取试样之前预先吸取好100mM MgCl2水溶液。在无纺布固定化柱上连接10ml的泰尔茂注射器，将各试样全部吸取。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应的浊度测定全部同例1。
结果示于图5。纵轴为在LAMP扩增反应中伴随焦磷酸镁生成的浊度(650nm处的吸光度)成为0.1为止的时间。显示，在吸附镁的PLG涂布无纺布上，欲从含有蛋白质的试样中捕获核酸需要将试样进行碱性处理。图5中，左侧白色柱表示生理盐水，右侧着色柱表示1N NaOH的结果。每个条件进行N＝3次的吸取及测定。
例5在含有蛋白质试样中的无纺布的核酸捕获效率剪下直径5mm的圆盘状无纺布，切断2个yellow tip(QSP Pipet tip yellow 1.200μl)，在其中夹入无纺布，制作在前端将无纺布固定的柱。作为无纺布，使用旭化成株式会社的产品A040C01(以下称“无纺布固定化柱”)。柱的结构示于图1。将4μl(40ng)10ng/μl Cy3荧光标记(Mirus)的λDNA(TAKARA)溶解于1ml生理盐水或0.3％BSA生理盐水溶液中。负控制时添加4μl纯水。DNA的标记化，按照Mirus Label IT Cy3 Labeling Kit所附协议进行。将无纺布固定化的柱上连接10ml的泰尔茂注射器，将各试样全部吸取。每份样品各进行2次实验。吸取后，将柱分解，取出无纺布，从荧光测定用载玻片(MATSUNAMI)的内侧使用隐形胶带粘贴。粘贴无纺布的载玻片设置在微阵列扫描仪上(GSI LUMONICSScanArrayLite)，进行荧光影像及荧光强度的测定。
结果示于图6。由该图可知，在含有0.3％的牛血清白蛋白((SIGMA-A2153)以下称BSA)的试样中，与不含的试样相比，荧光强度明显降低。即DNA对无纺布上的捕获效率由于共存的蛋白质的影响而显著降低。图中显示(1)λDNA+0.3％BSA/生理盐水(2)生理盐水[负控制](3)λDNA/生理盐水[正控制]。
例6镁/NaOH处理试样中无纺布的核酸捕获效率将4μl在例1中使用的10ng/μl Cy3荧光标记的λDNA溶解于1ml生理盐水或0.3％BSA生理盐水溶液中。添加镁时，对1ml该试样添加1μl的100mM氯化镁(WAKO)，使最终浓度为0.1mM。之后，该试样中添加75μl 8N NaOH，使之最终成为0.5N NaOH溶液。与例1一样，在无纺布固定化柱上吸取各试样，在载玻片上粘贴无纺布之后，与例1一样测定荧光影像。各试样进行2次实验。
结果示于图7。即使在NaOH处理过的溶液中，含有0.3％BSA的试样中DNA在无纺布上的捕获效率也降低。但是即使在含有BSA的试样中，在添加0.1mM的氯化镁的试样中也观测到与不含有BSA的试样同样的捕获率。图中显示(1)λDNA+0.3％BSA+0.1mM MgCl2/生理盐水/0.5N NaOH(2)λDNA+0.3％BSA/生理盐水/0.5N NaOH(3)生理盐水/0.5N NaOH[负控制]
(4)λDNA/生理盐水/0.5N NaOH[正控制]。
例7镁/NaOH处理试样中无纺布捕获核酸的扩增效率将20pg淋菌来源的精制DNA(ATCC700825)溶解于1mL生理盐水或0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理盐水溶液中。添加镁时，对1ml该试样添加1μl的100mM氯化镁，使最终浓度为0.1mM。碱处理为，该试样中添加150μl 8N NaOH，使最终浓度成为1N。将这些含有DNA的试样全部用无纺布固定化柱吸取，进而吸取1mlTBS缓冲液(10mM、Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl)进行清洗。
LAMP反应进行如下所谓用于LAMP反应的内侧引物是表示FIP引物和BIP引物。FIP引物是在5’侧具有与目的核酸序列的外链相同的、称为F1c的序列、及在3’侧具有与目的核酸序列的内链互补的、称为F2的序列的寡核苷酸，BIP引物是在5’侧具有与目的核酸序列的内链相同的、称为B1c的序列、及在3’侧具有与目的核酸序列的外链互补的、称为B2的序列寡核苷酸。所谓外侧引物表示F3引物和B3引物，F3引物是与目的核酸序列的内链互补的寡核苷酸，B3引物是与目的核酸的外链互补的寡核苷酸。环状引物表示FL引物和BL引物，促进由LAMP反应引起的核酸扩增反应。FL引物是具有，与F2c序列和F1c序列之间的序列互补的序列的寡核苷酸，其中，F2c序列与F2序列互补，BL引物是具有，与B2c序列与B1c序列之间的序列互补的序列的寡核苷酸，其中，B2c序列与B2序列互补。这些内侧引物、外侧引物及环状引物的设计方法，公开于Web网站http//www.eiken.co.jp/中。作为扩增核酸的LAMP反应的目的序列，选择淋菌的ORF1(Genebankaccession No.S86113)基因，设计LAMP反应的扩增寡核苷酸引物。设计序列编号1的FIP引物、序列编号2的BIP引物、序列编号3的F3引物、序列编号4的B3引物，序列编号5的Floop引物、序列编号6的Bloop引物，委托日本bioservice公司进行化学合成。
在LAMP扩增的反应液中含有F3引物和B3引物各2.5μM、FIP引物和BIP引物各20μM、FL引物和BL引物各30μM、1.4mM dNTPs、0.8M三甲铵基乙内盐、20mMtris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween 20、6.4单元的Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，加入MgSO4至浓度为8mM。将清洗之后的无纺布固定化柱设置为在放入50μl上述LAMP扩增反应液的Loopamp反应试管(荣研化学)中，使无纺布部分浸于反应液中。将无纺布固定化柱与放入有LAMP反应液的Loopamp反应试管在离心机(puchi-Hachi，トミ一工业)中轻轻离心处理5秒之后，设置LoopAmp终点浊度计LA-200(テラメツケス)，64℃反应1小时，测定浊度变化。在LAMP扩增反应中，以伴随焦磷酸镁的生成的浊度(在650nm处的吸光度)成为0.1为止的时间为纵轴进行比较。
结果示于图8。由该图可知，含BSA的试样中无纺布上的核酸扩增时间缓慢，即核酸的捕获率低，但是添加镁的体系中，扩增时间与不含BSA的试样一样短，核酸的捕获效率很高。图中，显示每个试样进行N＝3次吸取及测定的结果，显示(1)淋菌精制基因组DNA/生理盐水/1N NaOH(2)淋菌精制基因组DNA+0.3％BSA/生理盐水/1N NaOH(3)淋菌精制基因组DNA+0.3％BSA+0.1mM MgCl2/生理盐水/1N NaOH。
例8在无纺布上捕获核酸的扩增效率中镁浓度的影响20pg淋菌来源精制DNA(ATCC700825)溶解于1mL0.3％BSA(SIGMA-A2153)生理盐水溶液中。该试样中添加10μl(最终浓度约10mM)、5μl(同5mM)1M MgCl2、和10μl(同1mM)、5μl(同0.5mM)、1μl(同0.1mM)100mM MgCl2、。碱性处理为，在该试样中添加150μl 8N NaOH，使最终浓度为1N。将这些含有DNA的试样全部用无纺布固定化柱吸取，进而吸取1mlTBS缓冲液(10mM、Tris-HClpH8.0、150mM NaCl)进行清洗。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应的浊度测定同例7。结果示于图9。该图显示，添加浓度1mM为止的镁，即使在BSA共存下也可以得到很高的核酸捕获率。
例9在无纺布上捕获核酸的扩增效率中pH的影响20pg淋菌来源的精制DNA(ATCC700825)溶解于500μl 0.6％BSA生理盐水溶液中。然后，各添加1M的缓冲液(Tris-HClpH7.0、8.0、9.0、碳酸缓冲液pH10.0、11.0)或1N NaOH，作为1ml试样。将这些含有DNA的试样，全部用无纺布固定化柱吸取，进而吸取1mlTBS缓冲液(10mM、Tris-HClpH8.0、150mMNaCl)进行清洗。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应的浊度测定同例7。结果示于图10。图中的结果显示每个试样进行N＝3次吸取及测定的结果。纵轴为在LAMP扩增反应中以伴随焦磷酸镁的生成的浊度(在650nm处的吸光度)成为0.1为止的时间。在pH14左右，即强碱处理的试样中清楚地显示出镁的添加效果。
例10在碱性凝胶电泳中的镁添加效果将琼脂糖(GibcoBRL Ultra Pure)溶解于0.05N NaOH中，调制0.5％琼脂糖凝胶。在3μl(300ng)100ng/μlλDNA中添加BSA时，加入3μlBSA，添加MgCl2时添加1μl10mMMgCl2，最后对全部的试样加入1μl 0.5N NaOH，分别用纯水补足体积至10μl。每10μl试样加入2μl的4×上样缓冲液(52％蔗糖、0.1％溴甲酚绿、0.168％二甲苯苯胺、200mM NaOH)，将样品的全部量都加载于各样品的上样列中。作为电泳缓冲液，将凝胶浸渍于0.05N NaOH中进行50V、3小时电泳之后，浸渍于中和缓冲液(1M、Tris-HClpH8.0、1.5M NaCl)30分钟，进行中和。用溶解于中和缓冲液的菲啶溴红进行30分染色，用Bioimage GelPrint2000i/VGA摄影。结果在图11显示。在核酸与镁离子共存的试样中，除了加EDTA时之外，泳动度显著降低。由此启示在碱性条件下，由于核酸与镁共存，产生核酸的缔合，核酸的外观尺寸增大、及在EDTA的存在下不产生缔合。
例11在碱性凝胶电泳中镁添加浓度的影响使用的琼脂糖凝胶及电泳缓冲液同例10。加入3μl 100ng/μl(300ng)λDNA、分别加入1、2、3、4、5μl 1mM MgCl2水溶液，分别用纯水补足体积至10μl。每10μl试样中加入2μl的4×上样缓冲液(52％蔗糖、0.1％溴甲酚绿、0.168％二甲苯苯胺、200mM NaOH)，将样品的全部量都加载于各样品的上样列中。作为电泳缓冲液，将凝胶浸渍于0.05N NaOH中进行50V、3小时电泳之后，浸渍于中和缓冲液(1M、Tris-HClpH8.0、1.5M NaCl)30分进行中和。用溶解于中和缓冲液的菲啶溴红进行30分染色，用Bioimage Gel Print2000i/VGA摄影。结果示于图12。图中显示随着共存的镁离子浓度的上升，具有能够泳动的大小尺寸的核酸减少，泳动度低的、大的核酸成分增大。
例12在pH8条件下的凝胶泳动中的镁添加效果将琼脂糖(GibcoBRL Ultra Pure)溶解于40mM Tris-醋酸缓冲液中，配制0.5％琼脂糖凝胶。在3μl 100ng/μl λDNA(300ng)中，添加BSA时加入3μlBSA，添加MgCl2时添加1μl10mM MgCl2，分别用纯水补足体积至10μl。每10μl试样加入2μl的4×上样缓冲液(52％蔗糖、0.1％溴甲酚绿、0.168％二甲苯苯胺、200mM NaOH)，将样品的全部量都加载于各样品的上样列中。将凝胶浸渍于40mM Tris-醋酸缓冲液中进行50V、30分电泳之后，用菲啶溴红进行染色，用Bioimage Gel Print2000i/VGA摄影。结果示于图13。在中性条件下没有观察到由于核酸与镁离子的相互作用而引起的泳动度降低，显示这是在碱性条件下特有的现象。
例13在无纺布上捕获核酸的扩增效率中各种2价金属离子固定化无纺布的比较将剪成3×3cm片状的无纺布浸渍于0.25N NaOH与乙腈1∶1的混合液构成的5ml水解处理液中，60℃振摇培养1小时。之后，浸渍于纯水中，重复2次振摇清洗10分钟。在10mM的2价金属氯化物(氯化锌、氯化镁、氯化锰)的水溶液中浸渍水解处理的无纺布，室温中放置一晚之后，浸渍于纯水中，重复2次振摇清洗10分钟，之后在室温中使之干燥一晚，制作将各种2价金属离子固定化的无纺布。试样为，将20pg BCG来源的精制DNA溶解于1mL生理盐水或0.3％人血清白蛋白(以下称HAS)(SIGMA)生理盐水溶液中。在该样品中添加30μl 8N NaOH，使最终浓度为0.2N。将这些含有DNA的试样用各种无纺布全部吸取之后，吸取1mlTBS缓冲液进行清洗。关于清洗后的无纺布固定化柱的LAMP扩增，除引物设置(primer set)之外，LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应同例7。对于引物设置，作为扩增核酸的LAMP扩增反应的目的序列，选择结核菌群的16S Ribosomal RNA基因的序列(genebank accession No.NC_000962、X58890、X55588、AF480605)基因，设计LAMP反应的扩增寡核苷酸引物。设计序列编号7的FIP引物、序列编号8的BIP引物、序列编号9的F3引物、序列编号1的B3引物、序列编号11的Floop引物、序列编号12的Bloop引物，委托日本bioservice进行化学合成。
结果示于图14。该图显示除镁固定化的无纺布以外，在锰固定化的无纺布上，含蛋白质试样中的核酸的捕获率也很高。图中(1)至(5)表示在使用的无纺布上固定化的金属离子种类、吸取的样品的顺序，对各试样进行N＝3次吸取及测定的结果。显示，(1)未固定化、淋菌精制基因组DNA 20pg/生理盐水/0.2N NaOH[试样-1](2)未固定化、淋菌精制基因组DNA 20pg+0.3％HSA/生理盐水/0.2N NaOH[试样-2](3)锌、试样-2(4)镁、试样-2(5)锰、试样-2。
例14在无纺布上捕获的核酸的PCR扩增反应试样为，将200pgBCG菌来源的精制基因组DNA溶解于1mL生理盐水或0.3％HSA(SIGMA)生理盐水溶液中。在该样品中添加30μl 8N NaOH，使最终浓度为0.2N。将这些含有DNA的试样用各种无纺布全部吸取之后，吸取1mlTBS缓冲液进行清洗。镁固定化的无纺布的制作方法同例13。关于PCR的引物，选择结核菌群的16S Ribosomal RNA基因的序列，将扩增产物的尺寸设计为1kbp的序列编号13、14，委托日本bioservice化学合成。将清洗后的无纺布固定化柱浸渍于由0.2mM dNTPs、上述引物各0.5μM、3％吐温20及EX Taq Hot Start Version(TAKARA)试剂盒附带的缓冲液、EX Taq聚合酶1.25单位构成的50μl的PCR反应液中。在DNA热循环仪(珀金埃尔默Perkin Elmer)中，使其在95℃反应5分，循环1次；95℃20秒、55℃20秒、72℃20秒，循环30次；72℃7分。各个PCR反应结束之后，在各反应液9μl中加入1μl 10×上样缓冲液，混合，将全部的量加载在1％琼脂糖中进行电泳。进行100V、30分电泳之后，用菲啶溴红进行30分染色，用BioimageGel Print2000i/VGA摄影。
结果示于图15。虽然在吸取了含有HAS的试样的无纺布中，可以在镁固定化的不织布中确认PCR的扩增产物的光带，但是在未将镁固定化的无纺布中未能确认扩增产物，启示在成为模板的试样中的核酸未被无纺布捕获。由此可知，通过镁固定化的无纺布可以捕获含蛋白质试样中的核酸，且被该无纺布捕获的核酸也能够适用于PCR的扩增反应。
例15EDTA及2价金属离子共存试样中无纺布上捕获核酸的扩增效率试样为，将20pg BCG菌来源的精制基因组DNA溶解于1mL生理盐水或0.3％HSA(SIGMA)生理盐水溶液中。需要加入EDTA时，在该样品中添加1mM EDTA，需要加入氯化锶时添加10mM氯化锶、需要加入氯化镁时添加0.1mM氯化镁，在各样品中分别添加30μl 8N NaOH，使最终浓度为0.2N。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应同例13。
结果示于图1。该图显示，由EDTA引起的对镁与核酸的缔合体形成的阻碍被锶的添加所抑制，即使在如EDTA那样的螯合剂成分的存在下，也可以捕获含蛋白质的试样中的核酸。图中(1)至(5)表示吸取到无纺布上的试样，纵轴表示浊度成为0.1为止的经过时间。
各试样每个进行N＝3次吸取、测定。
(1)BCG菌精制基因组DNA20pg/生理盐水/1N NaOH[正控制、试样-1](2)BCG菌精制基因组DNA20pg+0.3％HSA/生理盐水/0.2N NaOH[试样-2](3)试样-2+0.1mM MgCl2(4)试样-2+1mM EDTA+0.1mM MgCl2(5)试样-2+1mM EDTA+10mM SrCl2+0.1mM MgCl2。
例16尿试样中无纺布上捕获核酸的扩增效率将淋菌(ATCC700825)在巧克力琼脂培养基上培养2天，将回收的菌的悬浊液用生理盐水稀释为100万倍。在500μl生理盐水或健康人的尿中分别添加10μl稀释的菌液。在该样品中添加75μl 8N NaOH，使最终浓度为1N。与例2同样，准备未处理的无纺布及使镁通过的涂布有PLG的镁固定化无纺布2种，将该试样全部吸取到各自的无纺布之后，吸取1mlTBS缓冲液清洗。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应同例7。
结果示于图17。该图显示，与未处理的无纺布柱相比，在涂布PLG的无纺布上固定镁的柱，其在无纺布上捕获核酸的扩增时间明显地缩短，尿试样中的核酸的捕获效率高。
例17在使用了含BSA清洗液的无纺布上捕获核酸的扩增效率试样为，将20pgBCG菌来源的精制基因组DNA溶解于1mL 0.3％HSA(SIGMA)生理盐水溶液中。在该样品中添加30μl 8NNaOH，使最终浓度为0.2N。同例13制作镁固定化的无纺布，吸取全部上述试样之后，吸取1ml0％、0.3％、1％的BSA的TBS缓冲液清洗。对清洗后的无纺布固定化柱，同例13进行LAMP扩增反应。
结果示于图18。清洗液中越含BSA，LAMP扩增反应时间就越缩短，从中启示通过用BSA涂布捕获了核酸的无纺布，核酸的扩增反应加快。
例20在添加了金属离子亲和性高分子的试样中无纺布上的核酸扩增效率试样为，将100pg淋菌来源的精制基因组DNA溶解于250μl生理盐水或7％HSA(SIGMA)生理盐水溶液中。需要添加氯化镁时，在该样品中添加0.5mM氯化镁。在该样品中添加金属离子亲和性高分子时，在该样品中添加50μl分子量8000的聚乙二醇(以下PEG)(SIGMA)20％水溶液。该各样品中添加7.5μl 8N NaOH，使最终浓度为0.2N。在无纺布固定化柱吸取上述试样的全部之后，用1ml TBS缓冲液清洗。LAMP扩增反应液的调制及无纺布固定化柱的扩增反应同例7。
结果示于图19。在7％的高浓度蛋白质中，只添加镁，核酸的捕获率并不高，LAMP扩增反应时间长。通过使镁与金属离子亲和性高分子共存，LAMP扩增反应时间缩短，核酸的捕获率增高。由此可知，金属离子亲和性高分子促进镁离子与核酸之间缔合体形成作用。
图中(1)至(4)表示吸取的试样，对各试样各进行N＝3次吸取、测定。
(1)淋菌精制基因组DNA/生理盐水/0.2N NaOH[正控制、试样-1](2)淋菌精制基因组DNA+7％HSA/生理盐水/0.2N NaOH[试样-2](3)试样-2+0.5mM MgCl2(4)试样-2+3.3％PEG(8K)+0.5mM MgCl2产业上的利用可能性根据本发明，可以从含有核酸的试样中比已有的方法更简便且高收率地捕获、回收核酸。另外，本发明的方法，可作为能够用于已有的核酸扩增技术、迅速且简便的核酸调制法加以利用。
序列表<110>Asahi Kasei Kabushiki Kaisha<120>Method for trapping nucleic acid<130>A51436M<160>14<210>1<211>40<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>1cgcccaaaca gtttcacaac ctattttcag gatgtggcgg40<210>2<211>38<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>2cgatttctcc cattgggctc cttctacgat gacatcgc38<210>3<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>3cttaattctt ctagtaacaa acc23<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>4gggaatagtt ggatcattcg g21<210>5<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>5ccagcttgat gaaagccc18<210>6<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>6ggcttgcgaa agtttccg18<210>7<211>39<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>7
cacccacgtg ttactcatgc aagtcgaacg gaaaggtct39<210>8<211>36<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>8tcgggataag cctggaccac aagacatgca tcccgt 36<210>9<211>17<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>9ctggctcagg acgaacg17<210>10<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>10gctcatccca caccgc 16<210>11<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>11gttcgccact cgagtatctc cg 22<210>12<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>12gaaactgggt ctaataccgg 20<210>13<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>13ccatgctctt gatgccccgt tg 22<210>14<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>14tttagccttg cggccgtact cc 2权利要求
1.一种将试样中的核酸捕获到固相基材表面上的方法，其包括将该试样调整到pH12以上的工序和下述某一项工序使固定化在固相基材表面上的至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合，捕获核酸的工序，或使至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合之后，使该核酸接触固相基材表面而捕获的工序。
2.一种检测试样中的核酸的方法，其包括将试样调整到pH12以上的工序和下述某一项工序将该试样调整到pH12以上的工序和下述某一项工序使固定化在固相基材表面上的至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合，捕获核酸的工序，或使至少1种2价金属离子与该试样中的核酸结合之后，使该核酸接触固相基材表面而捕获的工序；而且还包括以该被捕获的核酸为模板使特定碱基序列的核酸扩增，并对其进行检测的工序。
3.如权利要求1或2所述的方法，其所述至少1种2价金属离子为镁离子。
4.在pH12以上与至少1种2价金属离子结合，在固相基材表面捕获到的核酸。
5.如权利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加至少一种2价金属化合物的工序；(b)将工序(a)中得到的试样的pH调整为12以上，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子的缔合体的工序；及(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序。
6.如权利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加至少一种2价金属化合物，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序。
7.如权利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加至少一种2价金属化合物的工序；(b)将工序(a)中得到的试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序；(d)使含有适宜于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
8.如权利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加至少一种2价金属化合物，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序；(d)使含有适宜于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
9.如权利要求5至8中任一项所述的方法，其通过过滤，在固相基材表面捕获所述缔合体。
10.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其所述固相基材为过滤器。
11.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其所述固相基材为由无纺布形成的过滤器。
12.如权利要求5至11中任一项所述的方法，其所述至少1种2价金属为镁。
13.如权利要求12所述的方法，其包括在含有核酸的试样中添加pH12以上、溶解度为0.2mM以上的金属离子的工序。
14.一种试剂套装，用于捕获试样中的核酸，或用于捕获及检测试样中的核酸，其包括选自以下各要素所构成的组中的至少2个要素用于从所述试样中提取核酸的试剂；用于使所述试样成为pH12以上的试剂；至少一种2价金属化合物；固相基材；及可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶。
15.在pH12以上通过与至少1种2价金属离子结合而形成缔合体，且在固相基材表面被捕获到的核酸。
16.如权利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物的工序；(b)将工序(a)中得到的试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子及高分子化合物的缔合体的工序；及(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序。
17.如权利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子及高分子化合物的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序。
18.如权利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)在含有核酸的试样中添加至少1种2价金属化合物及对该至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物的工序；(b)将工序(a)中得到的试样的pH调整到12以上，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子及高分子化合物的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序；(d)使含有适于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板，扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
19.如权利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(b)在工序(a)中得到的试样中添加至少1种2价金属化合物及对至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物，形成试样中的核酸与至少1种2价金属离子及高分子化合物的缔合体的工序；(c)使工序(b)中得到的试样接触固相基材表面，在固相基材表面捕获所述缔合体的工序；(d)使含有适于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在该固相基材表面捕获的核酸为模板，扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
20.如权利要求16至19中任一项所述的方法，其通过过滤，在固相基材表面捕获所述缔合体。
21.如权利要求16至20中任一项所述的方法，其所述固相基材为过滤器。
22.如权利要求16至21中任一项所述的方法，其所述固相基材为由无纺布形成的过滤器。
23.如权利要求16至22中任一项所述的方法，其所述至少1种2价金属为镁。
24.如权利要求23所述的方法，其在含有核酸的试样中添加pH12以上、溶解度为0.2mM以上的金属离子。
25.一种试剂套装，用于捕获试样中的核酸或用于捕获及检测试样中的核酸，其包括选自以下各要素所构成的组中的至少2个要素用于从所述试样中提取核酸的试剂；用于使该试样成为pH12以上的试剂；至少一种2价金属化合物；对至少一种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物；固相基材；及可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶。
26.在pH12以上通过与至少1种2价金属离子及对该2价金属离子具有亲和性的高分子化合物结合而形成缔合体，且在固相基材表面被捕获到的核酸。
27.如权利要求1所述的方法，其至少包括如下工序(a)将至少一种2价金属离子在固相基材表面上固定化的工序；(b)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；及(c)使在工序(b)得到的试样接触在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序。
28.如权利要求2所述的方法，其至少包括如下工序(a)将至少一种2价金属离子在固相基材表面上固定化的工序；(b)将含有核酸的试样的pH调整为12以上的工序；(c)使在工序(b)得到的试样接触在工序(a)中得到的固相基材表面，在固相基材表面捕获核酸的工序。(d)使含有适于扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶的溶液与工序(c)中得到的固相基材表面接触，以在所述固相基材表面捕获的核酸为模板扩增具有特定碱基序列的核酸的工序；及(e)对具有在工序(d)中扩增的特定碱基序列的核酸进行检测的工序。
29.如权利要求27或28所述的方法，其通过过滤，在固相基材表面捕获所述核酸。
30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其所述固相基材为过滤器。
31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其所述固相基材为由无纺布形成的过滤器。
32.如权利要求27至31中任一项所述的方法，其所述固相基材包含具有可以将至少一种2价金属离子固定化的残基的高分子化合物。
33.如权利要求32所述的方法，其所述可以将至少一种2价金属离子固定化的残基为羧基。
34.如权利要求27至33中任一项所述的方法，其所述固相基材将可以固定化至少1种2价金属离子的固性基材层多层化。
35.如权利要求27至34中任一项所述的方法，其所述至少1种2价金属离子为镁离子。
36.如权利要求27至31中任一项所述的方法，其固相基材涂布了对至少1种2价金属离子具有亲和性的高分子化合物。
37.如权利要求35所述的方法，其在含有核酸的试样中添加pH12以上、溶解度为0.2mM以上的金属离子。
38.一种试剂套装，用于捕获试样中的核酸或用于捕获及检测试样中的核酸，其包括选自以下各要素所构成的组中的至少2个要素用于从该试样中提取核酸的试剂；用于使该试样成为pH12以上的试剂；至少一种2价金属化合物；可以固定化至少一种2价金属离子的固相基材；固定化了至少一种2价金属离子的固相基材；可以扩增特定碱基序列的寡核苷酸探针、单核苷酸3磷酸及核酸合成酶。
39.在pH12以上通过与固定化于固相基材表面上的至少1种2价金属离子结合，在固相基材表面捕获到的核酸。
40.如权利要求2、7、8、18、19或28中任一项所述的方法，其所述固相基材涂布了酶吸附抑制剂。
41.如权利要求40所述的方法，其所述酶吸附抑制剂为牛血清白蛋白。
全文摘要
本发明提供将核酸捕获到固相基材表面上的方法，所述方法为包括使含有核酸的pH12以上的试样与固定2价金属离子的固性基材表面接触的工序的方法及在固相基材表面捕获核酸的方法，包括以下工序将含有核酸及镁化合物、pH调整为12以上的试样接触固相基材表面。
文档编号C12N15/09GK101044248SQ20058003574
公开日2007年9月26日 申请日期2005年8月18日 优先权日2004年8月20日
发明者深泽忠, 黑川洋 申请人:旭化成株式会社