肺结核疫苗的制作方法

专利名称：肺结核疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种属于分枝杆菌(Tl^coZ^"er/wm )属的分离樣i生 物，其特征在于，其包括赋予PhoP-表型的Rv0757基因的失活和防 止DIM产生(DIM-表型)的第二基因的失活。另外，本发明包括背景技术现在已经证实，4吏用疫苗来预防人类肺结核成为将近一个世纪 以来的巨大才兆战。来源于牛分枝杆菌(M6ov&)的卡介苗(BCG) 是目前唯一在使用的肺结核疫苗并且是世界范围内^f吏用最广泛的 疫苗。自20世纟己20年代开始，BCG疫苗的发展和普遍使用呈现显 著的进步，具有能够将肺结核从世界根除的前景。但是，这些最初 的希望并没有实现，而且由大量的效力试马全的结果可以清楚，在这 种疾病已成为地方性疾病的第三世界地区中，现有形式的BCG疫 苗在控制疾病、特别是成年人呼吸形式的疾病中的使用是有限的 [4]。随着对结核分枝杆菌(M /w&rcw/a^)的毒性和导致保护性免 疫产生的免疫反应模式的越来越多的了解，使得开发优于BCG的 疫苗成为可能。当对宿主4妄种BCG时可获得4交高的保护水平，这 一发现表明存活力和持久力是肺结核疫苗成功所必需的基本特性。 在本发明中，我们4吏用具有失活的Rv0757 (p/zoP )基因和p/zo尸 的第二独立突变(其防止DIM的合成)的结核分枝杆菌菌抹作为 原型单剂量活疫苗，而且我们已指出，它在免疫低下的SCID小鼠中比BCG更能被减毒，且在小鼠中产生的保护水平与BCG所产生 的相当，并且在豚鼠中产生比BCG更高的保护。p/zoP基因和p/^W —起形成的双组分系统的部分，表现出与控 制胞内病原体的关4建毒力基因转录的其它双组分系统的高度相似 性。它还控制许多其它并非直接参与毒力的基因表达[19]。去除毒 力基因本质上似乎并不是结核分枝杆菌减毒的唯一方法。已经表 明，不能重新合成泛酸的结核分枝杆菌的泛酸营养缺陷型突变体， 在SCID小鼠中持续存在，但不会导致疾病发生[17]。单独的亮氨 酸营养缺陷型，其毒力也被大大减弱且不能在SCID小鼠中进行体 内复制[28]。因此，现在普遍4妄受这样的原则基于结核分枝杆菌 的疫苗林可成功地被减毒，同时保留在牛分枝杆菌BCG中被抑制 的基因。过去，对于比BCG更有效的疫苗的研究基于这样的观念BCG 毒力的丧失本质上是促进其完全保护效力缺失的一个因素[32]。因 此推i仑为结核分枝杆菌的新型减毒突变体，具有4交少的毒力，可 能成为更加有效的疫苗。然而，近期的研究显示，自然感染结核分 枝杆菌和接种BCG在其产生抗肺结核的保护性免疫的能力上没有 差异[34]。这提出了关于是否可能通过结核分枝杆菌的合理减毒来 改良BCG的问题。在这种情况下，发现在SCID小鼠模型中，具有 两个独立突变(1, PhoP蛋白质合成和2,DIM合成)的组合的本发 明的突变结核分枝杆菌菌4朱，即4吏当以高于BCG 10倍的剂量4吏用 时，相比BCG也更能被减毒，并且在豚鼠模型中具有比BCG更高 的保护程度，这些发现特别出乎预料并且具有重要的意义。发明内容本发明的第 一 个方面涉及 一 种属于分枝杆菌属的分离微生物， 其特4i在于包4舌Rv 0757(/ /zo尸)基因的失活和防止DIM( phthioceroldimycocerosates )产生的第二基因的失活。在下文中，该分离樣i生 物将被称为本发明的微生物。本发明的第二个方面涉及一种属于分枝杆菌属的分离微生物， 其特;f正在于包^舌，^f吏Rv 0757 (p/zoP )基因和防止DIM产生的； /zo尸 的第二独立突变失活。在本发明的优选方面中，所述的第二突变是 在Rv2930 ()基因中，包括DIM合成所必需的/adZ)26基因 的缺失。本发明的第三个方面涉及使用本发明的分离微生物来制备用 于预防动物肺结核、并且更加优选地用于预防人类肺结核的疫苗的 应用，以及肺结核疫苗目前在治疗人类疾病如膀胱癌中所具有的其 它用途。以下在本发明的情况中，"结核分枝杆菌S02菌抹"用来表示 已通过Rv0757基因而失活并另外包4舌防止DIM (结核菌醇二蔗蜡 酸酯，phthiocerol dimycocerosates)产生的第二基因的失活的结核 分枝杆菌菌林的分离微生物，其中Rv0757基因是由结核分枝杆菌 MT103临床菌才朱，才艮才居Pelicic等(1997 ) ( Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Afyco^c/er/ww fw6ercw/os7'51.尸rac iVa// /4cat/Sc/ tASM 94: 10955-10960 )所4皮露的方法，利用同源重纟且在结 核分枝杆菌的Rv0757基因的^^//位点插入卡那霉素抗性标记构建 而成。因此，本发明的所述菌4朱在来源于结核分斗支杆菌的存活减毒 疫苗中表现为两个独立的突变，独立的p/zoP突变不会影响源自所 述基因的失活的疫苗的特性。实施例9纟皮露了如何构建具有独立双 突变的分枝杆菌属分离微生物，其产生与披露的结核分枝杆菌S02 菌才朱相同的表型。以下在本发明的情况中，疫苗将用来表示的药物，其给药对所 要预防的疾病可产生防雄卩。以下在本发明的情况中，BCG将用来表示自1921年以来被用 于4氐抗肺结核的现有疫苗。它是来源于牛分枝杆菌菌一朱的存活减毒 疫苗，其中该牛分枝杆菌菌抹在实验室传代培养后丧失了毒力，并 且现在我们知道其具有一百多个缺失基因(5)。以下在本发明的情况中，H37Rv 一寻用来表示已经;故测序的致 病结核分枝杆菌菌抹，Cole等将这些基因表示为Rv (Ref Cole W a/ 1998 Deciphering the biology of Afyco6a"e"'ww ZwZwcw/as7、 from the complete genome sequence. iV^we 393: 537-544)。以下在本发明的情况中，MT103将用来表示结核分枝杆菌临 床分离菌(参考文献15 Camacho等)。以下在本发明的情况中，DIM-菌林将用来表示不能够合成与 结核分枝杆菌的致病性相关的重要脂质，结核菌醇二蔗蜡酸酯的结 核分枝杆菌复合菌群(complex)的菌4朱。在图11中使用1A29菌 才朱，其由MT103菌才朱组成，其中Rv2930 (fadD26)基因通过在参考 文献15 (Camacho a/. 1999 Identification of a virulence gene cluster of A^coZ a"er/wm fw6ercw/osfs by signature-tagged transposon mutagenesis. Afo/ M/cra6/o/ 34: 257-267)中披露的转座子1096而失 活。以下在本发明的情况中，S02+ pS05将用来表示结核分枝杆 菌S02菌4朱，其中尺v0757突变通过具有分枝杆菌p/2o尸基因的复 制型质粒的转化而被尺W 757基因补偿，但是它不能补偿DIM合成， 它的表型为phoP+ DIM-。以下在本发明的情况中，结核分枝杆菌phoP-将用来表示由于 WW75 7基因在7 "W B^五/位点之间的缺失而失活的结核分枝4干 菌菌4朱，它的表型为phoP-DIM+。以下在本发明的情况中，Rv2930 (/^/Z)26)将用来表示位于负责 合成结核菌醇二蔗蜡酸酯的操纵子的起点的基因(参考文献15 Camacho等1999),并且在结核分枝杆菌中去除该基因可产生稳定 的DIM-表型。


图1蛋白质印迹分冲斤(Western BlotAnalysis)。 MT103、本发明的S02菌株和BCG Pasteur的胞外蛋白4是取物的蛋白质印迹图，其 中使用获得的抗PhoP和ESAT-6的多克隆抗体。MT103菌林具有 ESAT6+和phoP+表型，S02菌才朱具有PhoP画和ESAT6 +表型， BCG疫苗菌4朱是PhoP+和ESAT6-。图2本发明的S02菌#^ SCID小鼠中的减务ft用。",喷雾感 染有20CFU的S()2、由pS05 (S02 + pS05)氺卜j尝的S02和MT103 的SCID小鼠(n=10)的存活率曲线。存活天数的平均值为多于245 (S02)、 62.1±5.88 (S02十pS05)详口 36.7±0.67 (MT103)天。通过喷 雾感染S02菌林的小鼠存活了 245个实验日，而那些感染MT103 和由p/zo尸补偿的S02菌4朱的小鼠在62天以前死亡。A,通过l争月永注 射感染5.4 x 106 CFU的S02和2 x 105 CFU的BCG Pasteur的SCID 小鼠(n=7)的存活率曲线。这表明S02菌林的减毒水平高于目前 用于人类的肺结核疫苗BCG。图3接种本发明的S02菌林和BCG的小鼠中的细J包免j^应。Balb/c小鼠通过皮下注射4妄种8 x 103 CFU的BCG (Phipps)或 2.5 x 103CFU的本发明的S02菌林。结果表示为在接种之后每隔 一段时间脾中的总CD4+ZCD8+群体的百分比，以及在由完全结核 分枝杆菌抗原刺激之后总CD4+/ CD8+群体中表达IFN- Y的纟田月包的 百分比。*表示在特定的时间点上组间统计学上的显著性差异(p< 0.005)。细胞免疫结果显示，与接种BCG的小鼠相比，接种S02菌才朱的动物中的CD4+淋巴细胞的数量在14、 30、 45和60天较高， 并且在45天和60天抗结核分枝杆菌抗原的特异性IFN Y的产量显 著。与接种BCG的小鼠相比，接种S02菌林的动物中的CD8+淋 巴细力包的凄t量在45天和60天一交高，并且在14天抗结核分枝4干菌 抗原的特异性IFN Y的产量显著。图4与BCG相比，本发明的S02在接种Balb/c的小鼠中的 保护效力。在接种本发明的S02菌林和BCG、静脉感染结核分枝 杆菌H37Rv的Balb/c小鼠的肺(a )和脾(b )中回收的CFU的数 量。在接种S()2的小鼠的肺和脾中，CFU的减少与在接种BCG的 小鼠中得到的相似，而与未接种的小鼠相比表现为显著的保护。图5在接种本发明的S02菌林和BCG的豚鼠中，抗低剂量结 核分4支杆菌H37Rv的4呆护效力。在感染低剂量结核分枝杆菌H37Rv 的已接种的豚鼠和注射有生理盐水的对照豚鼠的肺(a)和脾(b) 中log1QCFU/ml的平均值。数据代表4周后处死的所有动物(n-6) 中的平均CFU。误差棒表示标准偏差。在以低剂量感染结核分枝杆 菌并冲妻种S02的;3承鼠的肺和脾中，CFU的减少与在接种BCG中的 豚鼠中得到的相似，而与未接种的d、鼠相比则是显著的。图6在接种^^发明的S02菌林和BCG的豚鼠中，抗高剂量结 核分4支杆菌H37Rv的4呆护效力。"，已知在以低剂量进行感染的小 鼠和豚鼠中的保护实验表明，在接种S02和BCG的小鼠中具有明 显的4呆护作用而BCG和S02之间并没有差异，因而4吏用以高剂量 进行感染的豚鼠模型。豚鼠在喷雾感染结核分枝杆菌H37Rv之后的 存活率曲线。6，肺部疾病的程度和感染的范围，通过总的肺实变来 测量。每个在人道终点死亡的动物个体的值以"x"标记。虚线表示组 的平均百分^f直(#在S02中对应两个动物)。c，耳又自每个处理组的豚 鼠的肺叶的代表性截面的低分辨率(x 30)图像。条线代表lmm。 </, 在已接种和未接种的豚鼠的脾和肺中的平均CFU数。这个实验表明，以高剂量感染结核分枝杆菌的豚鼠模型，接种S02的豚鼠的存 活显著长于4妻种BCG的力參鼠，它们还产生4交少的肺部损伤，并且 与王见有的BCG疫苗相比，在月年和肺中具有4交^[氐凄t量的CFU。图7.在Balb/C小鼠中静乐^感染本发明的S02的减务ft用不 会通过^M尝phoP而回复。与野生型MT103菌4朱以及补偿有phoP (S02 + pS05)的菌才朱比4交，研究在Balb/C小鼠中,争脉感染105CFU 的S02 (phoP-DIM-)菌4朱。通过在3周和6周后的测量，发现在脾 (7a脾)和肺(7b肺)中菌落总数(CFU)均得到减少。野生型菌 林的CFU的水平不会在补偿的菌抹中得到回复。这些在免疫活性 小鼠中的实验表明，出乎预料的减毒作用可能是由于不会通过phoP 补偿而回复的第二附加突变。图8.本发明的S02菌林不产生DIM，且DIM合成与突变无关。通过薄层色语法分析来源于不同的结核分枝杆菌菌林的 脂质。8 a MT103菌4朱可以 见察到DIM产生，j旦是S02菌4朱和补 偿p/zoP (S02 pS()5)基因的菌林不会产生DIM。这表明对于S02， 缺乏DIM与； /zo尸无关。8 b表明MT103菌4朱和4又失活了 p/ o尸 (MT103 A/ /zo尸::/7j;g)基因的MT103菌4朱，两者都能合成DIM，这确 定了 DIM的产生与突变无关。图9用于失活/似//>26基因的质粒构建。图10用于失活/7/lO尸基因的质津立构建。图11小鼠中减毒作用的研究气管接种的Balb/C小鼠的存活 率曲线，用以研究结核分枝杆菌的不同菌林的减毒作用。H37Rv和 MT103对应于没有突变的结核分枝杆菌菌林，所有的小鼠均在第 IO周之前死亡。50%的种结分枝杆菌DIM- (1A29)菌林的小鼠存活到20周之后。所有接种S02 (phoP-和DIM-突变体)的动物 存活了 20个实验周。图12.豚鼠的存活率和重量曲线，以研究50倍疫苗剂量的SO2 的毒性。为了表明S02是无毒的，对6只豚鼠接种50倍的疫苗剂 量。经过持续6个月的实验之后，存活率为100%。经过这6个月， 发现所有动物重量都得到增加，这表明了 S02菌林的无毒性(Y= 对应各个感染周的重量(以克计)，乂=时间(以周计))。图13.已接种的豚鼠在感染结核分枝杆菌后的存活率。豚鼠中的保护研究，300天之后的存活率未接种的豚鼠(盐)、接种现有 BCG疫苗的豚鼠、接种结核分枝杆菌p/zo尸-菌林的豚鼠或接种S02 (p/zoP-和DIM-突变体)的豚鼠的存活率曲线。在皮下接种后，使 动物感染高剂量的结核分枝杆菌(H37Rv)的有毒菌林以研究存活 率。60天后，6只未4妄种的月豕鼠死亡，而4妾种S02、/ /zo尸- 和BCG 的组存活。在感染300天后，3只4妻种BCG和p/zoP-的月豕鼠死亡， 与之相比，4妻种S()2的组中只有一只死亡，这表明p/7oP突变体的 保护作用类似于现有疫苗BCG,而phoP-和DIM-双突变体，S02 的接种，在豚鼠中保护作用更好。图14.豚鼠中的保护研究，400天之后的存活率对图13中所 示实验的继续。6只未接种的豚鼠在60天后死亡。在感染400天之 后，3只来自4妻种S02的组的月豕鼠(图14a)存活，而只有一只接 种BCG(图14a和图14b)和phoP- (图14b)的豚鼠存活，再次表 明/ /7o尸突变体的^f呆护作用类卩以于BCG，而phoP-和DIM-双突变 体，SQ2的接种，在400个实验日之后保护作用更好。
具体实施方式
本发明的一个方面涉及一种属于分枝杆菌属的分离微生物，其特征在于包括赋予PhoP-表型的Rv0757基因的失活和防止DIM产 生(DIM-表型)的第二基因的失活。另外，本发明包括使用所述凝: 生物用于制备预防肺结核的疫苗的应用，以及疫苗本身。贯穿本发明指出了分离的结核分枝杆菌属的phoP- DIM-菌林， 如何由于它们获得的减毒水平和它们产生的保护水平，而表现出使 它们特别适合用作疫苗的特点。为了证明减毒作用，对免疫低下的SCID小鼠喷雾接种S02 (phoP-DIM-)菌株。所述小鼠(图2a)的存活显著长于感染野生型 菌才朱的小鼠。另外，在S02+pS05 (phoP+DIM-)菌4朱中这种减毒作 用由/7/w尸得到补偿(图8a)。此夕卜，当在免疫活性Balb/C小鼠中通过静脉注射进行减毒研究 时(图7),与野生型MT103菌林相比，S02存在明显的减毒，但 是出乎预料的是这种减毒不被p/70尸补偿，因为对于免疫活性小鼠， S02+ PS05 (phoP+ DIM-)菌4朱的毒性与野生型菌4朱相同。4又对S02 (DIM-, /7/zo尸-)菌4朱与DIM-菌4朱的Balb/C小鼠进4亍比4交的存活研究 表明，接种S02具有出乎预料更高的存活率(图11)。在静脉感染的SCID小鼠中S02和BCG的存活比较研究显示， S02菌抹的减毒水平高于目前用于人类抗肺结核的疫苗BCG (图 2b)。在4妻种50倍疫苗剂量(在对批量BCG的质量控制中^f吏用) 的豚鼠中的毒性研究表明，经过6个月的研究，豚鼠体重增加并且 没有表现宏 见上或者孩O见上可见的与肺结核相适合的组织损伤，从而证实了 S02的减毒和无毒性(图12)。这种出乎预料的减毒和无毒性是由于PhoP-DIM-表型，而且这些突变体保持对抗肺结核药物 的敏感性，使得可以进行常规治疗。由此表明，在Balb/c小鼠中开展的疫苗实验，直到感染后4周， 在肺和脾中由本发明的结核分枝杆菌S02菌抹和BCG产生的保护 水平是相似的。如果我们比较接种小鼠的脾中的CD4+和CD8+的 相对比例，可以发现与4妻种BCG的小鼠相比，在4妄种本发明的S02 菌林的小鼠中CD4+和CD8+都具有较高的百分比。另夕卜，当这些 细月包由来源于培养滤液的抗原进4于刺激，则在"t妻种后45天和60天， 在接种本发明的S()2菌林的小鼠中可测量到CD4+/IFN-Y+显著较 高的百分比。尽管在每个时间点上均不显著，在接种本发明的S02 菌^K的小鼠中却测量到CD4+/IFN- Y十的相似的趋势。该数据表明， 与接种BCG相比，接种本发明的S02菌林产生更好的T细胞活化 这是通过对CD4+/ifn- y十的合成进^f亍测量而得到的。已知对结核 分枝杆菌的保护性免疫通常依赖于TH,-型细胞免疫反应的产生(特 征为，从抗原的特异性T细胞中分泌IFN-y )，可以推断通过本发 明的S02菌株引起的相对较高水平的T细胞活化有助于其产生强保 护反应的能力。另夕卜，通过使用不同的系统和测试才莫型和各种条件，我们已经 设法表明小鼠模型对于研究BCG与S02相比之下的保护差异的相 对能力。表明这两种疫苗，S02 (phoP画DIM画)和BCG,在小鼠才莫 型中提供保护。采取一种方案，用豚鼠以更加显著和逐渐更加严格的实验来比 较疫苗。这种比较疫苗的系统方法可以为鉴别最佳候选疫苗(为此， 应进行进一步的试马全)3是供一个有益的出发点。通常认为豚鼠更易 被肺结核感染，因此可以成为这种疾病较为显著的模型[30]。与小 鼠相比，力豕鼠的优势是，该疾病的病理与在人类肺结核中7见察到的 相似，因此它是用于测试疫苗效力的合适的才莫型。在近期关于结合分枝杆菌的泛酸和亮氨酸双营养缺陷型突变体的喷雾疫苗研究中， 在喷雾施用结核分枝杆菌5周后，在接种豚鼠的肺和脾中获得与牛分枝杆菌BCG相当的保护水平，其中两种疫苗导致感染对脾的有 限扩散[34]。在另一项使用表达ESAT-6的重组BCG的研究中，只 在脾中观察到高于牛分枝杆菌BCG的保护水平[6]，这表明提高的 保护局限于防止感染从肺部扩散的能力。为了进行本感染，对豚鼠接种低剂量的结核分枝杆菌H37Rv, 直到感染后4周，在月申和月年中由4妾种本发明的S02菌抹和BCG产 生的保护水平都是相似的。两种疫苗都l是供了非常有效的保护，与 接受生理盐水的对照组相比，使肺和脾中的CFU减少了大约2 log。 ^旦是在两个疫苗组之间没有统计学上的显著性差异。我们可以断 定，在感染后如此短的时期内要证明新疫苗相对于BCG的更强的 效力是困难的。这是由于，事实上当前4妄种BCG的动物器官中的 CFU(菌落形成单位)非常低以至于实验不具备区分能力来显示CFU 显著的额外减少。在力參鼠的其他存活研究中发现，虽然接种BCG 相比于未接种的对照(或者接种无效疫苗)产生了统计学上的显著 性保护，然而即使对于低剂量结核分枝杆菌的感染，这种保护也只 是部分的。在感染后60到80周以低剂量进行施用的研究中，有些 接种BCG的对照没有保护任何豚鼠[35]，而有些则保护了低百分比 的(20%至30%)的动物[36][37]。另一方面，以高剂量施用，可能 导致比通常用于评<介TB疫苗的^f呆护效力更严重的疾病。对于本发明，我们4吏用相对高剂量的结核分枝杆菌H37Rv进 行喷雾感染，研究周期延长到180天。我们这样啦支是为了产生更严 格水平的感染，能够显示出本发明的S02菌株潜在的保护效力，同 时促进相对于BCG的辨别水平。在存活方面，与未4妄种的对照相 比，接种BCG的动物组显著地被保护，并且尽管在我们的研究中 使用相对高剂量的感染，它们表现出的整体保护水平与在其它研究 中观察到的相似。另外，通过几种指标的测量，包括延长的存活和肺部损伤的实变程度，我们还发现本发明的S02 (phoP- DIM-)菌才朱 与BCG相比其保护效力在统计学上显著性4是高。这种疾病的减纟复 形式可能是直接造成接种本发明的S02菌抹的动物具有较高存活 率的原因。本发明所披露的结果显示，根据多种标准，S02菌林和由此属 于分枝杆菌属(特别是来源于结核分枝杆菌复合菌群)的具有phoP-DIM-表型的微生物是比BCG更有效的疫苗。在SCID小鼠中，其 比BCG更加减毒，其为小鼠纟是供至少与BCG同样良好的保护性免 疫，并且产生更强的细胞免疫反应。此夕卜，在感染高剂量H37Rv 的豚鼠中进行的保护实验中，具有DIM- phoP-表型的菌林产生 100%的豚鼠存活率，而在相同情况下BCG只达到33%的存活率。 这种《呆护与疾病的严重程度和细菌负荷的减少相关。为了检查S()2 (phoP- DIM-)的保护水平是否由于p/2o尸突变或 者是否可能由于DIM的额外突变，在豚鼠中通过高剂量感染进行 了另 一项4妄种实'睑。6只动物的组4妻种BCG、 S02 CP/zoP- DIM-)和 结核分枝杆菌/ /2o尸-DIM+, 6只用作对照的动物未进行接种。实 验持续400天。在这项另外的实-验中，未接种的豚鼠在70天前死亡。在感染 300天之后，冲妻种BCG和p/7oP- DIM+的3只月豕鼠死亡，相比之下 才妄种S02的组中只有一只死亡，这表明由DIM+突变体产生 的4呆护与现有疫苗BCG相似，而在月承鼠才莫型中接种S02, p/zoP-和 DIM-双突变体的保护作用更好(图13)。在400天之后，在4妄种 S02(图14a)的组中有3只月豕鼠存活，而只有1只接种BCG (图14a 和图14 b )和phoP- DIM+(图14 b )的豚鼠存活，这表明phoP画DIM+ 突变体的保护类似于BCG，而在400个实马全日之后接种S02， / /zoP-和DIM-双突变体的保护作用更好，出乎预料比BCG更强的保护效 力不〗又归结于； /zo尸-突变，还归结于S02双突变/ /zo尸-DIM-。因此，本发明的第 一 个方面涉及 一 种属于分枝杆菌属的分离微生物，其特征在于包含以下基因的失活或缺失a p/w尸基因或者一个或多个调控p/2o尸基因或由/7/70尸调控的基因，以及b.防止DIM产生的第二基因。在本发明的 一种优选的实施方式中，本发明的分离樣i生物的特 4i在于，通过Rv0757基因的失活或在夬失来失活； /7o尸基因。在本发明的另 一种优选的实施方式中，本发明的分离樣史生物的 iHM正在于，通过Rv2930 (7^^D20基因的缺失或失活来失活DIM的 产生。在本发明的又 一 种优选的实施方式中，本发明的分离樣t生物的 特征在于，其包含Rv2930和Rv0757基因的缺失或失活。在本发明的另一种实施方式中，本发明的分离微生物的特征在 于，分枝杆菌属的物种属于结核分枝杆菌复合菌群。本发明的第二个方面涉及用于制备本发明的分离孩么生物的方 法，其包含a. 失活或缺失/ /w尸基因或一个或多个调控/ /zoP基因的基因， ^尤选失活或击夬失Rv0757基因，以及b. 失活或缺失防止DIM产生的第二基因，优选缺失或失活 Rv2930 (7a必2"基因。本发明的第三个方面涉及使个体免疫由肺结核引起的症状的 疫苗(下文中，称为本发明的疫苗)，其中所述疫苗包含至少一种 本发明的分离微生物。在本发明的一种优选实施方式中，疫苗还包含药物可^妾受的赋 形剂。本发明的第四个方面涉及用于制备药物、优选疫苗的方法，其 包含将本发明的分离微生物以治疗有效的剂量结合至用于给药于 人或动物的合适的介质中，并且选择性地添加药理学上适合疫苗生 产的赋形剂。所述药物适合用于治疗膀胱癌、治疗或预防肺结核，或作为载 体或佐剂。可优选地用来使个体免疫肺结核引起的症状。本发明的第五个方面涉及使用本发明的分离微生物从而制备 用于予贞防和/或治疗人类或动物力市结核的疫苗的应用。贯穿本说明书和权利要求，词语"包含"及其变化形式(variant) 并不表示排除其它的4支术特征、添加剂、成〗分或步骤。对于本领域 中的冲支术人员，本发明的其它目的、优势和特点将部分源自本i兌明 书，部分源自实施本发明之时。提供以下实施例和附图，作为本发 明的非限制性的示例性实施例。实施例实施例1. #才3十和方法/蛋白l提取^^龙瘦伊遊。分别在O、 4、 8、 12和16周获4寻 抗PhoP蛋白的多克隆抗体，其接受了 4剂量的PhoP(0.5mg)。使用 ELISA实'睑(ZEU-Immunotec Zaragoza，西班牙)才全测到抗-PhoP抗体。抗ESAT-6的单克隆抗体由S.Cole友好4是供[24]。分枝杆菌 的无细胞蛋白质^是耳又物是由在Middlebrook 7H9-ADC肉汤中生长的 对数生长期的早期培养物遵循常规方法制备而成[25]。结核分枝杆 菌蛋白质才是耳又物通过0.22 |um孑L径的Millex-GP过滤器(Millipore， Bedford, MA)进行过滤。收集培养了 5-6周的结核分枝杆菌H37Rv 培养滤液，用45% (w/v)的辟b酸铵沉淀培养滤液蛋白质。根据常规 方法进行免疫蛋白印迹分析。使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗 体(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)作为第二抗体。厶2 SC/D V、葳4染/,^"为N^Vf,。关于SCID小鼠的这项工作 是依照关于实验室动物保护的欧洲法律，在"Germans Trias i Pujol" 大学医院的动物管理委员会的监it下开展的。SCID CB-17/Icr Ico 无特定病原(spf)的小鼠从查理斯河(Bagneux Cedex，法国)获得。 为了进4亍喷雾感染，将小鼠置于空气感染装置(Glas-col Inc., Terre Haute, IN, USA)的接触室中。在喷雾器隔间中充满7ml结核分枝杆 菌悬浮液从而在肺中提供大约20活细菌的吸取量。每个实验组使 用10只小鼠。对于静脉感染，7只小鼠的组通过鼠尾侧脉感染200 pl含有相当于2xl05、 2xl04和2xl()3的活BCG和5.4 x 106、 5.4 x 105和5.4x04的活结核分枝杆菌/ /zo尸菌林的剂量的PBS。被处 理小鼠之间存活时间的差异的显著性通过使用Mantel-Haenszel检 验来确定。活菌计数这样进行连续稀释组织匀浆，涂抹于 Middlebrook 7H11 + OADC琼脂上，并在生长3周后进4亍分析。对 于组织学分析，将组织固定在曱醛-盐緩冲液中并包埋于石蜡中。切 下5卞m厚的切片并用Ziehl-Neelsen染泮牛染色。/.3 ^发T"凝神本发鄉的和SCG后，Ba/6/c V、葳哞细^^名 瘦激活的测定。4只Balb/c小鼠的组在皮下接种8xl03 CFU的BCG (Phipps)或2.5 x 103CFU的4^发明的S02菌林之后，在7、 14、 21、 28、 45和60天净皮处死。耳又出脾，》欠置至ij 2ml的RPMI i咅养基 和含有0.5mg/ml II型月交原酶(Worthington, NJ, USA)的10%胎牛血清和2U/ml脱氧核并唐核酸酶(GIBCO)中，在37。C下，以5%的C02， 培育1小时。然后^吏它们通过70 jim细胞筛(Falcon, Becton Dickinson 70 |am Nylon 35-2350 ),用注射器柱塞压石卒，并用培养基 洗涤。对细胞进行离心，去除上清夜，用裂解緩冲液去除红细胞[26]。 在离心和用RPMI培养基洗涤之后，将细胞重新悬浮在FACS緩沖 液(PBS 1 x , pH 7.2, 1% BSA)中，并计凄t。通过用抗-CD4-FITC或 抗画CD8-FITC的单克隆抗体i咅育106细胞来标记细月包表面，在4。C 下以1:20的比例在含有1%BSA和0.1%叠氮化钠的PBS中进4亍-希 释并保持20分钟，使用FACScan血细胞计数器进行分析。结核分枝杆菌H37Rv菌4朱在补充有OADC(Difco实验室， Difco Laboratories)的Middlebrook 7h9 i咅养基(Difco实马全室)中i咅 养。在培养l个月以后，分离细菌团(bacterial mass),收集培养滤 液。所述滤液的抗原用45% (w/v)的石克酸铵沉淀，对其进4于洗涤并 再次溶解在PBS中。为了刺激细胞，将lxl(^脾细胞重新悬浮在每 孔中100|ul RPMI培养基中，并用10 |Lig结核分一支杆菌培养滤液抗原 进4亍培育，在37。C下以5% c02悬浮在lOO]ul PBS中4呆持72小时。 对细胞和培养基进4亍离心，去除上清夜，在计凄t和4企测存活力之后， 如上所述，每管中2.5x105纟田月包在cd4+或cd8+细月包的表面上进行 标记。在洗涤之后，在溶解在PBS中的0.1%皂香中重新悬浮细胞 并于4。C下培育20分钟。通过用100 )ul标记有藻红蛋白(PE)的 单克隆抗-IFN-y的1/20稀释液，在4。C下对细月包进4亍黑暗下培养 20分钟来才全测细月包内ifn- y 。用100 4希释在PBS中的4%多聚 曱醛固定细胞。20分钟后使用FACScan血细胞计数器分析样品。 同型对照是Ab-FITC ( 1:20稀释液)十Ab匿PE ( 1:20稀释液)。a4-本犮鄉的S(92在^a/6/c V、葳^的沐护效力。遵循关于实-验 动物保护的欧洲指令，在巴黎的巴斯德研究所(Pasteur Institute) 的动物研究室(Animal Facility)的P3高安全实-验室(P3 High Security Laboratory )中，以受4空制的条4牛饲养所有的动物。Balb/c小鼠组(每组7只)在尾基部进行107CFU的本发明的S02菌抹或 BCG (Pasteur)的皮下4妄种。在4妄种后8周，对所有小鼠均静3永注 射2.5 x 105 CFU的结核分枝杆菌H37Rv。在注射后4周，小鼠祐二 处死。活菌计数这才羊进4亍连续稀释组织匀浆，在Middlebrook7H11 +琼脂OADC肉汤中培养，三周后基于S02菌4木的卡那霉素抗性表 型对本发明的S()2菌4朱的结核分4支杆菌H3 7Rv的生长进4于4企测。/.5-本^伊/的S(92 ^万豕武哞的/^护效力。使用豚鼠的实验工作 是根据关于实验动物的英国法律而开展的，并且经过了英国Porton Down的卫生^呆护木L构(Health Protection Agency )的当；也4仑J里委员 会(ethics committee)的i人可。站偉寸生Dunkin-Hartley月豕鼠是乂人纟至斗亥 准的供应商处(UK Home Office) (David Hall, Burton-on画Trent， UK 或Harlan Ltd UK, Bicester, UK)获4寻，对4也们进4亍完全隔离饲养。图 6中给出的结果显示S02菌4朱产生了优于BCG的保护。图13和14 中给出的结果显示S02突变体出乎预料的保护是由于其双表型 DIM-/尸/zoP-。入6-/庶^/,滋/帀。6支豚鼠的组在颈后部皮下接种250|iil: 5xl04 CFU的BCG Pasteur; 5xl04 CFU的本发明的S02;或生理盐水。在 如上所述使用包括Henderson仪器(contained Henderson apparatus ) 进行喷雾感染之前，使动物^木止12周[27]。使用Collison喷雾器， 由结核分冲支4干菌H37Rv的细樣i颗并立产生平均直径2|um(直径范围 0.5-7 pm)的喷雾，并且直4妄施用到动物的口鼻部。该喷雾由含有 2xl06 CFU/ml的水中的悬浮'液产生乂人而产生经计算大约为10-50 CFU/肺的保留吸入剂量。在施用后4周，评i"介^呆护。通过腹力莫应用过量的戊巴比妥钠来 处死动物。从脾和肺(左前叶和中前叶，右中叶和右后叶)中无菌 地耳又出组织，放置于无菌容器中。材料在-20。C下保藏，然后准备 进4亍纟田菌i十凄t。
4吏用^走寿争口十片；曼；责系纟充(rotating blade maceratorsystem) ( Ystral) 4吏组织在10ml (肺)或5ml (脾)的无菌去离子 水中均质化。活细胞计^t这样进行连续稀释组织匀浆，在 Middlebrook 7H11 +琼脂OADC中培养，并在3周后4企测结核分 枝杆菌的生长。将数据转换为logw从而对其进行分析，并通过学生 氏t测验将每个疫苗组的活结核分枝杆菌的数量与接种生理盐水的^于照ia进4亍比4交。7. 7"豕i〖^/惑染,寄刺量的錄類—为V乂Vf,y^的/^^^试。在喷雾 施用结核分枝杆菌的前10周，对6只豚鼠的组皮下4妻种5 x 104 CFU 的本发明的S()2或BCG (Danish 1331)。才艮据前面段落中所才皮露的 进行喷雾施用设作，使用5 x 107CFU/ml的悬浮液从而为肺部提供 大约500CFU。施用之后，在第3等级的防护下(ACDP)饲养动物， 定期控制其重量改变，并在施用后180天或者在人道终点(失去最 大体重的20%)人道地处死它们。如上所述地进行死后样品的收集 和处理，除了使用在福尔马林中固定，用苏木精和伊红(H-E)染 色的肺部组织切片的图像分析来测量肺部实变。使用Kaplan Meier 存活评^介来比4交动物的存活，4吏用Log Rank分布分析来确定统计 显著性差异。通过ANOVA分析CFU和损伤实变数据，使用Fisher 氏成对比4交来比 一交组的平均值。实滋辦2潜核为V饼,—尸的特性通过观察细菌大小和具有失活的p/2o尸基因的生长细胞的索状 净争4生(cording property),为p/20尸基因参与分沖支4干菌的遗^(专回^各 (genetic circuit)的全局调控提供了证据。已知分泌抗原作为抵抗 月市结核的^f呆护作用的决定性因素的关4建特性，我们希望确定； /20尸 基因突变的多向性效果是否延伸为影响主要的免疫显性抗原 ESAT-6的合成。对S02菌4朱、BCG和MT103使用诱导的抗PhoP 蛋白和ESAT-6的抗体进4亍免疫蛋白印迹分析。结果清楚地显示 PhoP蛋白在结核分枝杆菌MT103和BCG菌才朱中进4亍组成性表达，而在本发明的S02菌抹中则才艮本不存在。相反，在S02菌抹 的培养物的上清4支中ESAT-6的表达水平与/人MT103的亲本菌4朱中 才全测到的相似，并且正如所泮牛，在BCG中没有4企测到ESAT-6蛋白。/惑染f本发效的,祷和5CG的小葳的存活在喷雾感染(大约20CFU ) MT103菌4朱、S02和补偿/ /zoP基 因的S02(S02 + pS05)之后评价免疫低下SCID小鼠的存活[23]。所 有感染S02的小鼠存活超过245天。相反，所有感染MT103或补 偿的结核分枝杆菌S02-pS05的SCID小鼠在感染后62天已经死 亡，这表明补偿菌林的毒力的回复(图2a)。在静脉给药之后，还对SCID小鼠中S02菌抹的减毒与BCG 进4亍比專交。SCID小鼠组通过尾部侧月永4妄种多种剂量(2 x io5、 2x 104 ,口 2 x io3 CFU )的BCG Pasteur或S02菌才朱(5.4 x io6、 5.4x 105和5.4 x 104 CFU )。在感染后3周而^皮处死的小鼠亚组的感染 肺泡巨噬细胞的组织学染色显示，与BCG相比，感染结核分4支杆 菌S02菌4朱的小鼠的肺中的耐醇-酸细菌的凄t量4交少。所有4妄种專交 高剂量BCG ( 2 x 105 CFU )的BCG的小鼠在感染后92天已经死亡(平均存活时间89 ±3.5天)(图2b)。相反，所有感染最高剂量 的SO (5.4x 106CFU)的小鼠在120天后存活(图2b )。在死亡时， 感染2x 105CFU的BCG的小鼠的肺中的细菌负^f，如果与感染5.4 xl06CFU的S02的小鼠相比，至少高10(H咅。^滋斧i/ 4 Sa/6/c V、葳的定量和CDS+及^"。为了比较通过接种本发明的S02和BCG所引起的细胞免疫激 活作用，在^妻种后7、 14、 30、 45和60天，乂人皮下4妻种有本发明 的S02菌4朱和BCG Phipps的至少4只5a/6/c小鼠组的脾中收集细 月包悬浮液，并通过细月包荧光测定术来确定CD4+和CD8+细月包的相对比例(图3 )。在接种后14天，S02^妄种与BCG接种相比，产生 显著较多数量的CD4+细胞，并在45天后产生显著较多数量的 CD8+细胞。这些脾细胞用来源于结核分枝杆菌培养滤液的总抗原 刺激。3天之后，通过流式细胞仪分析淋巴细胞的数量，结合特异 性抗体来4企测01)4+/008+细胞和IFN- Y的胞内合成。在4妾种45天 之后，与BCG相比，S02接种引起显著较高比例的CD4+/IFN- y + 产生细月包(图3 )。在特定的时间点之后，在S02组中的产生CD8+/ IFN-y+的细胞的比例始终较高(在14天显著不同)。,滋辦5 /h/6/c V、成^适过本发效的5(92 ,J^的沐护^^瘦。已经证明本发明的S02菌抹在SCID小鼠中被减毒，我们想要 确定观察到的毒力的减弱是否在突变菌抹上会产生某种保护特性。 我们对Balb/c小鼠皮下4妻种本发明的S02菌才朱或BCG (Pasteur)。 在接种后8周，对所有小鼠静脉注射2.5 x 105 CFU的结核分枝杆 菌H37Rv。在注射后4周小鼠一皮处死。通过测量/人两组小鼠的肺和 脾回收的活结核分枝杆菌H37Rv的lt量来确定〗呆护水平(图4)。 如果与以生理盐水处理的对照相比，两种疫苗都产生了相似却又显 著的保护水平(p<0.05)。在肺中和脾中都记录到了结核分枝杆菌 H37Rv生长的抑制，分别减少了大约1.5 1ogK)和1.3 1ogl。CFU。《施斧j/ 6本发鄉的5(92在万豕歲^的沐护#名瘦在小鼠接种实验中获得的结果显示本发明的S02菌抹的减毒 4吏它具有与BCG Pasteur相似的疫苗特性。j旦是，普遍认为豚鼠是 人类肺结核更合适的模型，由于在疾病的发展和病理学方面具有许 多相似性。因此这种动物才莫型是用于评1介疫苗的效力的更合适的系 统。为了研究本发明的S02菌抹的保护效力，我们开展了这样的实 验，其包括以低剂量(10-50 CFU)和高剂量(500 CFU)对接种的动物 进行喷雾施用。对6只豚鼠的组进行皮下接种本发明的S02或者BCG。接种后10周，对所有的豚鼠给药结核分枝杆菌H37Rv的吸 入剂。接受低剂量的动物在4周后处死，计数肺和脾中的细菌负荷。 通过比4交乂人每个处理组的"豕鼠的器官中回收的活结核分枝杆菌 H37Rv的数量来确定保护效力。在这个实验中，在未接种的对照动 物和那些^妻种BCG或结核分枝杆菌S02的动物之间，肺和脾中 CFU的减少是显著不同的(口=0.005)。 ^f旦是4妻种的组之间没有发现显 著性差异(图5 )。接受高剂量的豚鼠在施用180后天或者当发现失去了 20%的体种/未感染的动物中观察到的进行比较。在吸入后的实验阶段中，所 有的未4妻种J豕鼠和4只4妾种BCG的月豕鼠由于严重和不断积累的疾 病，在时间终点(time end point) ( 180天)之前、在人道终点净皮处 死(图6a)。相比之下，所有接种本发明的S02菌抹的豚鼠在本研 究持续期间一直存活下来。接种本发明的S02菌抹的豚鼠的存活显 著长于那些接种BCG的豚鼠(p = 0.018),而接种BCG的豚鼠的 存活又显著长于用生理盐水处理的对照豚鼠(p = 0.0049)。另夕卜， 接种S02菌林的豚鼠体重增加并且没有表现出任何疾病的可见或 临床体征。通过总的肺实变测量的肺部疾病的程度在不同的处理组之间 也有所不同。正如所预碎+的，在未4妄种的豚鼠中，乂见察到疾病的最 高发展7jc平，在该组动物中，测量到76%的实变的平均百分比(图 6b、 6c)。在接种BCG的豚鼠中肉芽肺的聚结也4艮明显，其中在肺 中测量到70%的平均实变。相反，在接种本发明的S02菌4朱的力参鼠 中观察到4交少的实变(大约50%)，这种实变显著地少于(pO.05)未 4妄种的动物和那些4妻种BCG的动物(图6c)。通过在月申和脾的组织匀浆中的细菌计数还反映了病情严重程度的降低。在接种的组中，在两种器官中都 见察到了对于结核分一支杆菌H37Rv生长的抑制水 平的差异。与接种BCG的豚鼠相比，从接种S02的豚鼠中回收的 CFU的凄t量减少了 lxlogK)以上，并且在脾中这种减少在统计学上 是显著的(p<0.05)(图6d)。这些数据表明，本发明的S02菌株在 赋予感染的豚鼠较高的存活率，降低肺中疾病的严重程度以及防止 感染扩散到力卑的方面，是优于BCG的。实滋斧^7本发鄉的S02的减#^€由亍尸/zo尸-Z)/M-双^f 。在Balb/C小鼠中通过静脉注射S02 (phoP-DIM-)菌林和野生型 MT103菌林以及补偿phoP (S02 + pS05)的菌林进行比较的感染研 究表明，通过静脉注射在Balb/C小鼠中感染S02的减毒不会通过 才卜^f尝phoP而回复。3和6周后测量到的脾(7a脾)和肺(7b肺) 中的菌落(CFU)的减少不会在补偿菌林中被回复，因为它在免疫 活性小鼠中是无毒的，这些实验表明出乎预料的减毒可能是由于第 二附加突变(图7)。通过薄层色i普法对结核分枝杆菌不同菌林的脂质研究表明， S02菌4朱不产生DIM,并且这与phoP突变无关(图8 )。为了表明S()2是无毒的，对6只豚鼠接种50倍的疫苗剂量。 经过持续6个月的实-验之后，存活率是100%。经过6个月，在所 有的动物中观察到了体重增加，表明S02菌抹的无毒性(￥=重量 (以克计)和感染周。X二时间(以周计))(图12)。还研究了对于抗肺结核药物的敏感性。确定抗肺结核药物乙胺 丁醇、异烟肼、利福平和纟连霉素抗结核分一支杆菌菌一朱H37Rv、作为 对照的MT103 (野生型)和S02菌一木的最小抑制浓度(MIC )。数值(微克/ml)显示/ /7o尸基因失活后，S02候选疫苗菌林保留了其 对临床使用最普遍的抗肺结核药物的敏感性。乙胺丁醇 异烟肼 利福平 链霉素H37Rv2 0.5 < 0.004 <0.5MT1032 0.5 < 0.004 <0.5S02 2 0.25 < 0.004 <0.5在气管接种的BalbC小鼠中的减毒研究显示，用结核分枝杆菌 DIM- (1A29)菌抹有50%的小鼠存活到了 20周之后。所有接种S02 (phoP-和DIM-突变体)的动物都出乎预料地存活了 20个实-验周 (图11 )。对4姿种并通过喷雾感染结核分斗支4干菌H37Rv的豚鼠中的〗呆护 进行研究。豚鼠存活到了 300天之后。在皮下接种之后，动物以高 剂量感染结核分枝杆菌(H"Rv)的毒性菌林以研究存活。在60天 之后，没有,皮4妄种的6只月豕鼠已死亡，而4妄种S02, p/2oP-和BCG 的组存活。在感染300天之后，3只4妄种BCG和/ / oP-的月豕鼠已 死亡，相比之下^妻种S02的组中^f又有一只死亡，这表明/ /w尸突变 体的保护类似于现有疫苗BCG，而接种S02， phoP-和DIM-双 突变体在豚鼠模型中保护作用更好(图13 )。这些在豚鼠中的保护研究持续了 400天，但在60天之后有6 只未4妻种的力豕鼠已经死亡。在感染400天之后，3只来源于4妄种S02 的组的豚鼠(图14a)存活，而只有1只接种BCG (图14a和14b) 和phoP-(图14b)的豚鼠存活，这再次表明p/zo尸突变体的保护类似于BCG,而4妻种S02， phoP-和DIM-双突变体在400个实-验 日后保护作用更好。实滋辦9差于遞过/a6/D26差^缺关的^史采沟建候逸席「潜^"瘦麥用于构建缺失fadD26 ( zV^/D26 )基因的突变体的结核分枝杆 菌菌一朱是S()2 (其含有通过插入卡那霉素抗性基因(cassette)而失 活的p/zo尸基因)和MT103临床菌才朱。1. 质并:i的构建1.1克隆参与DIM合成的/at氾26基因。使用来自结核分枝杆 菌H37Rv的基因组DNA并4吏用引物fadD26Fw (SEQ ID NO:l)和 fadD26Rv (SEQ ID NO:2)，通过PCR扩增基因。将PCR产 物4翁入pGEM-T Easy载体(Promega)中乂人而构建质4立pAZl。1.2 /aJD26基因的缺失和潮霉素抗性基因的插入。在pAZl中 /a^D26的Z awHI-EcoRV位点之间插入pWM27 (Malaga等2003) 的5awHI-五coRV片断，该SamHI-五coRV片断含有res-Q/^g-res基因(由解离酶识别的res位点使得在第二传代中消除抗性标记成为 可能)。1.3用于通过同源重组失活基因的自杀载体(suicide vector )的 构建。用X/wI消化质粒pAZ3，释放/"(iD26::n/^g插入片断，将其 整合到pJQ200X载体中，以相同的酶使其线性化。最终的质粒命 名为pAZ5。2. 结核分枝杆菌DIM-菌4朱的构建。2.1将质粒pAZ5插入结核分枝杆菌S02和MT103菌4朱中。2.2单一重组子的筛选。在潮霉素(20 iug/ml)中培养包含质粒的 细菌，测它对庆大霉素(10 |ag/ml)的抗性。2.3双重组子的筛选。在2%蔗糖(Pelicic等1997 )和潮霉素中 培养单一重组子，并检测它们对庆大霉素的敏感性。3>人4/^//)26突变中去除抗生素抗性标记。3.1为了去除res-Q/^g-res基因并产生不具有抗生素抗性标i己的 突变，插入含有^解离酶的质粒pWM19并通过庆大霉素抗性进行 筛选。然后通过在39。C下在2%蔗糖中培育/人而去除质粒(Malaga 等2003 )。实施例2.2-用于构建缺失Ap/zaP A/^/D26的双突变体的结核 分4支杆菌菌才朱是MT103 A/^/D26。4.质4:i的构建4.1 / /zoP基因的克隆。使用结核分枝杆菌H37Rv的基因组 DNA并^f吏用引物phoPF ( SEQ ID NO:3 )和phoPR( SEQ ID NO:4 )， 通过PCR扩增p/zo尸基因。将PCR产物插入pGEM-T Easy载体 (Promega)中从而构建质粒pAZll。4.2户/w尸基因的缺失和卡那霉素抗性基因的插入。在pAZll中 p/zoP的5c/I-H'oRV位点之间插入含有res-QAw-res基因的pCG122 的5awHI-五c'oRV片断(Malaga等2003)/人而构建pAZ13。4.3用于通过同源重组失活基因的自杀质并立的构建。用1/wl质 粒消化pAZ13，释方文p/zo尸::QAm插入片断，将其整合到pJQ200X 载体中，用相同的酶使其线性化。最终的质粒命名为pAZ15。5. 结核分枝杆菌Ap/70尸A/a^D26双突变体菌林的构建。5.1将质粒pAZ15插入结核分冲支杆菌MT103 A/^/Z)26菌4朱中。5.2单一重组子的筛选。在卡那霉素(20 lag/ml)中培养包含质粒 的细菌并一全测其对庆大霉素(10 |ug/ml)的抗性。5.3双重组子的筛选。在2%蔗冲唐(Pelicic等1997)和卡那霉素 中培养单 一 重组子并一企测其对庆大霉素的每丈感性。6. 乂人Ap/zo尸突变中去除4元生素^U生才示i己。6.1为了去除res-Q々m-res基因并产生没有抗生素抗性标记的突 变，插入含有Y5解离酶的质粒pWM19,并通过潮霉素抗性(20iug/ml) 进4亍筛选。然后通过在39。C下在2%蔗净唐中培育乂人而去除质粒 (Malaga等2003)。参考文献1. 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权利要求
1.一种属于分枝杆菌属的分离微生物，其特征在于，所述分离微生物包括以下基因的失活或缺失a)phoP基因或者一个或多个调控所述phoP基因或由phoP调控的基因，以及b)防止DIM产生的第二基因。
2. 根据权利要求1所述的分离微生物，其中所述/ /20尸基因通过Rv0757基因的失活或在夹失而#:失活。
3. 根据权利要求1或2中任一项所述的分离微生物，其中DIM 的产生通过Rv2930 (/a^D2。基因的击夹失或失活而净皮失活。
4. 根据权利要求3所述的分离微生物，其中所述微生物的特征在 于，其包含所述Rv2930和Rv0757基因的击夹失或失活。
5. 根据前一项权利要求中任一项所述的分离微生物，其中所述分 枝杆菌属的物种属于结核分枝杆菌复合菌群。
6. 用于构建才艮据权利要求1-5中任一项所述的分离樣i生物的方 法，其包括a) 失活或缺失所述；7/zo尸基因或者一个或多个调控所述 p/2o尸基因或由/7/w尸调控的基因，以及b) 失活或在夹失防止DIM产生的第二基因。
7. 根据前一项权利要求所述的方法，其中所述phoP基因通过所 述Rv0757基因的失活而^皮失活。
8. 才艮据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中DIM的产生 通过Rv2930 (/a^D20基因的缺失或失活而被失活。
9.权利要求1-5中任一项所述的分离^f鼓生物。
10. 4艮据前一项权利要求所述的疫苗，其还包括药理学可4妾受的赠〔形剂。
11. 用于制备根据权利要求9-10中任一项所述的用于免疫接种或 预防由肺结核引起的症状的疫苗的方法，其至少包括a) 将才艮据权利要求1-5中任一项所述的分离樣t生物以治 疗有效剂量并入适于^于人类或动物纟会药的介质中，以及b) 可选地添加药理学上适合于生产疫苗的赋形剂。
12. 根据权利要求1-5中任一项所述的用作药物的分离微生物。
13. 根据权利要求1-5中任一项所述的用作疫苗的分离微生物。
14. 根据权利要求12或13中任一项所述的用于治疗膀胱癌的药物。
15. 才艮据—又利要求12或13中任一项所述的用于治疗或预防肺结核 的药4勿。
16. 根据权利要求12或13中任一项所述的作为载体或者佐剂的药物。
17. 根据权利要求1-5中任一项所述的分离微生物在制备根据权 利要求9或10中任一项所述的用于预防或免疫4妄种人类或动 物的月市结核的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种属于分枝杆菌属的分离微生物，其特征在于其包括使赋予PhoP-表型的基因Rv0757失活，以及使防止DIM(DIM-表型)产生的第二基因失活。另外，本发明包括使用所述微生物来生产用于免疫接种或预防肺结核的疫苗。
文档编号C12N1/20GK101405386SQ200780010366
公开日2009年4月8日 申请日期2007年3月14日 优先权日2006年3月24日
发明者卡洛斯·马丁蒙塔涅斯, 埃斯特·佩雷斯埃朗, 布里吉特·吉凯尔, 热苏斯·贡萨洛阿森西奥, 艾因霍阿·阿韦斯阿里瓦斯 申请人:萨拉戈萨大学