生产克隆狗的方法

专利名称：：生产克隆狗的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产克隆狗的方法。尤其是一种将狗的卵母细胞去核形成去核卵母细胞，将该狗的一个体细胞移植到该去核卵母细胞中，然后在最优的条件下通过电融合的方法生产核移植胚胎，然后将该核移植胚胎移植到代孕母体的输卵管中的生产克隆狗的方法。本申请要求申请日为2007年1月17R申请号为20070005350的韩国专利申请的优先权，该专利申请的内容在本文中被全文引用。
背景技术：
：目前通过细胞融合或者细胞质内细胞注入的体细胞核移植技术，可以实现动物克隆。体细胞核移植技术，使后代的出生不需要经历通常生殖过程发生的减数分裂和单倍体生殖细胞，是一种通过将成併体内的双倍体体细胞移植到去核细胞中制作胚胎并将该胚胎移植到活的有机体内的生成新个体的方法。通常，在体细胞核移植技术中，供核体细胞中感受性强的卵母细胞被用于体外人工培养直到减数分裂的中期II。然后，将成熟卵母细胞去核再移植入体细胞，以防止体细胞核移植时出现染色体异常现象。将体细胞移植入成熟卵母细胞的卵周隙或细胞质后，去核卵母细胞和体细胞通过电刺激彼此物理融合。融合后的去核卵母细胞和体细胞通过电剌激或者化学物质激活然后移植入代孕母体以培育后代。这种体细胞核移植技术可以广泛应用于下述领域，例如，高级动物的繁殖，稀有或濒临灭绝动物的保护，特定营养素的制造，医疗用生物材料的生产，用于器官移植的动物的生产，具有疾病或障碍的动物的生产，用于器官移植替代治疗如基因治疗的具有医用价值的动物的生产。英格兰罗斯林研究所的Wilmut博士首先实现了动物克隆，从一只6岁大的绵羊体内摘取一个乳腺细胞，将其移植入一个去核卵母细胞生产一个核移植胚胎，然后将该胚胎移植入活的有机体内，从而培育出一只克隆动物名叫多利。后来，有报道说通过体细胞核移植已培育出克隆牛、克隆老鼠、克隆猪和克隆兔子。(见WO9937143A2，EP930009Al，WO9934669Al，WO9901164A1andUS5,945,577)。同时，不仅可以克隆农场动物，最近克隆狗等宠物引起了很多人的兴趣。首先被成功克隆的宠物是一只猫，目前已斥资几百万美元用于研究克隆狗。然而，由于狗的种属特异生殖特性以致于很难通过体细胞核移植技术实现克隆狗。本发明研究者已首次成功克隆狗，可是由于克隆效率太低，很难将其投入实际应用。本发明涉及的术语定义如下核移植一种基因操作技术，即人工将去核细胞与核DNA结合在一起，使其具有与一个细胞相同的形质。核移植胚胎注入供核细胞或与供核细胞融合而形成的胚胎。克隆一种基因操作技术，即生产与另外一个个体单元含有相同基因的新个体单元。确切地说，被克隆是指使一个细胞、胚胎细胞、胎儿细胞、和/或者动物细胞含有与另外一个细胞很相似或相同的核DNA序列。供核细胞一个细胞或该细胞的细胞核，该细胞核将被移植到作为核受体的受体卵母细胞中。受体卵母细胞该卵母细胞中的细胞核被去除后，又从其它供核细胞中接受一个细胞核。卵母细胞已达到减数分裂中期的成熟卵母细胞。去核卵母细胞被去除细胞核的卵母细胞。融合指的是供核细胞与受体卵母细胞脂膜的结合。例如，该细胞脂膜可以是细胞质膜或者细胞核膜。当供核细胞与受体卵母细胞彼此相邻地放置在一起或者供核细胞放置在受体卵母细胞的卵周隙进而产生电刺激时，供核细胞和受体卵母细胞脂膜将融合在一起。激活在核移植之前、核移植时或者核移植以后刺激细胞分裂。本发明主要是指在核移植以后刺激细胞分裂。后代这里是指在非子宫环境中也能生存的动物。这种动物在非子宫环境中也能生存l秒，l分钟，l天，l个星期，l个月，6个月，或者一年以上。
发明内容本发明的一个目的是提供一种使用体细胞核移植技术生产狗的核移植胚胎的方法，其特征在于在最优的融合条件下形成核移植胚胎。本发明的另一个目的是依照上述方法生产克隆狗的核移植胚胎。本发明还有一个目的是提供一种克隆狗的方法，包括将核移植胚胎移入代孕母体以培育后代。为了达到上述目的，一方面，本发明提供了一种生产狗的核移植胚胎的方法，包括生产去核卵母细胞；生产供核细胞；显微注射和电融合供核细胞；激活电融合卵母细胞；其中电融合的实施条件是3.8-5.0kV/cm。另一方面，本发明通过上述方法生产克隆狗的核移植胚胎。还有一个方面，本发明提供一种生产克隆狗的方法，包括将核移植胚胎移入代孕母体培育后代。本发明目前已经成功建立一个去核卵母细胞与供核细胞之间最优的电融合条件，形成一个核移植胚胎，然后将该核移植胚胎移入代孕母体实现高效地生产克隆狗。本发明利用体细胞核移植技术生产狗的核移植胚胎，然后将该核移植胚胎移植入代孕母体的输卵管中培育后代以克隆狗时，优化核移植胚胎的电融合条件，以便大大提高克隆效率。下面具体介绍本发明生产狗的核移植胚胎的每一个步骤。第l步受体卵母细胞的去核受体卵母细胞可以是狗的未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、轻微老化卵母细胞、中度老化卵母细胞或者严重老化卵母细胞。优选地，未成熟的卵母细胞可以在活体外培养成熟，或者提取在活体内已成熟的卵母细胞。通常，哺乳动物(如牛，猪和羊)的卵母细胞在成熟阶段被排出，即减数分裂中期第二阶段；而狗和其它动物不一样，其卵母细胞的排卵过程发生在减数分裂前期第一阶段，且卵母细胞在输卵管中4872小时成熟。因为狗的卵母细胞核成熟率很低，且狗的排卵时间和生殖生理特征也与其它动物不一样，所以最好选择在活机体内已成熟的卵母细胞作为受体卵母细胞。注意，应该在狗促排卵后48-72小时提取成熟卵母细胞，最好是72小时。狗的排卵期可以用现有的很多方法确定。例如，阴道涂片，血清性激素水平测定，超声波诊断系统的使用，但不局限于这几种方法。狗的发情期开始可以通过外阴肿胀和血性浆液的排放确定。本发明的一个实施例是通过阴道涂片和血清孕酮水平的分析确定狗的排卵期。当上皮细胞非角质化程度达到80%以上和血清孕酮水平达到4.0-7.5ng/mL左右的时候可以确定为排卵期。同时，排卵以后48-72小时认为是狗的卵母细胞成熟期。本发明分别提取排卵后48小时，60小时和72小时的卵母细胞迸行分析，确定排卵后72小时的卵母细胞已成熟，对应着减数分裂中期第二阶段。因此，最好在狗排卵后72小时提取其成熟卵母细胞。可以使用外科手术如麻醉动物后进行剖腹手术提取活体内的成熟卵母细胞。具体地说，可以通过现有技术中任何一种输卵管切除术来提取活体内的成熟卵母细胞。输卵管切除术是一种通过切割输卵管，用卵母细胞提取液冲洗输卵管以得到冲洗溶解液，然后从冲洗溶解液中提取卵母细胞的外科手术方法。另外，活体内的成熟卵母细胞可以通过下述方法提取在输卵管的伞端插入一根导管，然后通过导管内部的针将冲洗液注入宫管交接部。这种方法的好处是可以不伤害输卵管，而且提供该卵母细胞的动物在其后来的发情期还有使用价值。因此，在活体内提取成熟卵母细胞的最好的方法是使用导管，因为不会伤害输卵管。同时，为了提高使用导管提取卵母细胞的效率，本发明的发明人发明了一种卵母细胞采样针，该采样针有一个圆的前端，使其可以轻松地插入输卵管的入口(见图l)。本发明还提供了一种使用这种带有圆的前端的采样针提取卵母细胞的方法，该方法将该卵母细胞细胞采样针插入输卵管并结扎，然后用卵母细胞提取液向下冲洗宫管交接部并进入卵母细胞采样针，然后使用显微镜观察冲洗溶解液并从中挑选成熟的卵母细胞。提取成熟卵母细胞以后，摘除其中的单倍体核。可以使用现有技术中的任何方法进行卵母细胞去核(见美国专利4994384;美国专利5057420;美国专利5945577;欧洲专利0930009Al;韩国专利342437;Kanda等，J.Vet.Med.Sci,57(4):641-646，1995;Wilkdsen，Nature,320:63-65，1986，Nagashima等，MoLReptod.Dev.48:339-3431997;Nagashima等，J.Reprod.Dev.38:37-78,1992;Prather等，Biol.Reprod.41:414-418，1989,Prather等，J.Exp.Zool.255:355-358，1990;Saito等，AssisRepradTechAndro，259:257-266，1992;Teilouw等，Theriogenology37:309，1992)。优选地，使用下述两种方法中的任一种方法进行受体卵母细胞的去核。一种方法包括移除成熟受体卵母细胞的卵丘细胞，使用显微操作针切割受体卵母细胞的透明带的一部分以产生一个狭长的切口，然后通过这个切口移除第一极体、细胞核和相邻的细胞质(尽可能少量)。另外一种方法包括移除受体卵母细胞的卵丘细胞，对卵母细胞进行着色，然后使用吸管吸除第一极体和卵母细胞核。更优选地，对于卵母细胞去核，吸管吸除法适用于成活率高的卵母细胞，利用狭长切口的方法适用于成活率低的卵母细胞，可以通过受体卵母细胞的视觉评价决定采用哪一种方法。第2步供核细胞的生产狗的体细胞可以作为供核细胞。特别地，用于本发明的体细胞可以是来源于卵丘、皮肤、口腔黏膜、血液、骨髓、肝脏、肺、肾、肌肉、生殖道等组织的胚胎细胞、胎儿细胞、幼体细胞或者成体细胞。本发明可以采用下列体细胞，但不局限于此，如卵丘细胞，上皮细胞，纤维原细胞，神经细胞，表皮细胞，角化细胞，造血细胞，黑素细胞，软骨细胞，红细胞，巨噬细胞，单核细胞，肌细胞，B淋巴细胞，T淋巴细胞，胚胎干细胞，胚胎生殖细胞。本发明优选胎儿纤维原细胞、成体纤维原细胞和卵丘细胞。此外，本发明的供核细胞可以通过基因移植技术和基因打靶技术，使用特定基因将体细胞转换成野生型体细胞而得到。基因移植技术和基因打靶技术是本领域公知的技术。可以通过生产手术标本或活检标本的方法得到供核细胞，这些标本中的单个细胞可以通过任何现有技术得到。例如，无菌切割待克隆动物的一些组织生产手术标本或活检标本，将这些标本切碎，用胰岛素处理，然后放入组织培养基中培养。在组织培养基中培养3-4天后，可以确定培养皿中细胞的生长。当细胞生长完成以后，将其中一些组织在液氮中冷却并存储以备日后使用，然后将残余的组织进行继代培养以备在核移植时使用。在核移植时使用的细胞需要连续继代培养10次以防止其过分生长。组织培养基可以是现有技术中任意一种，如TCM-199orDMEM(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)<=第3步供核细胞的显微注射和融合供核细胞显微注射入去核卵母细胞是通过用移液管将供核细胞显微注入去核卵母细胞的细胞质和透明带之间来完成的。完成显微注射后，使用细胞操作器将去核卵母细胞和供核细胞进行电融合。电融合可以采用交流电或者直流电，使用针形电极在3.8to5.0kV/cm的条件下进行15-25AS，优选的条件是3.8to4.2kV/cm，最好是在4.0kV/cm的条件下进行两次电融合。可以在融合基中通过电刺激将供核细胞与卵母细胞融合。本发明使用的融合基包括甘露醇、MgS〇4，Hepes禾卩BSA。第4步核移植胚胎的激活融合核移植胚胎的激活是细胞周期临时中止后恢复的一个步骤。为此，细胞周期中止元素的细胞信号传递材料的激活必须减少，如MPF，MAPkitase等。通常，激活核移植胚胎有电学方法和化学方法两种。本发明优选化学方法。与电学方法相比，化学方法可以加速核移植胚胎的激活。化学方法中，需要使用如下材料对核移植胚胎进行处理，如乙醇、三磷酸肌醇、二价离子(如Ca2—或者S^+)、微管活性抑制剂(如细胞松弛素B)、二价离子载体(如C,离子载体enomicin)和蛋白激酶抑制剂(如6-二甲基氨基嘌呤)、蛋白合成抑制剂(如亚胺环己酮)、佛波醇12—肉豆蔻酯13-乙酯。使用化学方法激活核移植胚胎，本发明优选同时或逐步使用钙离子载体和6-二甲基氨基嘌呤处理核移植胚胎。更优选的是，将核移植胚胎首先使用54(VM钙离子载体在37-39'C下处理3-6分钟，然后使用1.5-2.5mM6-二甲基氨基嘌呤在37-39'C下处理4-5小时。另外，本发明提供了采用上述方法生产的狗的核移植胚胎。发明人把根据本发明的一个实施例生产的狗的核移植胚胎命名为SUN-BONA(克隆胚胎)，拉丁文学名为CanisLupusFamiliaris，并于2006年11月27日提交到国际保藏单位KCTC(韩国典型培养物保藏中心，生命工学研究所，52,Eoeun-dong,Yuseong-gu,Daejeon，Korea)进行保藏，保藏号为KCTC11037BP。该核移植胚胎已经被冷藏，以备需要时溶化使用。此外，将本发明的狗的核移植胚胎移入代孕母体产生后代可以生产克隆狗。优选地，将本发明的核移植胚胎移入代孕母体的方法是将核移植胚胎移入代孕母体的输卵管。可以使用已知的任何现有技术进行移植，优选的是，使用导管移植该克隆胚胎。本发明的实施例之一，通过将本发明的核移植胚胎植入代孕母体的输卵管已成功克隆出3只克隆狗(见实施例6)。将核移植胚胎移植入代孕母体的过程中，核移植胚胎可能处于l-细胞周期、2-细胞周期或者4-细胞周期。因此，最好在核移植胚胎被激活后4小时以内将其植入代孕母体。而且，在代孕母体准备好之前，应该将核移植胚胎放入25-(微滴)mSOF中并以矿物油覆盖进行培养。依照本发明生产的三只克隆狗，是通过12个代孕母体共使用了167个克隆受精卵完成的(1.8%，见实验例3)。因此，本发明克服了现有技术克隆效率低的缺陷，可以应用于实际，进行克隆狗的生产。本发明的克隆狗与供核细胞或者核供体表型非常相似(见图3)，而且其基因特征完全相同。本发明的实施例之一，使用本发明的方法克隆狗并采用微卫星分析其基因特征(见试验例1)。结果，本发明的克隆狗与其供核细胞或者核供体的基因特征完全相同(见表8)。另外，本发明首次完成了三只雌性狗的克隆，而不是通常的雄性狗。因此，克隆狗的生殖特征需要将其交配和怀孕而继续进行研究。下面将通过具体实施例和附图具体阐述本发明的前述目的以及其它目的、特点和优点。附图上没有标示尺寸，重点在于说明本发明的原则。本发明并不局限于以下实施例。图1为本发明具体实施例中获取狗的卵母细胞所需要的18g针的照片。图2为提供卵母细胞的狗在排卵后72小时，其输卵管中的活体内成熟卵母细胞经历的各个阶段示意图(标尺为40,)。图3为本发明具体实施例中三只克隆狗(A)和一只提供体细胞的狗(B)的照片。本发明所述的核移植胚胎于2006年11月26日放入国际保藏单位KCTC(韩国典型培养物保藏中心，生命工学研究所，大田广域市儒城区魚隠洞52番地)进行保藏，保藏号为KCTC11037BP。具体实施方式实施例1狗的受体卵母细胞的提取23只1-5岁的雌性杂种狗作为卵母细胞的供体。这些狗按照首尔国立大学动物培养实验室认可制定的标准进行培养。通过每天对处于自然发情期的狗的阴道涂片测试和血清孕S间水平分析确定狗的排卵期，排卵后48-72小时获取成熟的卵母细胞。得到的卵母细胞包括未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、轻微老化卵母细胞、中度老化卵母细胞和严重老化卵母细胞。这些卵母细胞的形态见图2。为了测量血清孕酮水平，每天提取、5ml血液，通过离心分离机得到血清，然后使用DSL—3900型激活孕酮涂层管放射性免疫测定仪(DSL—3900ACTIVEProgesteroneCoated-TubeRadioimrmmoassayKit)(诊断系统实验室公司，美国)分析该血清。当黄体酮水平达到4.0-7.5ng/ml的时候被认为是排卵期(Hase等,J.VetMed.Sci，62:243-248，2000)。从发情前期的初始迹象出现开始每大进行阴道涂片测试。将拭子插入阴唇，然后将提取的血清样品放到玻璃载片上。将涂片经D必-Quick(国际化学公司，日本)染色后用显微镜进行观察。当表层细胞达到上皮细胞角质化指数的80%的时候被认为是排卵期(EvansJ.M.等，Vet.Rec.,7:598-599，1970)。本发明依照上述方法确定排卵时间，然后通过下述手术方法获取卵母细胞。首先，将一只作为卵母细胞供体的雌性狗用6mg/kg克他命和lmg/kg甲苯噻嗪麻醉，然后使用异氟醚维持麻醉。将一种带有圆的前端的针(18g，7.5cm，见图l)通过该麻醉的狗的生殖裂口插入输卵管的伞端，然后将该针缝合固定。然后使用一个含有3cm塑料管(直径2mm)和镊子的快速释放装置。为了更易于观察导管，输卵管、宫管交接部的下部使用数字压力，将导管(24gauge)插入静脉，然后用Hepes缓冲液组织培养基TCM-199(即卵母细胞提取基)添加10%(v/v)FBS、2mMNaHCO,、5mg/m1BSA(Invitrogen，Carlsbad,CA)后冲洗卵母细胞。表l卵母细胞提取基<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2受体卵母细胞的去核在无Ca2+的CR2培养基中添加Hepes缓冲液制成hCR2aa培养基(见表2)，然后再加入0.1%(v/v)透明质酸酶(Sigma,美国)(CharlesRosenkians2;Rosenkrans等，Biol.Reprod.49，459-462，1993)。然后在上述所制的培养基中通过重复使用移液管将实施例1中得到的卵母细胞的卵丘细胞移除。使用5滞/mL苯甲亚胺(Hoedist33342)将该卵母细胞染色5分钟，然后使用倒置落射荧光显微镜放大200倍观察以挑选含有第一极体的卵母细胞。在hCR2aa培养基(见表3)中加入10%(v/v)FBS和5巡/ml细胞松弛素B，然后在培养液使用微操作器(Namhige,日本东京)将选中的卵母细胞去核。即将卵母细胞盛入一只微滴管(内径150，)中，然后使用吸管将第一极体、相邻的细胞质(少于5%)和卵母细胞核移除。然后将该去核卵母细胞保藏在添加了10%(v/v)FBS的TCM-199培养基(见表4)中。表2CR2培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>说明书第10/27页表4TCM-199培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3供核细胞的生产提取狗的成体纤维原细胞作为供核细胞。为此，首先分离一只雄性阿富汗猎犬(2个月大)的耳部皮肤进行活检。将耳部组织片断中的一些小碎片用DPBS(Dulbecco's磷酸盐缓冲液生理盐水)清洗3次然后用外科手术刀切碎。将切碎的组织放入含有0.25。/^(w/v)胰岛素和1mMEDTA的Dulbecco's改进的Eagle's培养基中并在37'C下解离1小时。将酶解细胞在无Ca2+和Mg2+-DPBS中清洗一次，300xg离心2分钟，然后种入60-mm塑料培养皿屮(BectonDickinson,LincolnPark,NJ)。该种入细胞随后放入添加了10%(v/v)FBS、ImM谷氨酸盐、25mMNaHC03和1%(v/v)极限必须培养基(MEM)非必须氨基酸溶液(Im他ogen，CA)的DMEM中在39'C、5%(202和95%空气的条件下培养6-8天。除去未贴壁细胞后，将贴壁细胞放入含有0.1%胰岛素和0.02%EDTA的培养基中进行酶解l分钟，然后放入3个新的培养皿中，每隔4-6天继代培养一次。将经过继代培养的细胞置于含有80%(v/力DMEM、10%(v/v)DMSO禾卩10%(v/v)FBS的制冷基中制冷，然后置于液氮中在-196'C下冷藏。连续3-8代细胞可以用来进行体细胞核移植，移植前首先需要解冻。然后培养3-4天，直到这些细胞汇合为止，再酶解l分钟，从单层中获取到这些细胞。实施例4将供核细胞显微注射并融合入去核卵母细胞第3阶段中生产的供核细胞显微注射入实施例2中生产的去核卵母细胞中。供核细胞显微注射入去核卵母细胞的卵周隙。实施例2中微操作器的吸管被移液管取代后，将固定的去核卵母细胞在hCR2aa培养基中用100mg/mL植物血球凝集素处理，去核卵母细胞的狭长切口使用固定吸量管固定，然后在去核卵母细胞的透明带和细胞质之间插入移液管并注射在实施例3中以单细胞分离的纤维原细胞。将供核细胞一卵母细胞的偶联体置于融合基(包含0.26M甘露醇，0.1mMMgS〇4，0.5mMHepes和0.05%BSA)中，然后放入操作装置(Nikon-Namhige，曰本)的平行电极之间，应用细胞电融合设备(NEPA,GENECa，Chiba，日本)进行电刺激。在这种情况下将使用针形电极，电极之间距离为180Am(卵母细胞的直径)。应用两个4.0kv/cm的脉冲15Z^，进行电刺激l个小时以后，在立体显微镜下将能观察到卵母细胞细胞质和供核细胞的融合。选择167个融合核移植胚胎在改进的合成输卵管液中(mSOF)(见表5)培养3个小时(G.Jang等，Reprod.Fertil.Dev.，15,179-185,2003)。本发明的发明人将这些核移植胚胎命名为SNU-BONA(克隆胚胎)，于2006年11月26日放入国际保藏单位KCTC(韩国典型培养物保藏中心，生命工学研究所52，Eoemi-dong，Yuseong-gu,Daejeon,韩国)进行保藏，保藏号为KCTC11037BP。表5mSOF的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>ImM200柠檬酸(192)0.096g/10mlCA型0.5mM200MHEPES(238.3)0.5958g/10mlE型2.5mM200//IEAA(Gibco11051-018)400WNEAA(Gibco11140-019)200ITS(I-3146)100wBSA(fattyacidfree)0.1600g透明质酸0.5mg/mlINNaOHD.W.总20mlpH7.2-7.4;渗透压275-285;注意EAA,NEAA为光敏性物质。实施例5核移植胚胎的激活实施例4中得到的核移植胚胎，置于包含IOjxM离子载体的mSOF中在39'C下培养4分钟以将其激活。然后进行冲洗并放入添加1.9mM6-二甲基氨基嘌呤的mSOF中4小时进行进一步培育(见表5)。将核移植胚胎置于25W微滴覆盖有一层矿物油的mSOF中培养，然后移植入代孕母体。实施例6将胚胎移植入代孕母体及生产克隆狗实施例5得到的167个核移植胚胎将被手术移植入处于自然发情期的代孕母体排卵后72小时的输卵管中。核移植胚胎激活后4个小时进行该移植手术。12只杂种狗作为代孕母体，这些狗无病、有正常的发情周期和正常的子宫条件。这些代孕母体首先动脉注射0.1mg/kg乙酰丙嗪和6mg/kg异丙酚将其麻痹，然后使用2。/。异氟醚维持麻痹。对麻痹的雌性狗的手术区域进行无菌化处理然后将腹部的中间切开即一般的剖腹手术，以露出输卵管。然后通过该切口用手拉出卵巢、输卵管和子宫。被拉出的卵巢的卵巢系膜须小心处理以便识别输卵管的入口，将一只安装了一个1.0ml结核菌素注射器(Latexfree,BectonDickinson&CO.Franklinlakes,NJ07417)的3.5F雄猫导管(Sherwood,St.Loms，MO)插入输卵管中以保障导管前面有足够的空间。然后将核移植胚胎通过该导管注入输卵管。通过显微镜观察核移植胚胎是否成功注入输卵管，然后将500ml含有抗生素的生理盐水注入腹腔。腹部缝合使用可吸收的缝合线，然后皮肤缝合完成。为了防止术后感染，手术后将连续注射3天广谱抗生素。表6列出了移植入代孕母体的卵母细胞的状态和受精卵母细胞的数量。表6代孕母体，卵母细胞供体的数量，卵母细胞状态和移植的的受精卵母细胞的数量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>核移植胚胎被移植入代孕母体23天后，通过在SONOACE9900(MedisonCo.,LTD.,韩国首尔)型超声扫描仪上附载一个7.0MHz线型排列的探针监测怀孕。初歩确认后每2个星期通过超声监测一次。结果发现有三只狗(代孕母体C、J、K)怀孕了。通过超声波检测发现每个代孕母体内均有一个胚囊，且没有死胎或流产的情况。核移植胚胎移植后60天进行克隆狗剖宫产。每只克隆狗的重量分别为520g、460g、520g，全部为雌性，而且均正常和健康(见图3)。试验例1依照本发明生产的克隆狗的基因同一性测试依照本发明的方法在实施例6得到的3只克隆狗，检查其是否与实施例3提供核细胞的阿富汗猎犬具有基因同一性。为此，分离克隆狗、狗供体、代孕受体和供核纤维原细胞的基因组DNAs，然后进行亲本分析。首先采集狗供体和代孕母体的血液样品。依照G-spm'M基因组DNA萃取工具的厂商(Intron，Korea)提供的方法，从该血液样品和酶解纤维原细胞中萃取基因组DNA。分离的基因组DNA样品溶解入50WTE，然后与14个特定标本狗(PEZ1,PEZ2，PEZ3,PEZ5，PEZ6,PEZ10,PEZ11,PEZ012，PEZ13，PEZ16,PEZ017,FH2010,FH2054,FH2079)进行微卫星分析。SP，以该分离的基因组DNA样品为模板，使用荧光标记的引物(见表7)进行PCR增幅，这些引物是基于已知的标记序列制备的。该增幅产物通过自动DNA序列分析仪(ABI373:AppliedBiosystems,FosterCity,CA)进行分析。另外，通过专用软件(GeneScanandGenotyper;AppliedBiosystems)评估增幅产物的尺寸。表7用于PCR增幅的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>试验结论依照本发明方法得到的三只克隆狗均与阿富汗猎犬和从狗供体分离出来的纤维原细胞具有基因同一性。相反，本发明的克隆狗与代孕母体彼此基因完全不同(见表8)。表8基因型分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>PEZ02121/121121/121121/121m/121121/121ii7/m117/U7U7/125PEZ03127/130127/130127/130127/130127/130123/124123/123137/140PEZ05105/113105/113105/113105/113105/113105/113101/101101/103PEZ06180/184180/184180/184180/184180/184177/179187/187171/181PEZ10264/276264/276264/276264/276264/276287/287280/280287/287PEZ11128/146128/146128/146128/146128/146132/136124/128125/132PEZ12271/282271/282271/282271/282271/282271/271292/300rid*PEZ13174/217174/217174/217174/217'174/217174/221174/221217/221PEZ16288/300288/300288/300288/300288/300284/300308/308300/304PEZ17207/207207/207207/207207/207207/207203/207199/203199/207FH2010227/228227/228227/228227/228227/228228/236227/231223/231FH2054151/155151/.155151/155151/155151/155151/151167/167155/167FH2079269/269269/269269/269269/269269/269273/273273/273273/273*等位基因没有测定。试验例2依照本发明的方法克隆狗的效率根据本发明生产克隆狗的具体实施例，使用167个克隆受精胚胎从他们的代孕母体生产出3只克隆狗。相比较，众所周知的生产克隆狗的传统方法(见韩国专利申请号No.2005-67736)，使用1095个克隆受精胚胎，从123个代孕母体中只克隆出2只克隆狗，而且一只成活另一只却未成活。因此，本发明提供的克隆狗的方法与现有技术相比，效率得到了显著地提高。本发明生产克隆狗的方法具有高效率，而且对动物医学、人类学和医学有很大的贡献，如优良品种的繁殖、异种和带病动物模型。另外，本发明为首次成功克隆雌性狗，可以更加正确地研究克隆狗的生殖特点，而不是以往的雄性狗。通过具有示范性的实施例对本发明进行了详细的阐述，本领域普通技术人员能够理解，形式和细节的变化都不偏离本发明权利要求所定义的范围和实质。序列表<110>首尔大学校产学协力财团<120〉生产克隆狗的方法<160〉28<170>Kopatentin1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223〉PEZ001正义引物<400〉1Ggctgtcacttttccctttc20<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223〉PEZ001反义引物<400>2caccac33tctctctcat汪3atsc2斗<210〉3<211>20<212>DNA<213〉人工序列.<220><223〉PEZ002正义引物<400〉3tcctctct33ctgcctetgc20<210〉4<211>30<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉PEZ002反义引物<400〉4gcccttg础3tgascaatgac3ctgtatc30<210>5<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220><223>PEZ003正义引物<400〉5cacttctcataccc2g2ctc<210><211><212>620DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ003反义引物<400>6C33tatgtc3actatACttc<210><211><212>720DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ005正义引物<400>7gctatcttgtttcccacagc<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PEZ005反义引物<400>8tractgtatacaacattgtc20<210>9<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>PEZ006正义引物<400〉9atgagcactgggtgttatac20<210〉10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ006反义引物<400>102C2ca^ttgc2ttgtcaaac20<210>11<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220><223>PEZ010正义引物<400〉11cttcattg^gtetctatcc20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PEZ010反义引物<400〉12cctgcctttgtaaatgtaag20<210>13<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>PEZ011正义引物<400〉13attctctgcctctccctttg<210><211><212><213>1420DNA人工序列<220><223>PEZ011反义引物<400〉14tgtggataatctcttctgtc<210>15<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉PEZ012正义引物<400〉15gtagattagatctcaggcag<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列202020<220><223>PEZ012反义引物<400〉16taggtcctggtagggtgtgg20<210>17<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PEZ013正义引物<400〉17agtctggtgatttaattcgg20<210〉18<211>28<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ013反义引物<400〉18gtctagtccccagtctagttcactgccc28<210>19<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉PEZ016正义引物<400〉19gctctttgtaaaatgacctg20<210>20<211>21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>PEZ016反义引物<400>20gtgggaatcgtcctaaaaccc21<210〉21<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220><223>PEZ017正义引物<400>21cteagggactg肌cttctcc20<210〉22<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PEZ017反义引物<400>22gtggaacctgcttaagattc20<210〉23<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉FH2010正义引物<400>23aaatggA2ic2gttgagcatgc21<210>24<211>21<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉FH2010反义引物<400〉24ccccttacagcttcattttcc21<210〉25<211〉22<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>FH2054正义引物<400〉25gccttattcattgcagttaggg22<210〉26<211>22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉FH2054反义引物<400〉26atgctgagttttgaactttccc22<210〉27<211〉18<212>DNA<213〉人工序列1、一种在数据处理环境中对包含在通信信息包中的标识符进行转换的方法，其中采用主机和I/O适配器所耦接的PCI组织在所述主机和所述I/O适配器之间路由该通信信息包，所述方法包括在把边缘交换器所接收的所述通信信息包中的第一通信信息包路由出所述边缘交换器之前，对所述通信信息包中的所述第一通信信息包所包含的目的标识符进行转换，所述边缘交换器直接连接到所述主机上或直接连接到所述I/0适配器上；以及对内部交换器所接收的所述通信信息包中的第二通信信息包进行路由，而不需要对包含在所述通信信息包中的第二通信信息包中的目的标识符进行转换，所述内部交换器不直接连接到所述主机上或直接连接到所述I/O适配器上。2、如权利要求l的方法，还包括在把所述通信信息包中的所述第一通信信息包路由出所述边缘交换器之前，对包含在所述通信信息包中的所述第一通信信息包中的源标识符进行转换。3、如权利要求l的方法，还包括在所述边缘交换器和所述内部交换器中包含路由表；以及利用所述路由表确定是否对包含在所述通信信息包中的所述标识符进行转换。4、如权利要求l的方法，还包括通过特定交换器中的源端口接收所述通信信息包中的特定一个；读取包含在所述通信信息包中的所述特定一个中的特定源标识符和特定目的标识符；以及利用所述源端口、所述特定源标识符和所述特定目的标识符来确定是否转换所述特定目的标识符。5、如权利要求4的方法，还包括在所述边缘交换器和所述内部交换器中包含路由表；利用所述源端口、所述特定源标识符和所述特定目的标识符标识所述路由表中的4亍；权利要求1.一种生产狗的核移植胚胎的方法，包括生产去核卵母细胞；生产供核细胞；显微注射和电融合供核细胞；和激活电融合卵母细胞；其特征在于电融合的实施条件是3.8-5.0kV/cm。2.如权利要求1所述的生产狗的核移植胚胎的方法，其特征在于电融合实施条件为3.8陽4.2kV/cm。3.如权利要求1所述的生产狗的核移植胚胎的方法，其特征在于电融合实施条件为4.0kV/cm。4.如权利要求1所述的生产狗的核移植胚胎的方法，其特征在于采用针形电极进行两次电融合，每次15-25As。5.按照权利要求1或权利要求4所述方法生产的核移植胚胎。6.按照权利要求5所生产的核移植胚胎，其特征在于该核移植胚胎已被保藏，其保藏号为KCTC11037BP。7.—种生产克隆狗的方法，包括将按照权利要求5和权利要求6所生产的核移植胚胎移植入代孕母体的输卵管，使其出生，成活后代。全文摘要本发明提供一种克隆狗的方法，将卵母细胞去核生产去核卵母细胞，将狗的体细胞移植入去核卵母细胞中，在最优的条件下进行电融合生产核移植胚胎，然后将核移植胚胎移植入代孕母体。本发明克隆狗的方法具有高效率，而且对动物医学、人类学和医学有很大的贡献，如优良品种的繁殖、异种和带病动物模型。另外，本发明为首次成功克隆雌性狗，可以更加正确地研究克隆狗的生殖特点，而不是以往的雄性狗。文档编号C12N15/06GK101225382SQ20071015225公开日2008年7月23日申请日期2007年9月20日优先权日2007年1月17日发明者M·萨敏·何塞因,吴炫周,姜成根,龟張,朴正恩,李柄千,洪少君,费班托·羽达,金大暎,金惠珍,金敏奎,金正柱申请人:首尔大学校产学协力财团