专利名称：用于检测和/或分选靶标的方法和系统的制作方法
技术领域：
本公开内容涉及在样品如生物样品中检测一种或多种耙标，尤其是生 物标志物。更具体地，其涉及用于检测和/或分选耙标的方法和系统。
背景技术：
靶标(尤其是生物标志物)的高灵敏度检测是生物分子分析领域中的 一个挑战，尤其是在企图检测多种耙标时。无论是用于病理学检查还U 础生物学研究，都有若干方法"fi4用于检测多种类别的生物材料和生物分 子。
在实验室中普遍用于检测单个生物耙标的一些技术包括凝胶电泳、聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、 western印迹、荧光原位杂交(FISH)、荧光活 化细胞分选(FACS)、聚合Sl^式反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。 这些方法提供了在生物样品如组织中检测一种或多种生物标志物的能力， 并且也适用于诊断目的。
然而，目前对组织的全局性基因组及蛋白质组学分析正在影响我们在分子水平上对许多人类癌症的理解。整合了基因表达和蛋白组学数据二者 的研究尤其具有信息性。这类多参数数据集已开始揭示定义癌症发生和发
展的混乱的调节网络(Lin, B.; White, J. T.; Lu, W.; Xie， T.; Utleg, A. G; Yan, X.; Yi， E. C; Shannon, P.; Khretbukova， I.; Lange, P. H.; Goodlett, D. R.; Zhou, D.; Vasicek, T. J.; Hood, L. 2005, 65, 3081-3091. Kwong，
K. Y.; Bloom, G C; Yang, I.; Boulware, D.; Coppola, D.; Haseman， J.; Chen, E.; McGrath， A.; Makusky, A. J.; Taylor, J.; Steiner， S.; Zhou， J.; Yeatman， T. J.; Quackenbush, / Ge"0附1cs 2005， 86， 142-158. Huber, M.; Bahr, L; Kratzchmar, J. R.; Becker, A.; Muller， E.-C; Donner, P.; Pohlenz, H.画D.; Schneider, M. R.; Sommer， A. Molec. Cell. Proteomics 2004, 3， 43-55. Tian， Stepaniants, S. B.; Mao, M.; Weng， L.; Feetham， M. C; Doyle， M. J.; Yi, E. C; Dai, H.; Thorsson, V.; Eng, J.; Goodlett, D.; Berger, J. P.; Gunter， B.; Linseley, P. S.; Stoughton, R. B.; Aebersold, R.; Collins, S. J.; Hanlon， W. A.; Hood, L. E. Molec. Cell. Proteomics 2004， 3, 960-969. Chen, G; Gharib，. T. G; Huang, C-C; Taylor, J.M. G; Misek, D. E.; Kardia， S. L. R.; Giordano, T. J.; lannettoni, M. D.; Orringer， M. B.; Hanash， S. M.; Beer, D. G Molec. Cell. Proteomics 2002,1, 304-313)。对复杂疾病如癌症的这种新情 况以及有前途的新癌症药物的出现(Prados, M.; Chang, S.; Burton， E.; Kapadia， A.; Rabbitt， J.; Page, M.; Federoff， A.; Kelly, S.; Fyfe, G Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 2003， 22， 99. Rich, J. N.; Reardon, D. A.; Peery, T.; Dowell， J. M.; Quinn， J. A.; Penne, K. L.; Wikstrand， C J.; van Duyn, L. B.; Dancey, J. E.; McLendon, R. E.; Kao， J. C; Stenzel， T. T.; Rasheed, B. K. A.; Tourt-Uhlig， S. E.; Herndon， J. E.; Vredenburgh， J. J.; Sampson, J. H.; Friedman, A. H.; Bigner, D. D.; Friedman, H. S. J. Clin. Oncology 2004, 22， 133-142.)对临床病理学提出了新的要求(Mellinghoff, I. K.; Wang， M. Y.; Vi窗co, I.; Haas國Kogan, D. A.; Zhu, S.; Dia, E. Q.; Lu, K. V" Yoshimoto, K，； Huang, J, H. Y" Chute, D. J.; Riggs， B. L.; Horvath， S.; Liau.， L M.; Cavenee, W. K.; Rao， P. N.; Beroukhim, R.; Peck, T. C; Lee, J. C; Sellers, W. R.; Stokoe， D.; Prados, M.; Cloughesy, T. F; Sawyers, C. L.; Mischel， P. S. N. Engl. J. Med. 2006,353， 2012-2024)。例如，传统的病理学实践(即组 织的显^t镜分析)不能区分对新的癌症分子疗法的潜在应答者和非应答者 (Betensky， R. A.; Louis, D. N.; Cairncross， J. G J. Clin. Oncology 2002， 20, 2495-2499)。最近有这样的实例，其中少量参数(pauciparameter)分子测量
法被用于鉴定对至少两种疗法的潜在应答者(Hughes, T.; Branford, S.,2003. Semin Hematol. 2 Suppl 2, 62-68. Lamb, J.; Crawford, E. D.; Peek, D.; Modell， J. W.; Blat， I. C; Wrobel， M. J.; Lerner， J.; Brunet， J. P.; Subramanian， A.; Ross, K. N.; Reich, M.; Hieronymus, H.; Wei， G; Armstrong, S. A.; Haggarty, S. J.; Clemons， P. A.; Wei， R.; Carr, S. A.; Lander, E. S.; Golub， T. R., Science 2006, 313, (5795)， 1929-1935. Martin, M.， CHn. Transl Oncol. 8, (1 )， 7-14. Radich, J. P.; Dai, H.; Mao, M.; Oehler, V.; Schelter， J.; Druker， B.; Sawyers, C. L.; Shah, N.; Stock, W.; Willman, C. L.; Friend, S.; Linsley, P. S.,TVarf.Sc/. 2006， 103, (8)， 2794-2799)。然而，单^lt测量法不太可能成为脊逸情况。取而代之， 分子诊断学与分子疗法的联合最^需要测量多参数(例如细胞、mRNA 和蛋白质)生物标志物组合，其可用于指导患者进行适当的疗法或组合疗 法。
目前，测量来自患病组织的多参数生物标志物组合需要组合显微镜分 析、微阵列数据(Mischel， P. S.; Cloughesy, T. F.; "Nelson, S. F. Nature Rev. Neuroscience 2004， 5， 782- 794)、免疫组织化学染色、Western印迹 (Mellinghoff， I. K.; Wang, M. Y" Vivanco, I.; Haas曙Kogan, D. A.; Zhu, S.; Dia, E. Q.; Lu， K. V.; Yoshimoto， K.; Huang, J. H. Y; Chute, D. J.; Riggs, B. L.; Horvath, S.; Liau., L. M.; Cavenee， W. K.; Rao, P. N.; Beroukhim, R.; Peck， T. C; Lee, J. C.; Sellers, W. R.; Stokoe， D.; Prados, M.; Cloughesy, T. F.; Sawyers, C. L.; Mischel， P. S. N. Engl. J. Med. 2006， 353, 2012- 2024)和 其他方法。将收集的数据整合进一些疾病模型中以产生诊断，所i^型例 如癌症途4圣模型(Weinberg, R. A.， Cancer Biology. Garland Science: 2006)。 目前，进行这些多种测量法需要外科手术切除的组织样品。这类活检样品 的异质性可导致显著的取样误差，因为细胞、mRNA和蛋白质的多种测量 各自在组织的不同区域进行。
发明概述
本文提供了基于将以多核苷酸编码的蛋白质与衬底多核苷酸组合使用 的方法和系统。本文公开的以多核普酸编码的蛋白质由特异性结合乾标的 蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核香酸组成。所述编码多核普酸由特异 性结合衬底多核苷酸的序列组成。本文公开的衬底多核普酸附着于衬底， 并由特异性结合所述编码多核普酸的序列组成。根据本文公开的方法和系统可以进行多种测定，包括但不限于用于检 测和/或分离靶标的测定，所述耙标尤其是生物标志物，例如细胞、蛋白质 和/或多核苷酸。具体地，在使用本文公开的方法和系统的测定中，使用以
结合乾标，并使用衬底多核苷酸将所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合 体与衬底结合用于检测。如技术人员阅读^^开内容后显而易见的，本文 公开的方法和系统允许产生若干测定的有利性能，尤其是在微流体
(microfluidic)环境中。
根据第一个方面，z〉开了检测样品中乾标的方法和系统，该方法和系 统基于组合使用附着于衬底的衬底多核普酸与以多核普酸编码的蛋白质， 所述以多核苷酸编码的蛋白质由蛋白质和编码多核苷酸组成，所述蛋白质 特异性结合把标，所述编码多核苷酸特异性结合附着于衬底的衬底多核苷 酸。
在该方法中，将以多核苷酸编码的蛋白质与样品及衬底多核苷酸在 一定条件下接触一定时间，以允许该以多核苷酸编码的蛋白质在以多核 苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中与靶标结合，并且允许编码多核苷酸 与衬底多核苷酸结合，从而提供与衬底多核香酸结合的多核普酸编码蛋 白质-靶标复合体。在该方法中，随后通过技术人员阅读本公开内容后 可识别的检测技术来检测与衬底多核香酸结合的多核香酸编码蛋白质-靶标复合体。
在该系统中，将衬底与多核苷酸编码蛋白质一起提供，所述衬底带 有附着于该衬底的衬底多核苷酸，所述多核苷酸编码蛋白质包含特异性 结合靶标的蛋白质和特异性结合衬底多核苷酸的编码多核普酸。
根据第二个方面，公开了用于检测样品中多种靼标的方法和系统，该 方法和系统基于组合使用附着于衬底的多种衬底多核苷酸以及多种以多 核苷酸编码的抗体。
在该方法和系统中，各种衬底多核普^A序列特异性的，并且在位置 上可彼此区分。在该方法和系统中，每种多核苷酸编码蛋白质由蛋白质和 附着于该蛋白质的编码多核苷酸组成，其中所述蛋白质与多个靶标的预定 靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特 异性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。另外，在该方法和系统中，各种蛋白质和编码多核普酸在结合方面可彼此区分。
在该方法中，将多种多核苷酸编码抗体与样品和多种衬底多核普酸在 一定条件下接触一定时间，以允许抗体与靶标在多种多核苷酸编码蛋白质 -靶标复合体中结合，并允许编码多核苷酸与衬底多核苷酸结合。在该方法 中，随后通过技术人员阅读本公开内容后可识别的检测技术来检测与衬底 上多种衬底多核苷酸结合的多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。
在该系统中，包括了衬底和多种多核苷酸编码抗体，所述衬底带有附 着于该衬底的多种衬底多核苷酸。
根据第三个方面，公开了用于检测样品中多种靶标的方法和系统，其 中所述耙标包含至少一种靶多核苷酸。该方法和系统基于组合使用附着于 衬底的多种衬底多核苷酸、至少一种多核苷酸编码蛋白质和至少一种经标 记多核苷酸。
在该方法和系统中，各个村底多核苷^A序列特异性的，并且在位置 上可彼此区分。在该方法和系统中，所述至少一种经标记多核普酸与至少 一种靶多核苷酸特异性结合，各种经标记多核苷酸在结合方面可彼此区 分。在该方法和系统中，所述至少一种多核苷酸编码蛋白质由蛋白质和编 码多核苷酸组成，所述蛋白质特异性结合所述多种靶标中的预定靶标，所 述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特异性且位置可区分的 衬底多核苷酸特异性结合。在该方法和系统中，各蛋白质和编码多核苷 酸在结合方面可彼此区分，各蛋白质还与各种经标记多核香酸在结合方 面可彼此区分，且各多核普酸编码蛋白质与各种经标记靶多核苷酸在结 合方面可彼此区分。
在该方法中，将所述至少一种经标记多核苷酸与样品在一定条件下接 触一定时间，以允许经标记多核苦酸与耙多核香酸结合，从而拔 映至少一 种经标记靶多核苷酸，其中所述至少一种经标记靶多核苷酸由这样的序列 组成，所述序列与序列特异性且位置可区分的衬底多核普酸特异性结合。 此外，在该方法中，将所述至少一种多核普酸编码蛋白质与样品在一定条 件下接触一定时间，以允许该蛋白质与靶标在至少一种多核普酸编码蛋白 质-靶标复合体中结合。另外，在该方法中，将所述至少一种经标记的靶多 核苷酸和所述至少一种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体与多种衬底多核 苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述至少一种经标记的靶多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合，并允许所述至少一种编码多核苷酸与相应
的衬底多核苷酸结合。在该方法中，NL^通过使用技术人员在阅读4^Hf 内容后可识别的检测技术来检测与衬底上空间定位的多种村底多核苷酸 结合的经标记乾多核苷酸和多核普酸编码蛋白质-乾标复合体。
在该系统中，包括了衬底以及至少一种经标记多核苷酸和至少一种多 核苷酸编码蛋白质，所述衬底带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸。在 该系统中，该系统的至少一种经标记多核苷^A用于生产标记的靶多核苷 酸，所述经标记的靶多核苷酸与序列特异性且位置可区分的衬底多核苷酸 特异性结合。
根据第四个方面，公开了用于分选多种靶标中的靶标的方法和系统， 该方法和系统基于组合使用附着于衬底的多种衬底多核苷酸以及多种多 核苷酸编码抗体。在一些实施方案中，靼标是细胞，该方法和系统用于分 选多种细胞。
在该方法和系统中，各衬底多核香^A序列特异性的且在位置上可彼 此区分。在该方法和系统中，各多核苷酸编码蛋白质由蛋白质和附着于该 蛋白质的编码多核苷酸组成，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的预定靶 标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特异 性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。在该方法和系统中，各蛋白 质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分。
在该方法中，将多种多核苷酸编码抗体与样品在一定条件下接触一定 时间，以允许抗体与靶标结合，从而提供多种多核香酸编码蛋白质-耙标 复合体。在该方法中，然后将多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体与 多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许该编码多核苷酸 与附着于衬底的衬底多核苷酸结合，从而在与衬底结合的多种多核苷酸 编码蛋白质-靶标复合体中分选耙标。
在该系统中，包括了衬底和多种多核普酸编码抗体，所述衬底带有附 着于该衬底的多种衬底多核苷酸。
根据第五个方面，公开了用于检测样品流体中一种或多种粑标的阵列， 该阵列包含衬底，所述衬底带有附着于所述衬底组件的多种衬底多核苷 酸，该衬底多核苷酸序列是特异性的并在位置上可区分，其中各衬底多核
14苷酸由与另一衬底多核苷酸序列互不影响(orthogonal)的序列组成。
根据第六个方面，本文公开的各方法、系统和阵列中的衬底与微流体 组件有效关联，所述微流体组件包含用于装载流体的微流体构件。因此在 该方法中，至少编码多核苷酸和/或经标记多核苷酸乾标与衬底多核苷酸的 接触可在微流体构件装载的流体中进行。另外，本文公开的各系统还可包 含具有微流体构件的微流体组件。
本文公开的方法和系统的第一个优点是，在本文>^开的各方法和系统 中，多核普酸编码蛋白质与靶标的接触可在该蛋白质与衬底结合之前进 行。因此，在使用诸如细胞的靶标时，衬底不会损害靶标对蛋白质结合位 点的接近，且在进行接触时蛋白质和靶分子均会具有完全的取向自由，从 而提高了用所公开方法和系统进行的任何相关测定的灵敏度。
本文公开的方法和系统的第二个优点是，在本文公开的各方法和系统 中，多核苷酸编码蛋白质可在溶液中装配，从而使现有技术方法相关的蛋 白质变性作用最小化，所述现有技术方法包括在结合后干燥衬底和提高温 度(例如接近100"C )。在一些这类现有技术方法中，通过使用细针(fine pin) 在玻璃衬底上点样(spotting)来产生蛋白质阵列，从而制造步骤需要密切监 测，以确保蛋白质不干燥过度并因而变性。相反，在本文公开的方法和系 统中，可在溶液中将蛋白质装配在衬底上，从而将蛋白质干燥过度和变性 最小化至零。
本文公开的方法和系统的第三个优点是，在本文公开的各方法和系统 中，生物污着(biofouling，即非编码蛋白质与衬底的非特异性结合)与本 领J^于蛋白质的方法和系统相比大幅降低，从而允许更有效的结合，并 且允许在期望进行检测时，与本领咸基于抗体的方法和系统相比更精确地 定量检测样品中的乾分子。
本文公开的方法和系统的第四个优点是与本领域基于蛋白质的方法和 系统相比，能够进行更高靶标数的多路(multiplexed)检测和/或分离。这归 因于若干个因素。第一个因素是与组合使用多核苷酸编码蛋白质和附着于 衬底的衬底多核苷酸相关的生物污着降低允许更有效地使多核苷酸编码 蛋白质-靶标复合体与衬底结合并进行检测。第二个因素是在本文公开的方 法和系统中，衬底多核苷酸的尺寸与本领g于蛋白质的方法和系统中使 用的相应锚定分子相比小得多。因此，与现有技^M目比，可在衬底上装配更高密度的蛋白质(例如每平方英寸约5,000个点，相比于例如ELISA技 术的96孔板)。
本文公开的方法和系统的第五个优点是在本文公开的各方法和系统 中，有可能在单个衬底中检测并分离化学性质不同的靶标，包括生物标志 物如多核普酸、蛋白质和具有不同表面标志物的细胞。因此，本文爿〉开的 方法和系统允许在相同的环境中对基因、蛋白质和细胞进行多路检测和/ 或分离。
本文公开的靶标分选方法和系统的又一个优点是，本文公开的方法和 系统使得分选后的细胞可立刻用于分选后分析(post-sorting analysis),这在 靶标是能够用于分选后分析细胞中基因和蛋白质表达的细胞的实施方案 中是尤其有关的。
用于进旨断测定时本文公开的方法和系统的一种额外的优点是，可 在单一衬底上对来自相同组织区域的多种生物标志物进行多i^检测。用于 进旨断测定时该方法和系统的又一种优点是，所述生物标志物可以是化 学性质不同的生物标志物，如细胞、mRNA和蛋白质，并且检测可以是定 量检测和/或定性检测。用于进旨断测定时本文>^开的方法和系统的再一 种优点是，它们允许检测复杂的基因组和/或蛋白质组镨，该镨在与预定镨 比^提供对以调节网络混乱为特征的疾病(如癌症)的诊断指示。用于 进旨断测定时本文公开的方法和系统的另一种优点是，有可能以多参数 模式分析少量生物样品，并且能够将生物信息的三个相关领域，即基因(由 DNA代表)、蛋白质和细胞联系在一起。
当衬底与微流体组件有效关联时，本文公开的所有方法和系统的又一 种显著优点是，与相应的现有方法和系统相比，允许用尺寸显著减小的样 品，在减少的时间内以减少的步骤数进行多路多^测定。特别地，鉴于 进行分析所需样品量的减少使得处死小鼠的需要最小化，本文公开的多路 多参数微流体方法和系统在靶标是来自组织的生物标志物时是尤其有利 的。由此，在本文公开的微流体环境中进行的方法和系统允许检测少量包 含在样品中的靶标，从而允许检测以低至约10飞摩尔/升(femtoMolar，fM) 的浓度存在于样品中的分子。
当用于进行诊断测定时衬底与微流体组件有效关联时，本文公开的方 法和系统的再一种优点是，允许进行生物标志物的多路检测，包括化学性质不同的生物标志物如多核苷酸、蛋白质和细胞。在其中衬底与微流体组 件有效关联的实施方案中，本文7>开的诊断方法和系统的又一种额外优点 是，允许在来自异质组织中相同微观区域的单一样品上进行多路多参数测 定。因此，本，公开的 法和系统还使与异质活检，关联的取样误差最小
物的诊断方法和系统的多种测量所需的。
本公开内容的一种或多种实施方案的细节在附图和下文的描述中公 开。其他特征、目标和优点从说明书和附图以及权利要求书中将是4艮明显 的。
附图简述
了本公开内容的一种或多种实施方案，并与发明详述一起解
释;$^>开内容的原理和实施，所述附图引入本文并构成说明书的一部分。 在附图中
图l是用于制备本文公开的多核苷酸编码蛋白质的偶联策略的图解。 图a是制备抗体的反应的图解；图b是制备多核普酸的Jl^的图解；图c 展示了通过缀合图a所示抗体与图b所示多核苷酸而获得的多核苷酸编码 抗体；图d显示^Ji移率变动测定(gd mobility shift assay),其显示可通 过调节与图a中所示抗体偶联的分子的量来控制附着于抗体的多核普酸链
Al，的数目。此处泳道I-IV分别对应于300:1、 100:1、 50:1、 25:1的偶联 分子与抗体的化学计量比。
图2是本文公开的多核普酸编码蛋白质的缀合化学的图解。图a显示 多核苷酸和蛋白质链霉亲和素之间的缀合化学的图解；图b显示多核苷酸 编码的链霉亲和素与含生物素的蛋白质的装配，生物素为链霉亲和素的配 体；SA表示链霉亲和素蛋白，"生物素-蛋白质"表示含配体生物素的蛋白 质。
图3显示了展示本文公开的用于细胞表面标志物识别的优化多核普酸 编码抗体的多核苷酸载荷的简图。图a显示FACS曲线，其将 a曙CD卯.2/FITC-多核苷酸缀合物(FITC-DNA-标记的a-CD90.2 )与抗体 上不附着有多核普酸的FITC a-CD卯.2抗体(FITC a-CD90.2 )和无抗体并 且无多核苷酸编码抗体(未标记的)的阴性对照一起进行比较。对应于FITC通道的荧光强度在x轴上给出，y轴对应于空荧光通道；图b显示附 着于抗体的不同数目FITC-多核苷酸平均荧光强度的直方图；x轴上报告 了附着于抗体的多核苷酸数，y轴上才艮告了平均荧光强度。
图4是组合使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核普酸的图解。
图5展示了方法和系统的实施方案，其中多核苷酸编码蛋白质是基于 链霉亲和素-生物素系统，且耙标是细胞。图a显示图2中多核苷酸编码的 链霉亲和素的装配，其中含生物素的蛋白质是主要组织相容性复合体 (MHC),且在目的细胞与玻璃衬底接触前将多核苷酸编码的链霉亲和素预 装配在衬底上。图b显示以多核香酸编码的MHC与细胞在溶液中结合后 与微阵列接触。
图6展示了使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核普酸**测 多种靶标的方法。图a显示组合4吏用本文^S开的多种多核香酸编码抗体与 衬底多核苷酸组合的图解；图b显示使用本文公开的多核普酸编码抗体和 衬底多核苷酸进行的相关免疫测定。
图7显示使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸进行的空 间编码蛋白质测定。图a显示用三种相同的山羊抗人IgG (用Alexa488、 Alexa594或Alexa 647染料标记)进行并分别用多核苷酸Al，、 Bl'和Cl' 标记的免疫测定；图6显示了来自于用白色线段指示的图a阵列部分的免 疫测定结果的图示；图中显示的标度线段对应于lmm。
图8显示免疫测定的结果，其显示组合使用本文公开的多核苷酸编码 抗体和衬底多核苷酸所导致的非特异性蛋白质吸收最小化。图a显示同时 与山羊抗人IgG-Alexa488/A1，、山羊抗人IgG-Alexa647/Cl'(各自与特异 性多核苷酸缀合)和山羊抗人IgG-Alexa594 (无附带的DNA)接触的微 阵列；图b显示来自于用白色线段指示的图a阵列部分的免疫测定结果的 图示，图中显示的标度线^t应于lmm。
图9阐述了衬底多核普酸的计算机(/" )无关化处理
(orthogonalization )的结果，其中每种衬底多核苷酸都与其他衬底多核 苷酸互不影响，并与其相应的抗体特异性多核苷酸结合。图a显示暴露于 两种多核苷酸编码抗体的印有三种衬底多核苷酸的载玻片，所述两种多核苷酸编码抗体与三种衬底多核苷酸中的两种互补；图b显示由Al的计算 机杂交以及与抗体特异性多核苷酸互补的两种衬底多核苷酸的计算机杂 交所形成的二级结构；图c显示计算机产生其他衬底多核苷酸，其限制是 各链彼此互不影响，并且与其相应互补序列互不影响；图d显示一组6条 互不影响的序列，从5'到3'端列出。
图10展示了使用本文公开的多核普酸编码抗体和衬底多核苷酸进行 多路细胞分选的方法。图a显示均质测定，其中多核苷酸编码抗体与细胞 组合，然后将混合物引入已点样的DNA阵列微芯片上；图b显示多核苷 酸编码抗体被装配在已点样的DNA阵列上，然后引入细胞；图c显示多 路细胞分选实验的亮视野和荧光显微镜图像，其中将表达mRFP的T细 胞(红色通道)和表达EGFP的B细胞(绿色通道)的1 :1混合物空间层 积在点Al和Cl上，对应于分别用Al'和Cl'编码的a-CD90.2和a-B220 抗体；图d是从小鼠收集的原代细胞多路分选的荧光显微照片。分别利用 多核苷酸编码的缀合物抗CD4-A1'和抗CD8-C1'，将来自EGFP转基因小 鼠的CD4+细胞和来自dsRed转基因小鼠的CD8+细胞的1:1混合物分离至 点A1和C1。
图11是组合使用本文公开的多核香酸编码抗体和衬底多核苷酸的图 解，其用于细胞分选和/或共同检测化学性质不同的分子。
图12展示了根据本文公开的方法和系统的实施方案，多核苷酸编码蛋 白质检测多种靶标的能力；图a显示暴露于抗体和多核普酸的微阵列，所 述抗体对以多核苷酸Cl编码的抗原IL4具有特异性，所述多核香酸与以 荧光团标记的多核苷酸Bl互补；图b显示用于进行测定的本文乂^开的方 法和系统的实施方案的图示；图c显示图A中以白色线段标识的部分中所 示测定结果的图示。
图13显示显微图像，其展示了同时进行细胞捕获和基因与蛋白质的多 ^^It检测，图中显示的标度线段对应于300 nm。
图14显示一种蛋白质阵列，其用于检测在微流体中装配的本文所公开 靶标的实施方案中。
图15显示在微流体通道中执行的以DNA为模板的蛋白质免疫测定的 荧光图像和亮视野图像，用白色虚线画出600 nm宽的通道。图a显示使疫测定；图b显示在本文所公开方法和系统的一个实施方案中检测耙标浓 度系列，其中使用基于荧光的技术进行检测；图c显示在本文所公开方法 和系统的一个实施方案中检测靶标浓度系列，其中使用金的非电沉积作为 显影和放大策略进行检测。
图16是根据本文所公开方法和系统的一个实施方案组合使用多核苷 酸编码抗体和衬底多核苷酸的图解，多核苷酸编码抗体用金属纳米颗粒标 记。
图17是图16根据本文所公开方法和系统的一个实施方案组合使用的 另 一图解，其显示与衬底结合并用金属纳米颗粒标记的多核苷酸编码抗体 -靶标复合体。
图18是根据本文所公开方法和系统检测信号的设备和相关方法的图 解，所述信号来自用金属纳米颗粒标记的多核苷酸编码抗体。
图19显示用本文公开的方法和系统检测蛋白质组，其中使用金的非电 沉积作为显影和放大策略进行检测。图a显示在约100 pM的浓度下检测； 图b显示在约100 fM的浓度下检测；图c显示在约100 aM的浓度下检测。
图20显示用本文公开的方法和系统检测蛋白质组，其中使用金的非电 沉积作为显影和放大策略进行检测。图a显示在约100pM的浓度下检测； 图b显示在约1 pM的浓度下检测；图c显示在约10 fM的浓度下检测； 图d显示在约100 aM的浓度下检测；图e显示直方图，其将计数的蛋白 质数(y轴)与其在溶液中的浓度(x轴)相关联。
图21显示用本文 〉开的方法和系统检测三种蛋白质(IFN-y、 TNF-a 和IL-2)在加有(spiked with)这3种蛋白质的组织培养基中的蛋白质组， 其中^f吏用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。图a显示IFN-y的 检测；图b显示TNF-a的检测；图c显示IL-2的检测。
图22显示用本文公开的方法和系统检测三种蛋白质(IFN-y、 TNF-a 和IL-2 )在加有这三种蛋白质的血清样品(图a)中和健^Ajk清(图b ) 中的蛋白质组，其中使用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。
图23是直方图，其展示用本文公开的方法和系统对蛋白质标志物Pten校准并定量；图a显示直方图，其中展示了从图b和c中所示微流体实验 中检测到的平均荧光信号强度；图b显示来自校准泳道的针对重组pten 的原始数据；图c显示来自样品的原始荧光数据，所述样品来自两种细胞 系， 一种是表达基底水平pten的空U87，另 一种是it^达U-87-pten的细 胞样品。
图24展示了从通过串联质镨法发现血清生物标志物(图a或1)到通 过大规模SPR (图b或2 )进行抗体确认和选择再到使用本文所公开方法 和系统的一个实施方案确认临床途径(图c或3 )的途径。
发明详述
本发明公开了检测样品中靶标的方法和系统。在本文公开的方法和系 统中，将多核苷酸编码蛋白质与衬底多核苷酸组^<吏用，以检测样品中的 一种或多种乾标。
本文使用术语"检测"表示确定有限的空间部分中靶标或信号的存在 (existence),出现(presence)或事实(fact)，所述有限的空间部分包括但不仅 限于样品、反应混合物、分子复合体和衬底。当表示、涉及或包括测量靶 标或信号的数量(quantity)或量(amount)时(也称作"定量")，检测是"定 量的"，其包括但不限于被设计为测定把标或信号的量或比例的任何分析。 当表示、涉及或包括就对另一靶标或信号(未定量)的相对丰度来鉴定靶 标或信号的性质或种类时，检测是"定性的"。
本文使用术语"靶标"是指目的分析物。术语"分析物"是指待检测 其在样品中存在与否的物质、化合物或组分。分析物包括但不限于生物分 子，尤其是生物标志物。本文使用术语"生物分子"表示与生物环境相关 联的物质、化合物或组分，包括但不P艮于糖、氨基酸、肽、蛋白质、寡核 苷酸、多核苷酸、多肽、有机分子、半抗原、表位、生物细胞、生物细胞 的部分、维生素、激素等等。术语"生物标志物"是指与生物环境的特定 状态相关联的生物分子，所述状态包括但不限于细胞周期的阶段、健康和 疾病状态。生物标志物的存在、缺失、减少、上调与特定状态相关联，或 指示特定的状态。
本文使用术语"样品"是指代表着更大量物品的有限量的该物品，包 括但不限于来自生物环境的流体、标本、培养物、组织、商品重组蛋白质、
21合成化合物或其部分。
本文使用术语"多核苷酸"是指由两个或更多单体组成的有机多聚体， 所述单体包括核普酸、核苷或其类似物。术语"核苷酸"是指若干以下化 合物中的任何一种，所述化合物由与噤呤或嘧咬g连接并与磷^连接 的核糖或脱氧核糖组成，并且是核酸的基本结构单元。术语"核香"是指 这样的化合物(例如鸟苷或腺苷)，其由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或 嘧咬4组成，并且特别存在于核酸中。术语"核苷酸类似物"或"核苷 类似物"分别是指其中 一个或多个个体原子已被替换为不同原子或不同官
能团的核苷酸或核普。因此，术语"多核普酸"包括任何长度的核酸，DNA RNA类似物及其片段。三个或更多核苷酸的多核苷酸也被称作核苷酸寡聚 物或寡核苷酸。
本文使用术语"多肽"是指由两个或更多Jl^酸单体和/或其类似物组 成的有机多聚体。术语"多肽"包括任何长度的JL^酸多聚体，包括全长 的蛋白质和肽，及其类似物和片段。三个或更多M酸的多肽也称作蛋白 质寡聚物或寡肽。本文使用术语"氨基酸"、"M酸单体"或"氨基酸残 基"是指二十种天然存在氨基酸中的任何一种，包括具有非天然侧链的合 成氨基酸，并包括D和L旋光异构体。术语"氨基酸类似物"是指这样的 氨基酸，其中一个或多个个体原子被替换为不同的原子、同位素或不同的 官能团，但是其他方面与其天然氨基酸类似物相同。
本文使用术语"蛋白质，，是指具有特定的二级结构和三级结构的多肽， 其能够参与(但不限于)与其他生物分子的相互作用，所述其他生物分子 包括其他蛋白质、DNA、 RNA、脂质、代谢物、激素、趋化因子和小分子。
本文使用术语"抗体"是指这样蛋白质，所述蛋白质在抗原刺激后由 活化的B细胞产生，并与抗原特异性结合，在生物系统中促进免疫应答， 所述蛋白质通常由四个亚基组成，包括两条重链和两条轻链。术语"抗体，， 包括天然抗体和合成抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或其片 段。示例性的抗体包括IgA、 IgD、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgM等等。示例 性的片段包括FabFv、 Fab， F(ab')2等等。单克隆抗体是这样的抗体，其 与另一生物分子中称为"表位"的单个特定空间和极性结构特异性结合， 并因而定义为与之互补。多克隆抗体是指单克隆抗体的混合物，各个单克 隆抗体结合不同的抗原性^^位。抗体可通过本领域z^知的才支术制备，例如免疫宿主并收集血清(多克隆抗体)，或通过制备连续杂交瘤细胞系并收 集所分泌的蛋白质(单克隆抗体)。
本文在提及分子与另一分子结合时使用的措辞"特异性地"、"特异地" 或"特异性"是指所述分子与该另一分子之间识别、接触并形成稳定复合 体，并且所述分子和另一分子中的每一种与其他分子之间显著更少直至不 发生识别、接触和形成稳定复合体。示例性的特异性结合是抗体-抗原相互 作用、细胞受体-配体相互作用、多核苷酸杂交、酶-底物相互作用等等。 本文在提及复合体的分子组分时使用的术语"特异性"是指该组分与其特 定复合体的独特关联，所述组分是所述特定复合体的一部分。本文在提及 多核苷酸序列时使用的术语"特异性，，是指该序列与作为其互补序列的单 个多核苷酸的独特关联。
措辞"多核苷酸编码蛋白质"是指多核苷酸-蛋白质复合体，其包含蛋 白质组分和附着于该蛋白质组分的编码多核苷酸，所述蛋白质组分与靶标 特异性结合并因而被定义为与该靶标互补。在一些实施方案中，附着于
蛋白质的编码多核苷i^l蛋白质特异性的。这些实施方案可用于在任何靶
检测其他蛋白质、细胞因子、趋化因子、小分子、DNA、 RNA、脂质等等 的测定。
本文使用术语"多核香酸编码抗体"是指多核苷酸编码蛋白质，其中 所述蛋白质组分是抗体。
本文使用术语"附着"或"附着的"是指通过键、连接(link)、力或联 系(tie)连接或合并，从而将两个或更多的组分保持在一起，该术语包括直 接或间接附着，使得例如其中第一分子与第二分子或材料直接结合，以及 其中一种或多种中间体分子被置于该第一分子和第二分子或材料之间的 实施方案。
本文使用措辞"衬底多核苷酸"是指附着于衬底从而维持结合其互补 多核苷酸的能力的多核苷酸。村底多核苷酸尤其可由下述序列组成，所述 序列与多核苷酸编码蛋白质的编码多核普酸特异性结合，并因而被定义为 与之互补。
本文使用术语"衬底"是指底层的支持物或基底。示例性的衬底包括固体衬底，如玻璃板、微孔板、磁珠、硅晶片(silicon wafer)和技术人员阅 读4^>开内容后可识别的其他衬底。
在本文公开的多核苷酸编码蛋白质中，各蛋白质与预定的靶标特异性 结合并因而被定义为与之互补，并且各编码多核普酸与预定的衬底多核普 酸特异性结合并因而被定义为与之互补。
在其中蛋白质是抗体的实施方案中，蛋白质-靶标相互作用是抗体-抗 原相互作用。在其中蛋白质不是抗体的实施方案中，相互作用可以是受体 -配体相互作用、酶-底物相互作用和技术人员阅读4^>开内容后可识别的 其他蛋白质-蛋白质相互作用。例如，在其中蛋白质是链霉亲和素的实施方 案中，蛋白质-靶标相互作用是受体-配体相互作用，其中受体是链霉亲和 素，配体是游离或附着于任何其他生物分子的生物素。
另外，在本文>^开的方法和系统中，各衬底多核苷酸和编码多核苷酸 在结合方面可彼此区分。在本文7>开的方法和系统的一些实施方案中，衬 底中的各衬底多核苷i^序列特异性的，并且在位置上可彼此区分。
本文涉及分子时使用的措辞"在结合方面可区分"是指可以基于与特
定分子特异性结合并因而被定义为与之互补的能力而进行区分的分子。因 此，如果第一分子与第三分子特异性结合并因而被定义为与第三分子互 补，且第二分子与不同于第三分子的第四分子特异性结合并因而被定义为 与第四分子互补，则第一分子与第二分子在结合方面可区分。
本文涉及分子时使用的措辞"位置上可区分"是指可以基于分子占据 的点或区域而进行区分的分子。因此，位置上可区分的衬底多核苷^1这 样的衬底多核苷酸，其占据衬底上不同的点或位置，并因而是位置上可区 分的。
本文公开的多核苷酸编码蛋白质可以用常见的生物缀合方法 (bioconjugationmethod)来产生，例如化学交联，包括依赖于蛋白质中存在 待结合伯胺(通常存在于赖氨酸残基上)的技术。特别地，多核苷酸编码 蛋白质尤其可以通过图1和2中针对多核苷酸编码抗体(图1)和多核普 酸编码的链霉亲和素(图2)而显示的共价缀合策略来产生。
在图1显示的实施方案中，5'-胺化的多核苷酸通过腙键与抗体偶联 (Kozlov， I. A.; Melnyk， P. C; Stromsborg， K. E.; Chee, M. S.; Barker, D. L.;Zhao, C. Biopolymers 2004， 73， 621- 630)，如图1所示和实施例1的示例。
相同的生物缀合化学及JI可用于生产任何多核香酸编码蛋白质，例如 以多核苷酸编码的链霉亲和素，如实施例2的示例和图2所示。
待缀合特定的多核普酸编码蛋白质的编码多核普酸数可以变化。尤其 可以调控附着于蛋白质组分的多核苷酸数，以使待结合部分的大小最小 化，因而使其位阻最小化，而同时仍然保持缀合特异性。可通过实施例3 中示例并在相关的图3中图示的步骤进行优化。在实施例3和图3中，产 生了不同批的多核苷酸编码抗体，其中与各抗体相连的多核苷酸总数不 同。因为图3和实施例3的编码多核普酸中含有荧光团，所以可使用FACS 测出各变体对细#面标志物的结合效率。应当注意，存在测量和优化作 为多核普酸载荷函数的抗体亲和力的其他类似技术，包括直接测量抗体的 结合动力学的技术，如表面等离振子共振(surface plasmon resonance, SPR) 和等温滴定测热法(ITC)。
在一些实施方案中，待附着于每一蛋白质的编码多核苷酸数可以是从 1到6的任何数目。在一些实施方案(例如细胞分选)中，每个蛋白质附 着3个编码多核苷酸提供了使标记的空间效应最小化的额外优点，并因此 允许用多种编码多核苷酸来标记多核苷酸编码蛋白质，用于与互补衬底多 核苷酸的高亲和力杂交。
也可以控制形成待结合部分的多核苦酸的长度，以优化多核苷酸编码 蛋白质与衬底的结合。特别地，可以为了无关化处理的目的而优化编码多 核苷酸的长度，如实施例8和图9中所例证和下文进一步讨论的。
在以下的详细描述中，经常会参考其中多核苷酸编码蛋白质是多核苷 酸编码抗体的实施方案。阅读本公开内容后，技术人员应当能够使针对多 核苷酸编码抗体提供的教导适应于其他多核苷酸编码蛋白质。
可通过本领域的常见技术生产衬底多核苷酸。例如，首先可化学合成 多核普酸。然后根据Stanford的Pat Brown(Schena M, Shalon D, Davis RW， Brown PO. Science. 1995 Oct 20; 270(5235): 467-70指出的范例对多核苷酸 进行针点样(pin spotted).然后可#>据技术人员阅读^^开内容后可识别的 技术，将这样生产的村底多核苷酸附着于衬底。特别地，用于生产衬底多 核苷酸的合适多核苷酸包括多聚赖氨酸衬底上的至少75单体长度。在一些实施方案中，编码多核普酸和/或衬底多核苷酸被无关化处理， 以使编码多核苷酸与衬底多核苷酸之间的非特异性结合最小化。因此，无 关化处理的多核苷酸包括这样的多核苷酸，其序列由计算机产生，以使不 完全的碱基配对、亚稳态和/或其他二级结构最小化，从而使多核普酸之间 的非特异性相互作用最小化，以及使通常与相关序列的随机产生相关联的 多核苷酸中的非线性次^目互作用最小化。
本文中使用术语"无关化处理"是指计算机产生一组多核苷酸的过程， 其中不完全碱基配对、亚稳态和其他二级结构被最小化，以使多核苷酸仅 与其互#^结合，不与其他任何链结合。本公开内容中使用的示例性无关
化处理技术包括根据Dirks等(Dirks， R. M.; Lin， M.; Winfree， E.; Pierce, N. A. 7V"c/e/c J"Vfc i^se"/T/i 2004, 32， (4)， 1392-1403)所述范例进行的无关化^ 处理。
具体地，在一些实施方案中，编码多核苷酸和相应的互补衬底多核普 ^A具有SEQ ID NO: 7到SEQ ID NO 18的序列的无关化处理多核苷酸 (见实施例8和相关的表1)。
可通过方法和步骤(如实施例8中例证并在图9中阐述的多核苷酸的 计算机无关化处理(即计算机化的无关化处理)和技术人员阅读本公开内 容后会明白的其他步骤)进一步鉴定其他无关化处理的多核香酸。
本文公开的方法和系统可用于进行检测耙标的测定，包括单^lt测定 和多参数测定，均可作为多路测定进行。
本文使用术语"单参数测定"是指用于测定一种耙标的存在、不存在 或量的分析。术语"多参数测定"是指用于测定多种耙标的存在、不存在 或量的分析。术语"多路"测定是指多种测定反应(例如同时测定多种分 析物)在单一反应室中进行和/或以单一分离和检测形式中分析的测定。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统能够有利地用于进旨断 测定，其中待检测的靶标是与预定疾病相关联的预定生物标志物。这些实 施方案在这样的诊断方法中是尤其有利的，其中不同种类的生物材料和生 物分子各自在通常为异质的组织样品中不同区域进行测量，从而引入了不 可避免的难以定量的噪音源。
在本文公开的方法和系统的一些实施方案中，多核苷酸编码蛋白质和衬底多核普酸组^使用，如图4所示，其中所示多核苷酸编码蛋白质是多 核普酸编码抗体。
在图4的实施方案中，多核普酸编码抗体(10)与衬底(100)组合提供。 多核普酸编码抗体(IO)由抗体(ll)和编码多核苷酸(12)组成。衬底(100)带有 与衬底表面结合的衬底多核苷酸(120)。编码多核普酸(12)与衬底多核普酸 (120)互补，以使衬底多核苷酸(120)和编码多核普酸(12)在接触后杂交。
在图4所示的实施方案中，本文公开的多核普酸编码抗体形成蛋白质 阵列，其能够与样品接触，以检测样品中的耙标。图4的实施方案对于检 测和/或分选蛋白质靶标而言尤其有利。
在另 一些实施方案中，尤其是适用于检测和/或分选细胞乾标的实施 方案中，在将多核苷酸编码抗体与互补的衬底多核苷酸接触之前，将一些 或全部多核苷酸编码抗体与样品接触。在这另一些实施方案中，抗体与一 种或多种相应的靼标能够在无衬底时(例如在溶液相中)结合，其中两种 分子均具有完全的取向自由，并且靶标对抗体结合口袋(binding pocket)的 接近不受衬底影响。另外，不发生表面诱导的蛋白质变性，因为多核苷酸 编码抗体保留在溶液中，保持了蛋白质的三级折叠。另外，生物污着被最
小化(也参见下文的描述)，从而与本领域的相应方法和系统相比改善了 所进行测定的灵敏度和特异性，以及与衬底结合的抗体靶标复合体的可检 测性。显示一些上述优点的示例性实施方案示于图5、 7、 8、 11和13。
在本文公开的方法和系统中，最终从衬底上检测与衬底结合的抗体-靶标复合体。
在一些实施方案中，通过提供经标记的分子来进行复合体的检测， 所述经标记的分子包括能够特异性结合待检测的多核普酸编码蛋白质-乾 标复合体的任何分子(例如抗体、适配体、肽等)，以及提供标记信号的 标记，所述经标记化合物附着于所述分子上。将经标记的分子与多核普酸 编码蛋白质-靶标复合体接触，然后可以根据技术人员阅读4^>开内容(尤 其是实施例部分)后可识别的方法^^测标记信号，所述标记信号来自与 衬底上多核普酸编码蛋白质-耙标复合体结合的经标记化合物。
在其中如下文更详细描述的检测一种或多种乾标和/或多种乾标的 实施方案中，经标记分子可以由多种经标记分子组成。每种经标记分子包
2含与一种或多种靶标/多种耙标中的一种靶标特异性结合的分子，以及附着 于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号，各经标记的分子在 检测方面可彼此区分。本文涉及经标记分子使用的措辞"在检测方面可区分"是指可以基 于附着于该分子的标记化合物所提供的标记信号进行区分的分子。示例性 的标记化合物(其能够用于提供在检测方面可区分的经标记分子)包括但 不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶(metalsol)、配 体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)和技术人员阅读本公开 内容后可识别的其他化合物。在一些实施方案中，将多种经标记分子与多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许多种多核苷酸编码蛋白质 -靶标复合体与多种经标记分子结合。然后检测标记信号，该信号来自与衬 底上多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体结合的多种经标记分子。在一些实施方案中，检测方法可以通过基于荧光的读数(readout)来 进行，其中经标记抗体用荧光团标记，所述荧光团包括但不仅限于小分子 染料、蛋白质生色团、量子点(quantum dot)和金纳米颗粒。具体地，在一 些实施方案中，在本文公开的任何方法和系统中，检测可在金纳米颗粒标 记的二级检测系统上进行，其中常用的摄影显影液可放大金纳米颗粒，如 下文进一步描述。另外，如果读数来自于金颗粒的暗视野(darkfield)散射， 则能够进行单分子数字蛋白质组分析。其他的技术是技术人员阅读本公开 内容后可识别的，将不再进一步详细讨论。本文用作复合体或分子之组分的术语"标记"和"经标记分子"是 指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、 生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、 金属溶胶、配体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)等等。术 语"荧光团"是指能够在可检测的图像中显示出荧光的物质或其部分。因 此，本文使用的措辞"标记信号"是指由标记发射的允许检测该标记的信 号，包括但不限于放射性、荧光、化学发光、在酶反应的结果中产生化合 物等等。在一些实施方案中，检测一种特异性靶标。在这些实施方案中，可28冉 別
靶标接触。
其中在将多核苷酸编码抗体与衬底接触之前将多核苷酸抗体与靶标 接触的实施方案尤其适用于分选或检测细胞。在这些实施方案中，抗体与 靶标之间结合的效率和特异性被最大化，即便对于检测单个靶标也是如 此。 一种可能(但不确定)的解释是，在本文公开的方法和系统中，靶标 捕获不是由抗体对细胞表面标志物的相互作用驱动，而是由通过协同结合 提高的抗体特异性多核苷酸与微阵列上相应链的亲和力来驱动，这大幅提 高了捕获效率。该优点尤其与这样的靶细胞相关，其能够被有效地捕获，
从而使用该方法典型地观察到被汇合细胞层完全占据的DNA点(见实施 例5和图5)。
其中在多核苷酸编码抗体与衬底接触之后将多核普酸编码抗体与靶 标接触的实施方案尤其适用于以高灵敏度分选或检测蛋白质。本文公开的
触的方法和系统的示例性实施方案示例于实施例12和13，并示于图15、 19、 20、 21、 22、 23、 24(c)。在这些实施方案中，能够消除已结合靼标的 多核苷酸编码蛋白质与未结合靶标的多核苷酸编码蛋白质之间对同一特 异性衬底多核苷酸的竟争，因而提高测定的灵^t度。另外，在这些实施方 案中，通过决定各种结合的平衡热力学定律，可以优化衬底上多核苷酸的 浓度，使得更高浓度的多核苷酸编码蛋白质能够与衬底结合，这进而会导 致正确装配的复合体的浓度更高，进而提高整体检测灵敏度。
可使用图4和5以及实施例5中例证的方法和系统进行单M测定， 所述方法和系统包括但不限于用于检测血清中单一标志物的任何测定， 生物样品中单一蛋白质检测，根据一种表面标志物进行细胞分选，以及技 术人员阅读4^Hf内容后可识别的其他测定。
在一些实施方案中，根据图6中所示的策略进行多种靶标的检测。
产生多种多核普酸编码抗体(10、 20和30)，每种多核苷酸编码抗 体能够特异性结合带有抗体组分(11、 21和31)的一种预定靶标，并能结 合带有编码多核苷酸组分(12、 22和32)的互补衬底多核苷酸。产生带有 序列特异性并且位置可区分的衬底多核苷酸(112、 122和132)的衬底。然后将多核苷酸编码抗体(IO)、 (20)和(30)与衬底多核苷酸(112)、 (122) 和(132)接触，并且在抗体特异性多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合后， 多核苷酸编码抗体复合体在衬底上自装配。
在图6中所示的实施方案中，产生由多种结合可区分且位置可区分 的抗体组成的蛋白质阵列。这些实施方案对于以高灵敏度分选和/或检测不 同的蛋白质-靶标是尤其有利的。这些实施方案的示例性展示在实施例9、 10和12和图10、 12、 13和15a中显示。
在另一些实施方案中，在接触衬底多核苷酸之前将多种多核苷酸编 码抗体与样品接触，用于检测相关乾标。在这些实施方案中，本文公开的 方法和系统可用于进行多路多参数测定，其中由于与抗体和靶标在不存在 衬底时结合相关联的灵敏度和选择性的提高，并鉴于生物污着和蛋白质变 性的减少，可以以定量和/或定性的方式有效检测大量生物标志物。这些实 施方案的示例性展示在实施例9、 10和12和图10、 12、 13和15中显示。
可用实施例9、 10和12中示例并示于图10、 12、 13和15的方法和 系统进行的多参数测定包括但不限于任何蛋白质组学分析、组织分析、血 清诊断、生物标志物、血清图镨(serum profiling),多参数细胞分选、单细 胞研究，以及本领域技术人员阅读本公开内容后可识别的其他测定。
在一些实施方案中，图6所示的组合使用可应用于分选多种靶标的 方法中，这在所述多种靶标由不同类型的细胞(尤其是原代细胞)组成时 是尤其有利的。在这些实施方案中，根据实施例9中示例并示于图10的方 法，优选地在与衬底接触之前将多核苷酸编码抗体与包含细胞的样品接 触。
其中多种靶标由不同类型细胞组成的方法和系统的实施方案尤其比 相应的现有方法和系统例如淘洗(panning)更为有利，其中细胞与印在支持 衬底上的表面标志物特异性抗体接触(Cardoso， A. A.; Watt， S. M.; Batard， P.; Li, M. L.; Hatzfeld， A.; Genevier， H.; Hatzfeld, J.五jc/;. He附flto/. 1995， 23,407-412)。具体地，由于使用多核苷酸将抗体与衬底结合，所以相对于 现有技术的方法和系统而言在衬底上的细胞捕获效率提高(见图5和图 10 )。另夕卜,这些优选的实施方案没有与常规点样蛋白质微阵列相同的限制， 例如不总是在表面上正确取向的抗体，和/或可能干燥过度并失去功能的抗 体。任何分选细胞的实施方案都具有优于本领域已知细胞分选方法和系
统(如FACS)的若干优点，因为通过本文公开的方法和系统分选的细胞 可立即用于分选后的基因和/或蛋白质表达分析。另夕卜，本文公开的方法和 系统对多种细胞进行空间多路分选，这在根据多种细胞表面标志物分选细 胞中尤其有效，并且不受可用于标记分选用细胞表面标志物的光谦不同的 荧光团数量的限制，如实施例9和相关的图10中所示。
在一些实施方案中，图6中所示的组合^^吏用可用于根据图11所示方 法检测多种化学性质不同的靶标。具体地，显示了该方法用于分离多种不 同的生物标志物如DNA、细胞和蛋白质。在图11所示的实施方案中，在 用于分析细胞、基因和蛋白质的多^lt测定中，使用附着有多种衬底多核 苷酸(3)的衬底(2)实施本文公开的方法和系统，以分离细胞(l)(见图11, 箭头A1)并分析相关的基因组和蛋白质组学特征(signature)(见图11， 箭头2)。
在一些这样的实施方案中，将样品与多种多核苷酸编码抗体接触， 以允许形成多种以多核苷酸编码的生物标志物复合体，然后将其与衬底如 DNA阵列接触，其中抗体特异性多核苷酸特异性结合相应的DNA链。在 期望检测靶多核苷酸的一些实施方案中，还可将特异性结合乾多核普酸的 经标记多核苷酸与样品结合，产生经标记的靶多核苷酸，其与衬底上的预 定DNA链特异性结合。经标记的靶多核苷酸最终与衬底多核苷酸结合并 被检测。根据该方法，细胞、蛋白质和DNA生物标志物被分选，然后在 单一衬底上检测，从而允许有利地进行多路多参数测定。
在这些实施方案中，通过使用多核苷酸作为细胞、cDNA和蛋白质 的通用装配策略，可以针对点样衬底上的高DNA载荷和抗体上的互补 DNA载荷优化衬底IHf 。该优化以及衬底上与抗体基于多核苷酸结合相关 的生物污浊的降低允许进行用于蛋白质检测的高灵敏度夹心法测定，以及 高效细胞分选(与传统淘洗相比)。进行化学性质不同的生物标志物检测 的一种示例性方法和系统在实施例10中描述并示于图13中。
使用实施例9、 10、 12和13中示例并示于图13、 10c、 10d、 15a、 22、 23、 24的方法和系统可进行的靼标分选测定包括技术人员阅读本公开 内容后可识别的任何需要检测混合物中特定靶标(包括但不限于细胞靶 标、蛋白质靶标或基因靶标)的测定。在一些实施方案中，可通过抗体进行单个或多种靶标的高灵敏度检 测，所述抗体以用于检测的金属纳米颗粒进行标记，然后进行非电沉积沉
积(electroless metal deposition)。
在这些实施方案中，可通过使用金属纳米颗粒(尤其是金纳米颗粒) 作为标记分子来实施本文公开的任何方法和系统，以检测与衬底结合的以 多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体。具体地，金属纳米颗粒(如金纳米颗 粒)与经标记的分子(例如第二抗体)缀合，用于标记与衬底结合的多核 苷酸编码蛋白质-靶标复合体。金属颗粒(如金纳米颗粒)具有独特的光学 特性，因为比可见光波长小得多的颗粒仍然能够使用光"a射容易地成像。 这允许使用光散射显微镜通过计数纳米颗粒标记(并从而计数蛋白质)而 对免疫测定进行读数。该方法在本文中还被定义为数字方法和数字DEAL ——假设每个纳米颗粒对应于单个蛋白质，则计数的颗粒数代表通过特异 性抗体捕获的蛋白质的绝对数量。
图16和17显示了本文7>开的方法和系统的一种示例性实施方案， 其中标记分子包括金属纳米颗粒，如金纳米颗粒。具体地，金纳米颗粒(210) 通过接头分子(211)附着于第二抗体(212)上。在第一抗体(213)上附着了一种 或多种ssDNA寡聚体(214)。待检测的靶标(217)处于溶液或生物环境中。 测定本身应在包被有ssDNA， (215)的表面(216)上测量。示例性的实施方案 进一步展示于图18到22,并在实施例13中示例。
使用金属纳米颗粒进行标记时，本文公开的方法和系统的一些实施 方案的一个优点是不需要每次都在进行蛋白质测量后对免疫测定进行校 准，因为计数的蛋白量代表绝对测量值。相比较而言，荧光测定或吸光度 测定代表了相对测量值，因为它们取决于背景荧光(吸光度)水平、光放 大电子学、光漂白作用(对荧光而言)等等。本文公开的基于纳米颗粒的 数字方法和系统可有利地用于(l)在高aM水平(超出常规ELISA免疫 测定103-106倍的改进)和广浓度范围下超灵敏地检测蛋白质；(2)在同一 芯片上多#测多种蛋白质；和(3)检测人患者血清中的胞外信号分子一一 细胞因子。
本文公开的方法和系统的一些实施方案(其中通过使用金属纳米颗 粒进行标记和检测)是基于下述检测系统，如瑞利散射机制，其允许将与 检测抗体缀合的个体等离振子纳米颗粒(plasmonic nan叩article)间接显现，从而实现单一蛋白质计数，所述颗粒在该情况下为40nm的金纳米颗 粒。可使用图形软件接口 (graphical software interface)对颗粒的绝对数进 行数码计数，从而定量蛋白质的量。这些实施方案与在放大后使用平均信 号读数的常规定量方法截然相反。与DNA编码的抗体文库技术结合，本 文公开的使用金属纳米颗粒作为标记化合物的方法和系统能够通过同时 计数来自相同生物样品的不同种类蛋白质而使检测多路化。
本文公开的方法和系统(其中使用纳米颗粒作为标记化合物)优于 现有的高灵敏蛋白质检测技术(其基于ELISA方案的变体)的又一种优点 是，有可能消除信号放大和相关的额外噪音以及运行所需的时间。现有技 术方法都需要某个放大步骤，并且每种方法都需要一定水平的校准，所述 校准必须针对所实施的每个测定来进行。例如，已报道了其中使用DNA 标记第二抗体并使用聚合Sm式反应(PCR)扩增DNA的方法。这种扩增后 的该DNA被检测并随后与所测量的蛋白质浓度相关联。在另一变型中， 用金纳米颗粒标记第二抗体，然后(通过非电沉积)将金属银沉积在金纳 米颗粒上，从而产生放大的吸光度信号。对这两种情况而言，放大步骤本 身都向测定中引入噪音，并且需要额外的时间，通常是大量的时间。
>使用纳米颗粒的本文^^开的方法和系统优于所述现有技术方法的另 一个优点是现有技术方法均不^_数字的，即这些方法均不涉及实际计数蛋 白质数量，而是测量相对信号，如荧光或吸光度。这意味着它们必须被校 准。相反， 一旦表征了通过本文公开的方法和系统(其使用金属纳米颗粒 作为标记化合物)进行的测定，则不需要校准，因为蛋白质的计数产生能 够与蛋白质浓度相关联的绝对数。
该应用对于蛋白质组学领域中的检测(图21和22)和/或检测以极 低浓度存在于小体积样品(例如一滴血)中的生物标志物(图19和20) 而言是尤其有利的。
在另一些实施方案中，本文公开的任何方法和系统中的衬底可与微 流体组件相关联，从而允许进行基于微流体的测定。基于微流体的测定提 供下述优点，例如如减小的样品和试剂体积以及缩短的测定时间(Breslauer， D. N.; Lee, P. J.; Lee， L. P. Mo/.丑,V &对.2006， 2， 97-112)。例如，在某些操 作条件下，表面结合测定动力学主要由分析物(蛋白质)浓度和分析物/ 抗原亲和力决定，而不是由扩散决定(Zimmermann， M.; Delamarche, E.;Wolf, M.; Hunziker, P. 5,V nierf/ai/Af/cn^ev/c^ 2005,7, (2)， 99國1 10)。
本文使用术语"微流体"是指含有微流体构件的组件或系统，例如 通常以微米或亚微米尺度制造的通道和/或腔室。例如，典型的通道或腔室 具有至少一个为约0.1微米到约1500微米、更通常为约0.2微米到约1000 微米、更通常为约0.4微米到约500微米的横截面尺寸(cross-sectional dimension),个，流体构件通常载有非常少量的流体，例如从约10纳升 到约5亳升，更通常从约100纳升到约2亳升，进一步更通常从约200纳 升到约500微升，或仍然更通常从约500纳升到约200微升。
所述微流体组件可包含在集成设备(integrated device)中。本文使用 "集成设备"是指具有两个(或更多)组件的设备，所述组件在物理上和 操作上组合在一起。组件可以(完全或部分地)彼此独立制造并在其(完 全或部分)制it^组合，或者所述集成设备可制成该集成设备中包含不同 的组件。集成的微流体阵列(microfluidic array)设备包含与微流体组件组合 的阵列，其中该微流体组件和阵列组件彼此可操作地相关联，从而该阵列 组件的阵列衬底与微流体组件的微流体构件流体连通。微流体组件是这样 的组件，其包含微流体构件，并且适于与阵列组件可操作J^目关联。阵列 组件是包含衬底并适于与微流体组件可^Mt^M目关联的组件。
也可以以模块形式提供微流体系统。"模块"描述了这样的系统或设 备，其具有多种用于一起使用的标准化组件，其中一类组件的多种不同实 例之一可被替换为同类组件中的另 一种，以改变系统或设备的功能或能 力；在这样的系统或设备中，每个标准化组件都是一个"模块"。
进行微流体测定的本文公开的方法和系统的示例性实施方案在实施 例10和11中描述并示于图13和14。
在本文公开的方法和系统的微流体实施方案中，有可能在极小的样 品体积中测量很大的蛋白质标志物镨，并可能得到非常低的背景/生物污着
(见图14)。
在本文公开的方法和系统的微流体实施方案中，还可以提高测定的 灵敏度，以检测浓度低至10fM的耙标，包括先前认为在任何其他技术的 检测水平以下的生物标志物(例如Ajk清中的蛋白质)。
在示例性的实施方案中，通过以下步骤获得这样的结果提高衬底的载荷能力和使用以用于检测的金属纳米颗粒标记的抗体，然后进行非电
沉积沉积(见实施例11和图14(c))。
另外，因为在示例性的实施方案中，在本文公开的方法和系统中使 用空间的而不是比色的多路化，所以可将基于荧光的读数转化为光学读 数。因此，本文公开的微流体方法和系统允许对测定进行光学读数，这比 相应的现有方法和系统灵敏100-1000倍(见图14)。因此，本文公开的微 流体方法和系统的又一优点是，有可能使用所述方法和系统作为数字技 术，即通过单分子计数来定量检测蛋白质的技术。这种应用尤其有利于蛋 白质组学领域的检测(图14)和/或以极低浓度存在于小体积样品(例如 一滴血)中的生物标志物的检测。
因此，与用于分子检测的相应的现有微流体方法和系统以及其他非 微流体方法和系统相比，本文公开的微流体方法和系统允许在减少的时间 量中使用尺寸减小的样品以更高的灵^t度进行(i)单步骤测定(其中多核苷 酸编码抗体、靶标和经标记的抗体在单个步骤中接触)和(ii)多步骤测定(其 中衬底先后与多核普酸编码抗体、耙标接触，随后与第二抗体接触)(见 实施例11和12 )。
与本文公开的微流体方法和系统相关联的另 一个优点包括，有可能 在微流体环境中进行涉及以衬底支持的抗体的任何测定，它们在使用先前 的技术时无法承受微流体芯片的装配。
与本文公开的方法和系统有关的另 一些优点是有可能使用低成本 试剂如玻璃和塑料进行灵敏的测量；有可能将衬底与用于样品预处理和纯 化的其他组件组合使用。
本文公开的方法和系统允许进行目的生物标志物的多路多参数检 测、分选以;M目关的诊断分析。用于诊断分析的本文方法和系统应用的示
例性展示在实施例14中描述并在图23和24中展示，还有技术人员阅读本 公开内容后可识别的任何其他测定。
本文公开的系统可以以阵列或试剂盒的形式提供。阵列有时称作"微 阵列"，是指可寻址区域的任何一维、二维或三维排列，所述区域带有与 该区域相关联的特定分子。通常特征性的特征尺寸为微米。图4、 5、 6、 7、 8、 9和10提供了示例性的微阵列。在试剂盒中，多核普酸编码蛋白质和衬底独立地包含在试剂盒中。 多核普酸编码蛋白质包含在一种或多种组合物中，各多核苷酸编码蛋白质
与合适的载体(vehicle)、运载体(carrier)或辅助剂(auxiliary agent) 一起包含在组合物中。
系统中提供的衬底可带有附着于该衬底的多核苷酸。在一些实施方 案中，衬底多核苷酸还可作为试剂盒的额外组件提供。额外组件可包括经 标记多核普酸、经标记抗体、标记、微流体芯片、参比标准品，以及技术 人员阅读本公开内容后可识别的额外组件。具体地，试剂盒的组件可与合 适的使用说明和其他必需试剂一起提供，以进行本文公开的方法。试剂盒 通常在独立的容器中含有组合物。试剂盒中通常包含用于进行测定的说明 书，例如纸或电子载体如磁带或CD-ROM上的文字或音频说明书。根据 使用的具体方法，试剂盒也可含有其他包装在内的试剂和材料(即洗涤緩 冲液等等)。
本领域技术人员阅读4^>开内容后可识别涉及鉴定组合物的合适运 载体试剂(carrier agent)或辅助剂以及试剂盒的一般制造和包装的其他 细节。
本文公开的方法和系统在以下的实施例中进一步阐述，其以说明性 方式提供，而不旨在限制。
实施例l:产生以多核苷酸编码的抗体
根据图1所示的两步骤策略产生以DNA编码的抗体。具体地，使用 市售试剂通过琥珀酰亚胺化学反应向5-胺化的寡核香酸中引入醛官能团 (图1图a)。类似地，通过与相应抗体中赖氨酸侧链的反应引入酰肼部分(图 1图a)。然后通过醛和酰肼官能团之间的化学当量的腙键形成来促进DNA-抗体缀合物形成。 通过PAGE电泳,缀合物形成并控制DNA载荷(图 l图b)'
为了进行这些实验，从Invitrogen购买用AlexaFluor 488、 594和 647标记的多克隆山羊抗人IgG。单克隆兔^A白介素-4 (克隆8D4-8)、 无荧光的和APC标记的兔抗人肺瘤坏死因子-a (分别为克隆MAbl和 MAbll )，以及无荧光的和PE标记的兔抗人干扰素-Y (分别为克隆NIB42
实施例和4S,B3)均购自eBioscience。无荧光的和生物素标记的小鼠抗人白介素 -2 (分别为克隆5344.111和B33-2 )购自BD Biosciences,所有的DNA链 均以带有5'-tJ^修饰的形式购自Midland Certified Reagent公司。所有六 个26聚体及其相应的命名在下表1中与各自的名称/标识符一起给出，通 过所述名称/标识符将序列列于附带的序列表中。
表l
名称/标识符序列
SEQIDNO，Al: 5，-MH2-AAAAAAAAAACGTGACATCATGCATG-3，
SEQI關0 23'-GCACTGTAGTACGTACAAAAAAAAAA隱NH2-5，:Al，
SEQ1DN0 3B1: 5，-NH2-AAAAAAAAAAGGATTCGCATACCAGT-3，
SEQ〖DN043,-CCTAAGCGTATGGTCAAAAAAAAAAA-NH2-5，:B 1 ，
SEQ ID NO 5CI: 5，-NH2-AAAAAAAAAATGGACGCATTGCACAT-3，
SEQ ID NO 63，-ACCTGCGTAACGTGTAAAAAAAAAAA-NH2-5，:Cl，
使用前将所有的抗体脱盐，将緩冲液更换为pH 7.4 PBS，并使用3000 MWCO离心滤器(MilliporeTM)将其浓缩至 lmg/ml。
将酰肼基团平行引入单克隆抗体中，并从5'胺化的寡聚体制备5'醛 修饰的单链DNA (见图1的图a)。
具体地，以琥珀酰4-肼基烟酸丙酮腙(succinimidyl 4國hydrazinonicotinate acetone hydrazone， SANH, SolulinkT"对抗体不同 的i尔过量(1000:1到5:1)向抗体中添加DMF中的SANH。藉此改变引 入抗体的酰肼基团数。独立地以20倍摩尔过量向PBS中5'胺化的26元寡 聚体中添加DMF中的琥珀酰4-甲酰基苯甲酸酯(succinimidyl 4-formylbenzoate, SFB， SolulinkTM)。 SFB与DNA的这种比例确保5'胺基 完全反应产生5'醛。在室温下4小时后，所述抗体以及寡核苷酸偶^i^应 二者均未观察到产率的进一步提高。去除过量的SANH和SFB，并使用蛋 白脱盐离心柱(PierceTM)将样品的緩冲液更换为pH 6.0柠檬酸盐緩冲液。然后将20倍过量的衍生化DNA与抗体结合，并允许在室温下反应 过夜，形成图1的图b中显示的DNA编码的抗体。用尺寸排阻离心柱 (Bio國Gel P-30, Bio國RadTM)去除未偶联的DNA,或4吏用Pharmacia Superdex 200凝胶过滤柱在0.5 ml/分钟的PBS等强度流(isocratic flow)下纯化。 在60t:的宽松变性条件下用非还原性7.5% Tris-HCl SDS-PAGE验证 DNA-抗体缀合物的合成5分钟，并用Molecular Imager FX凝胶扫描仪 (Bio-Rad)显影。使用适当的^和发射滤光片，类似iW涉及荧光抗体或 荧光标记寡核苷酸的缀合>^应进行成4象。
通过凝胶迁移率变动测定来测量^A IL-4上不同寡聚体(链Al，) 的载荷)(见图1的图b )。通过改变SANH与抗体的化学计量比(泳道I-IV 分别对应于300:1、 100:1、 50:1、 25:1)，可以控制平均附着寡核普酸数。
值得注意的是，尽管上述缀合物合成方法预计导致针对每个抗体的 DNA载荷分布，但是该作用可受到进行PAGE分析的方法的影响。尤其 观察到，凝胶电泳之前的热诱导变性的正常条件(100°5分钟)降低了显 影的DNA链数量，这可能是由于DNA与蛋白质之间的腙键断裂所致。通 it^:松变性条件，在60°加热5分钟(良好皿所需最小值)的样品显示 至多7条离散的条带，而在100。加热5分钟的相同样品显示没有附加的寡 核苷酸。
实施例2:生产多核苷酸编码的链霉亲和素
DNA编码的链霉亲和素的产生根据实施例1中所述的用于生产 DNA编码的抗体相同的途径进行。唯一的区别是SANH:链霉亲和素比例 维持恒定为100:1。
实施例3:优化多核苷酸编码抗体的多核苷酸载荷
进行多种测定时要考虑用寡核苷酸标记抗体时的不利空间效应，所 述测定例如本文所述的免疫测定和细胞分i^/捕获实验。为此，研究了 DNA 所编码的抗体保持识别细胞表面标志物的能力，通过荧光活化细胞分选 (FACS)来显现。通过使用共价标记在DNA上而不是抗体上的荧光团，使 用FACS对多核苦酸编码的缀合物优化DNA载荷。为进行该分析，以 SANH与抗体的不同化学计量比(5:1、 25:1、 50:1、 100:1、 300:1)将5' 胺化的、3'FITC标记的DNA标记在抗CD90.2抗体上。这平均产生了分别具有1、 2、 3、 4-5和6-7条FITC-DNA链的缀合物，如通过劍欧迁移 率测定所测量的，见图1的图d。通过用流式细胞仪监测FITC荧光，测 试这些缀合物结合T细胞系VL3 (表达CD卯.2)的能力。使用B细胞系 A20 (CD卯.2阴性)作为阴性对照(见图3图a和b )。
具体地，将VL3和A-20细胞在水上与0.5 ng FITC-缀合的大鼠抗小 鼠CD90.2 (Thyl .2, BD Pharmingen,克隆30-H12,目录号553012)在100 HL PBS-3% FCS中孵育20分钟。还用等摩尔量的抗CD90.2/FITC-DNA 缀合物孵育细胞，所述缀合物特征是不同的FITC-DNA载荷。用PBS-3% FCS将细胞洗涤一次，然后在运行BD FACSDivaTM软件的BD FACSCantoTM设备上通过流式细胞术进行分析。
结果在图3中显示，其中显示了将抗CD卯，2/FITC-DNA缀合物与 市售FITC抗CD卯.2抗体(无DNA)进行比较的FACS曲线(图a)和 直方图(图b)。
如图3所示，该缀合物结合VL3细胞(100%),与A20具有4艮小的 非特异性相互作用(1.3%)。与FITC抗CD90.2相比，总体荧光强度下降 10倍，与A20的非特异性结合则稍高。图b所示针对多种FITC-DNA载 荷的平均荧光强度的直方图显示，当DNA链的数量从1提高至2至3时 荧光强度大致是线性的，对应于l、 2和3个生色团(每Ml个)。对更 高的载荷而言。荧光^1稳定的，然后下降。
具体地，在更高的载荷下，荧光的增加首先稳定(4-5寡聚体)然后 降低直至最高载荷(6-7寡聚体)。因此，过量的DNA标记(4-7寡聚体) 确实在空间上降低了抗体识别细胞表面标志物的能力。用50:1的SANH: 抗体比例(对应于约每个抗体三条DNA链)合成的抗体实现了对细胞表 面标志物识别而言的最佳载荷。考虑这一观察结果而进行了随后的细胞分 选实验。与FITC抗CD90,2对照相比，DNA抗体缀合物具有减少了 10 倍的荧光和对A20细胞稍高的非特异性结合。 一个可能的因素是对于DNA 抗体缀合物和市售抗体而言，荧光团与抗体的化学计量比是不同的。对 DNA抗体缀合物而言，DNA的每糸^;仅附着于一个荧光团(即带有一条 DNA链的缀合物具有1:1的荧光团:抗体比例)，而市售抗体通常每个抗体 具有多于一个荧光团(即荧光抗体具有>1的荧光团:抗体比例)。
因此，减少了 IO倍的荧光不应被严格解释为DNA抗体缀合物亲和力减少了 10倍，尽管上文讨论的寡聚体空间效应确实有可能解释相对荧光
强度的一部分降低。与相应的未修饰抗体相比，使用如表面等离振子共振
(SPR)的方法直接测量DNA抗体缀合物的亲和力能够提供更多的结论性信 息。
如下进行多核苷酸编码抗体的多核苷酸载荷的进一步优化。研究了 两种不同长度的互补多核苷酸。 一组具有16个碱基的重叠，另一组具有 20个威基的重叠。根据以下实施例8中所示方法，针对16或20个的组设 计互不影响的DNA序列，并且根据经驺，发现，16个威基不具有可能产生 大量互不影响序列数的序列总数变异性。在转向20个威基时，可能序列的 原始库显著增加，并且计算互不影响序列似乎容易得多。应当注意，可能 序列的总数是指数性的(4n,其中n是互补区的长度)。
实施例4:制it微阵列
用Institute for Systems Biology (ISB-Seattle， WA)的微阵列^殳施通过 标准方法将DNA微阵列印制在包被胺的载玻片上。具体地，印制具有多 种寡聚体组合的DNA微阵列，所述寡聚体具有序列SEQ ID NO 2、 SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 6、 SEQ ID NO 8、 SEQ ID NO 10、 SEQ ID NO 12、 SEQ ID NO 14、 SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 18。
典型的点大小和间隔分别为150和500nm。多聚赖氨酸玻片是自制 的。在超声浴中用IPA和7jCl^空白的载玻片清洁10分钟。然后在150 W 下用氧等离子体将其处理60秒，然后迅速浸入去离子水中，产生硅醇末端 的高亲7jC表面。用氮喷枪将其干燥后，用多聚-L-赖氨酸溶液(Sigma P8920, 0.1%w/v，未稀释)应用于所述经等离子体处理的表面15分钟，然后用去
离子水沖洗数秒。最后，将这些处理过的玻片在6or;烘烤i小时。然后将
这些玻片送至ISB并如上所述进行印制。
实施例5:基于以多核苷酸编码的抗体的单^lt免疫测定
图5是使用DNA编码的链霉亲和素进行细胞分选实验的一个实例。 这时，首先以4:1的生物素-MHC: DNA所编码链霉亲和素的比例，将DNA 所编码链霉亲和素与其配体生物素标记的蛋白质接触。在此，所述蛋白质 是主要组织相容性复合体(MHC)。淘洗对应方案和溶液相细胞捕获实验二 者平行进行。具体地，将5 nl链霉亲和素-C3'与20 nl酪氨酸酶MHC组合在200filRPMI培养基中。使它们在水上装配20分钟。之后，对淘洗对应 方案而言，使四聚体与衬底结合30分钟并在PBS中冲洗，随后使2xl06 个细胞与阵列接触。在图b中，首先允许DNA编码的MHC与相同数量 的细胞在水上结合20分钟，之后与下层DNA阵列接触。两组之间的细胞
捕获效率是明显的。pMHC复合体的溶、;^目捕获比淘洗对应方案高得多。
值得注意的是，后一组事件的细胞捕获效率提高。
实施例6:包含以多核苷酸编码的抗体的蛋白质阵列
使用三种相同的山羊抗人IgG来展示用于空间定位抗体的多核苷酸 编码蛋白质方法，所述三种IgG各自带有不同的分子荧光团并且各自以独 特的DNA链编码。然后向用互补寡核苷酸点样的微阵列上引入含有所有 三种抗体的溶液。杂交两个小时并进行村底冲洗后，抗体根据
Watson-Crick >5^配对进行自装配。
具体地，如下产生抗体微阵列首先用0.1% BSA在3xSSC中将 DNA玻片在37匸下封闭30分钟。用dH20洗涤玻片并吹干。含有DNA-抗体缀合物的30nl溶液(3xSSC、 0.1%SDS、 0.1%BSA、 15ng/nl各种 缀合物)夹在显微镜载玻片与阵列之间，并在37X:孵育4小时。然后于37 匸下首先在1 x SSC、0.05% SDS中洗涤阵列并柔和搅动，然后在0.2 x SSC 中、最后在0.05 x SSC中洗涤。将玻片吹干并用Gene Pix 4200 A双色阵 列扫描仪(Axon InstrumentsTM)扫描。
对免疫测定而言，在单个试管中组合DNA编码的第一抗体(15 ng/pl)、抗原(3 ng/fil)和荧光标记的第二抗体(0.5 ng/ji1)。在37"C孵育2小 时后，如上文实施例3中所述将形成的抗体-抗原-抗体复合体引入微阵列 中。随后的洗涤步骤和显影是相同的。
具体地，分别用寡聚体A1'、 Bl'和Cl'标记三种在生物化学方面相 同的山羊抗人IgG (用Alexa488、 Alexa594或Alexa 647染料标记)。孵育 2小时后，将抗体/DNA缀合物定位于下层DNA微阵列指示的特定位点。
结果显示于图6和7中，其中显示了具有标度片段的空间编码蛋白 质阵列，所述标度片段对应于l mm。如图7所表明的，抗体与衬底上的 DNA装配，从而将>卯0个点的互补DNA芯片转化为多元件抗体微阵列(见 图7)。该观察结果意味着可以用类似的方式装配相当大的抗体阵列。实施例7:减少生物污着
任何蛋白质阵列的临界大小很可能被蛋白质非特异性结合的干扰所限制。在显现非特异性结合的影响的尝试中，向微阵列上相似地引入三种抗体两种带有以互补DNA标记点样的寡核苷酸的抗体，第三种是未修饰的抗体。具体地，使微阵列同时接触山羊抗人IgG-Alexa488/Al'、山羊抗人IgG-Alexa647/Cl，多核苷酸编码的缀合物以及不带有附加的DNA的山羊抗人IgG^Alexa594。
为了展示目的，在杂交后不将玻片彻底沖洗，因此观察到由非编码的荧光标记抗体的非特异性吸附所引起的高背景信号。
结果在图8中显示，其显示了多核苷酸编码蛋白质的方法对非特异性蛋白质吸附的抗性。
当阵列未被完4^闭和/或冲洗时，在载玻片的表面上观察到非特异性结合，但是在印制的DNA非互补性点上未观察到，即B1点没有来自非互补性IgG缀合物的荧光，也不显示来自未以DNA编码的蛋白质(山羊抗人IgG-Alexa594)的荧光。
抗体未进行化学编码的点样核苷酸区逸艮示少得多的非特异性附着蛋白质，意味着DNA大幅减小了活跃区域的生物污着。这样的生物污着阻滞让人容易联想到以聚乙二醇(PEG)功能化的衬底(Prime, K. L.;Whitesides， G. M. Science 1991, 252， 1164-1167. Prime, K. L.; Whitesides,G. M. J. Am. Chem. Soc. 1993,115， (23), 10714 - 10721)。与PEG相关的推定机制进行类比(Jeon, S. I.; Lee, J. H.; Andrade, J. D.; De Ge腿s， P. GJournal of Colloid and Interface Science 1991， 142， (1)， 149- 158. Jeon， S. I.;Andrade, J. D. Journal of Colloid and Interface Science 1991, 142， (1)，159-166. Andrade, J. D.; Hlady, V. Advances in Polymer Science 1986, 79，(1- 63))，申请人推测点样寡核苷酸的亲水特性与非特异性吸附期间经常暴露的蛋白质疏7jC部分的相互作用最小化。还在计算的双链体解链温度的5度以内进行了缀合物杂交实验，利用Watson-Crick严格性并从而消除了非特异性的DNA相互作用。在任何情况下，这种减少的生物污着意味着多核苷酸编码蛋白质方法很可能能够用于在单一环境中检测相当大的蛋白质组合。实施例8:以计算机进行多核苷酸无关化处理
另 一个重要的经验性考量是非互补性DNA链之间的相互干扰(cross talk)水平。DNA序列A1、 Bl和Cl与其互补体一起随机产生。惟一的限 制是包含用于实现灵活性(flexibility)的5， A1()区段和16个威基的识别长度。 进行实验时，发现存在少量但是可感知的噪音，所述噪音来自由于非线性 二IM目互作用而错配的序列。仅使用严格洗涤不能明显清除噪音。在任何 现实的多M平台中，该噪音都可与研究中的M数量成比例地增加。因 此，模型平台应当利用这样的DNA序列，所述序列彼此互不影响并且与 印制在DNA阵列上的所有暴露的互补链互不影响。
因此，以在37"C下所述序列与互补耙标之间的任何分子内和分子间 相互作用最小化为目标来设计DNA序列。使用Dirks等(Dirks， R. M.; Lin, M.; Winfree， E.; Pierce， N. A. Nucleic Acids Research 2004， 32， (4), 1392-1403)描述的范例进行计算机设计。具体地，设计并根据经验發汪了 六个互不影响的序列，并在表2中才艮道。
表2
编码多核苷酸 相应的基质多核苷酸 .
SEQ翻0:7 ,aaaaaaaaaaatcctggagctaagtccgtaSEQ!DNO:8 a今aaaaaaaatacggActtagctccaggat
SEQ翻0:9 aaaaaa'aaaagcctcattgaatcatgcctaSE(JiDNO:lO aaaaaaaaaataggcatgattcaatgaggc
SEQIDNO:II aaaaaaaaaaagcactcgtctactatcgctaSEQIDNO:12 aaaaaaaaaatagcgatagtagacgagtgc
SEQDN0:.13 aaaaaa人aaaatggtcgagatgtcagagtaSEQ圃O: 14 aaaaaaaaaatactctgacatctcgaccat
SEQDNO:15 aaaaaaaaaaatgtgaagtggcagtatctaSE辨NO: 16 aaaaaaaaaatagatactgccacttcacat
SEQ翻O:H 'aaaaaaaaaaatcaggta.aggttcacggtaSEQIDNO:I8. ' aaaaaaaaaattaccgtgaaccttacctgat
技术人员能够在阅读本公开内容后识别其他的无关化处理多核苷
实施例9:细胞捕获、分离和分选方法通过使用DNA标记的抗体来展示多核苷酸编码蛋白质用于多路细 胞分选的优化和用途。
使用标准逆转录病毒转导方案将两种鼠细胞系VL-3 T细胞(胸腺淋 巴瘤细胞系(Groves, T.; Katis， P.; Madden, Z.; Manickam， K.; Ramsden, D.; Wu, G; Guidos, C. J. J. Immunol. 1995,154， 5011-5022))和A20 B细胞 (小鼠B细胞淋巴瘤(Kim, K. J.; Langevin， C. K.; Merwin, R. M.; Sachs, D. H.; Asfsky, R. J. Immunol. 1979， 122, 549-554)，购自ATCC )设计为分 别表达mRFP和EGFP。如上所述，将针对这些细胞系各自表面标志物的 抗体(VL-3为抗CD卯.2， A20为抗B220(eBioscience))分别以DNA链 Al'和Bl'编码。
对分选实验而言，以106个细胞/100 nl培养基的浓度将细胞传代至 新鲜的培养基[RPMI .1640 (ATCC)，补充有10%胎牛血清、0.1 mM非必 需氨基酸和0.05 mM p-巯基乙醇，并与DNA-抗体缀合物(0.5照/100 pi) 在冰上孵育30分钟。离心后从上清液中去除过量的缀合物，之后将细胞重 悬于新鲜培养基中。细胞孵育之前，通过将残余胺基与pH = 7.4PBS中10 mM甲基-PEOu-NHS酯(Pierce)在室温下反应4小时而将微阵列玻片钝化， 以减少非特异性的细胞粘附。将细胞均匀地涂在微阵列表面上，并使其在 水上定位1小时。这段时间过后，在室温下用含1 mMMgCl2的Tris緩冲 盐溶液轻柔洗涤，去除未粘附细胞。同样地进行细胞富集实验，只是孵育 步骤在T细胞和B细胞(各106个/100 nl) 二者的1:1混合物存在下进行。
使用标准磁珠负选择方案和BD IMagTM细胞分离系统，分别从 EGFP和dsRed转基因小鼠(得自Jackson Laboratories )中纯化原代CD4+ 和CD8+T细胞。在基于多核苷酸编码的分级前，通过FACS分析这些群 体的纯度，发现其高于80%。
与先前所述类似，在PEG化的微阵列机制上同时进行细胞、基因和 蛋白质实验。
简言之，在用抗B220-B1， (0.5 ng/100 pl)标记后，将表达GFP的B 细胞(106个/100 jil)定位于Bl点上。去除未粘附的细胞后，将带有Cl'编码 的第一抗体和APC标记的第二抗体的TNF-a ELISA对与0.5 ng/pl FITC 标记的A1'—起引入，并使其在室温下杂交30分钟。然后用TBS+MgCl2 冲洗玻片并通过亮视野和荧光显微术显影。平行进行均质细胞实验和淘洗细胞实验。对均质细胞捕获过程而言，
将5 x 106个Jurkats (ATCC)与5照抗CD3/C3'缀合物一起悬浮在1 ml RPMI培养基中，并在冰上孵育l小时。通过离心去除过量的缀合物，并 将Jurkats重悬于200 fil新鲜培养基中，之后与DNA微阵列接触。在冰 上孵育1小时后，用TBS柔和地冲洗玻片。平行进行细胞淘洗实验；在水 上将1 ml RPMI中5 jig抗CD3/C3，缀合物在微阵列上孵育1小时，之后 在0,5xpBS中冲洗，然后在去离子水中冲洗。不要吹干玻片，而是轻叩 玻片，以去除大多数过量的溶液，保持阵列湿润。在冰上将Jurkats (5x 106个/200 jiL)立即置于阵列上1小时。随后的洗涤和显影步骤是相同的。
这些实验的结果示于图10，其中图a和b显示亮视野图像，其显示 根据本文公开的方法和系统的实施方案的均质细胞捕获过程的效率。
具体地，在图a中描述了均质测定，其中将以DNA标记的抗体与细 胞组合，然后将混合物引入点样的DNA阵列微芯片上。在图b中，首先 在点样的DNA阵列上装配以DNA标记的抗体，然后引入细胞。这些异质 过程与使用表面结合抗体诱捕特定细胞的传统淘洗方法是类似的。
通过比较图a和b中所示结果，通过评价均质细胞捕获(溶液相细 胞捕获)和非均质细胞捕获(表面限定细胞捕获)，将基于多核普酸编码 蛋白质的细胞分选与淘洗进行比较。均质的DNA编码蛋白质方法显示更 高的细胞捕获效率。
捕获效率的提高可能是由于若干因素。在均质细胞捕获中，DNA-抗体缀合物可以正确取向并与溶液中的细胞表面标志物结合。细胞捕获不 是由抗体与细胞表面标志物的相互作用驱动的，而是由多价DNA-抗体缀 合物与微阵列上互补DNA链通过协同结合而提高的亲和力驱动的，这大 幅提高了捕获效率。对纳米颗粒、DNA杂交方案已报道了类似的趋势 (Taton， T. A.; Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L. Science 2000, 289,1757-1760)。 使用淘洗方法(其与本文公开的非均质DNA-抗体定义的阵列相似)时， 捕获剂被限制为在表面上采取随机方向。抗体的活性被降低，就是因为与 细胞表面标志物相互作用的不正确取向，降低了最大亲和力和与相邻抗体 的协作。
在图c中显示了多路细胞分选实验的亮视野和荧光显微图像，其中 表达hiRTP的T细胞(红色通道)和表达EGFP的B细胞(绿色通道)的1:1混合物被空间层叠在点Al和Cl上，这两点分别对应于Al'和CI' 对抗CD90.2和抗B220抗体的编码。具体地，在图10c的实验中，两条独 特的DNA链与分别针对T细胞标志物CD卯.2 (ThyL2)和B细胞标志物 CD45R (B220)产生的抗体缀合。通过将表达单体红色荧光蛋白(Campbell, R. E.; Tour， O.; Palmer, A. E.; Stdnbach， P. A.; Baird， G S.; Zacharias， D. A.; Tsien, R. Y. iVw. A^/JoiA 2002， 99， 7877-7882) (mRFP)的T细胞 (VL-3，鼠胸腺淋巴瘤)和表达EGFP的B细胞(小鼠B细胞淋巴瘤) 的1:1混合物空间分离，展示了基于DNA-抗体的多路细胞分选。将该混 合物与针对T和B细胞标志物二者的独特编码的DNA-抗体缀合物一起孵 育，并引入适当点样的微阵列。结果显示，亮视野和假色荧光显微照片都 显示表达mRFP的T细胞在点Al富集，而表达EGFP的B细胞定位于 Bl，与各自抗体的DNA编码一致。
在图d中，展示了从小鼠收集的原代细胞多路分选的荧光显微照片。 通过分别使用以多核苷酸编码的缀合物抗CD4-A1，和抗CD8-C1，，将来自 EGFP转基因小鼠的CD4+细胞和来自dsRed转基因小鼠的CD8+细胞的 1:1混合物分离至点Al和Cl。原代细胞通常比已建立的细胞系更加脆弱。 这是由于它们必须从周围组织中提取出来(通常通过酶消化)，这是可导 致生存力降低的过程。另外，培养过程常选择特征是生存力和增殖潜能大 幅提高的克隆。因此， 一般性(generalized)的细胞分选技术还必须以最小 的样品处理适用于原代细胞。为了展示以多核苷酸编码的蛋白质方法用于 原代细胞分选的效用，通过磁性负排除分别从EGFP-和dsRED-转基因小 鼠中分离CD4+和CD8+ T细胞的合成混合物。使用抗CD4和抗CD8 DNA-抗体缀合物使混合物成层(stratified)。如图10d中所示，这两种细胞类型 根据附加的DNA编码被分离至不同的空间位置。
实施例10:使用以DNA编码的抗体与DNA印刷阵列的组合来进行多参 数多路分析
根据图12所示策略进行多^lt分析(细胞、mRNA和蛋白质)。
图11显示了用于细胞分选以及共检测蛋白质和cDNA(mRNA)的以 多核苷酸编码蛋白质方法。用不同的DNA寡聚体标记针对蛋白质(用于 细胞分选)的抗体或者其他蛋白质(包括细胞表面标志物)。然后将这些 缀合物与生物样品(细胞、组织等)组合，在那里它们与其相应的抗原结
46合。引入DNA微阵列上时，根据Watson-Crick4^配对进行的平行自装 配将结合的物质(bound species)定位至特定的空间位置，允许进行多路多 錄分析。
进行了免疫测定来展示本文公开的多核苷酸编码蛋白质检测多种靶 标(包括化学性质不同的靶标)的能力。具体地，进行该测定来检测蛋白 靶标IL4和多核苷酸B1。为此目的，用多核普酸C1编码对蛋白耙标IL4 具有特异性的抗体，并制备与多核苷酸B1互补的多核苷酸。如上所述将 与多核苷酸Bl互补的多核普酸和Cl'编码的抗IL4 一起孵育。特异性结合 后，引入针对IL4的荧光团第二抗体，并如图12中所示进行蛋白靼标IL4 和寡核苷酸Bl的同时检测。
为了强调图11所示平台的普遍多样性，将表达GFP的B细胞用Bl' DNA编码的抗体缀合物进行标记，并空间定位于以互补寡核苷酸编码的点 (Bl)上。细胞定位后，组合成FITC标记的Al， DNA和以Cl，编码的TNF-a 的免疫夹层，并引入相同的微阵列平台中。图13中所示的所得亮视野和荧 光显微图像显示了本文所公开方法和系统一个实施方案的平台用于同时 扩展至不同生物学复杂性水平的有效性。
具体地，图13显示显微图像，其显示了同时发生的B1点细胞捕获 以及Al与Cl点分别进行的基因和蛋白质多参数检测。亮视野图像显示位 于点Bl的表达EGFP的B细胞(绿色通道)、Al处FITC标记的(绿色) cDNA，和编码至Cl的APC标记的TNF-a夹层免疫测定(蓝色)。标度 线^J"应于300nm。
本文示例的多核苷酸编码蛋白质方法和系统的效率可能是由于使用 了将抗体锚定在衬底上的多核苷酸特异性结合。用于蛋白质检测或用于淘 洗细胞的常规抗体阵列(Wysocki, L. J.; Sato, V. L.,7Va汰爿cflrf. 1978，75,(6)，2844-2848)需要将抗体固定在醛、环氧、马来酰亚胺或疏水固 体支持物上(Liu， X.; Wang, H.; Herron, J.; Prestwich, Ci, Bioconjugate Chem. 2000,11, (755-761). Macbeath， G; Schreiber, S. L. Science 2000， 289， 1760-1763. Pal5 M.; Moffa, A.; Sreek腿ar， A.; Ethier， S.; Barder， T.; Chinnaiyan, A.; Lubman， D.爿wfl/. C/^附.2006, 78， 702-710. Thirumalapura， N. R.; Morton, R. J.; Ramachandran， A.; Malayef， J. R. Journal of Immunological Methods 2005， 298, 73-81)。由于表面诱导的变性，通常难以保持折叠的(活性的)抗体构象，所述变性取决于许多变量，
包括pH、离子强度、温度和浓度(Sdgel， R. R.; Harder, P.; Dahint, R.; Grunze, M.; Josse, F.; Mrksich， M.; Whitesides， G M.C7i亂1997, 69, 3321-3328. Ramsden， J. J. Chem. Soc. Rev. 1995， 24, 73-78. Fainerman, V. B.; Lucassen-Reynders, E.; Miller, R. Colloids Surf. A1998,143,141)。这 促进了对保持蛋白质天然构象的替代方法的开发，包括3维衬底如水皿 和聚丙烯酰胺(Arenkov， P.; Kukhtin, A.; Gemmel, A.; Voloshchuk， S.; Chupeeva, V" Mirzabekov， A. J朋/.及V c/r亂2000， 278， 123-131. Kiyonaka, S.; Sada, K.; Yoshimura， l.; Shinkai， S.; Kato， N.; Hamachi, I. Nature Materials 2004,3, 58-64.)，角质酶指导抗体在SAM上的固定(Kwon， Y.; Han， Z.; Karatan， E.; Mrksich, M.; Kay, B. K.爿na/. C7i亂2004， 76, 5713-5720)，和生物素化抗体在链霉亲和素包被表面上的偶联(Peluso, P.; Wilson, D.; Do, D.; Tran, H.; Venkatasubbaiah， M.; Quincy， D.; Heidecker， B.; Poindexter, K.; Tolani， N.; Phelan， M.; Witte, K.; Jung, L.; Wagner, P.; Nock，S.爿/ifl/.祝oc/^附.2003,312,113-124)。另外，阵列在整个制造过程中 需要始终维持湿润，以防止蛋白质变性(Macbeath， G; Schreiber, S. L. Science 2000， 289， 1760-1763)。另一方面，DNA微阵列通常被静电吸附(通 过点样)在胺表面上。
在同一玻片上同时检测DNA和蛋白质的一种选择可以是在同一衬 底上形成用于固定DNA和蛋白质的两种官能团，但这会显著提高系统的 复杂性和设计。或者，兼容性表面可以是活化酯载玻片，胺-DNA和蛋白 质均可与之共价附着。然而，发明人发现，与印制在共价制备的胺玻片上 的DNA相比，这些玻片对DNA的载荷能力是减小的，导致较差的信号强 度。另外，未反应的酯被7jC解成羧酸，其在正常的杂交緩冲液(pH 7)中带 负电，通过静电作用降低了 DNA相互作用。另外，为了研究细胞和蛋白 质，减少细胞非特异性结合而同时维持完整抗体功能性的最佳表面为丙烯 酰胺(Soen， Y.; Chen， D. S.; Kraft, D. L.; Davis, M. M.; Brown, P. O. PLoS Biology 2003,1， (3)， 429-438. Boozer, C; Ladd， J.; Chen， S.; Yu, Q.; Homola， J.; Jiang, S.爿""/. C7^附.2004， 76， 6967-6972)，其与DNA是不i容的。
另外，通过使用DNA作为用于细胞、cDNA和蛋白质的通用装配策 略，能够优化用于点样衬底上高DNA载荷和用于抗体上互补DNA载荷的 衬底条件。这导致用于蛋白质检测的高灵敏夹层测定以及高效细胞分选(与传统淘^目比)。
实施例ll:制it微流体i殳备
基于微流体的测定提供了优点，如降低的样品和试剂体积，以及缩 短的测定时间(Breslauer， D. N.; Lee， P. J.; Lee， L. P. Mol. BioSyst. 2006， 2， 97-112)。例如在某些操作条件下，表面结合测定动力学主要由分析物(蛋 白质)浓度和分析物/抗原亲和力决定，而不是由扩散决定(Zimmermann, IVL; Delamarche, E.; Wolf， M.; Hunziker, P. Biomedical Microdevices 2005， 7， (2)， 99-110)。通过将基于聚二曱基法氧烷(PDMS)的微流体通道结合在 DNA微阵列顶部来评价基于微流体的多核苷酸编码蛋白质途径。
具体地，使用常规软平版印刷(soft lithographic)技术由聚二曱基珪氧 烷(PDMS)制造微流体通道。目标是制造坚固的微流体通道，其在表面测定 完成后能够解体用于光学分析。通过光刻工艺(photoli也ographically)由高 分辨率透明掩蔽物(CadArt)制造主模，使得得到的流体网络由20条平行的 通道组成，每条通道具有10 x 600 jim的横截面轮"廓并且长为2 cm。 it^t 应于120 nl的通道体积。混合珪酮弹性体(Dow Corning Sylgard 184TM)# 将其倾倒在模具的顶部。固化后从模具上去除PDMS并用20号钢针 (Technical InnovationsTM)刺出样品输入口和输出口 。然后将微流体通道 对准微阵列顶部并在80"C烤箱与衬底结合过夜。
实施例12:使用以DNA编码的抗体进行基于微流体的测定步骤
用23号钢针和TygonTM管连接微流体设备，允许产生~ 0.5 jil/分钟 的气动控制流速。在Tris緩沖盐水(TBS)中进行多种测定，已发现TBS在 降低背景噪音方面比1 x SSC和PBS更好。用TBS中的1.0% BSA封闭各 通道，然后在流动条件下与DNA-抗体缀合物或免疫测定对接触10分钟。 在流动条件下与缀合物或抗原接触10分钟后，用緩冲液将通道洗涤2分钟， 并且将所述微流体构件从载玻片上取下，以用于扫描。在临成像前将整个 玻片在TBS中简单冲洗、吹干并在如上所述的阵列扫描仪上成《象。
在第一系列测定中，分别用寡聚体Al，和Bl，标记两种山羊抗人IgG (用Alexa594或Alexa 647标记)，并将其引入结合在微阵列DNA顶部的 微流体设备中，所述微阵列带有相应的互补链Al和Bl及非互4h^ Cl。 不添加编码至点Cl的多核苷酸编码的缀合物。在~ 0.5 jil/分钟流动10分
49钟后，去除微流体PDMS板并对载玻片成像。图14所示结果显示，抗体 缀合物在<10分钟内自装配在附加的寡核苷酸所编码的精确空间位置上 (见图14 )，与微流体中DNA杂交所报道的时间尺度一致(Erickson， D.; Li， D.; Krull, U.fiioc/^附.2003, 317， 186-200. Bunimovich， Y.; Shin， Y.; Yeo, W.; Amori, M.; Kwong, G; Heath, J. J. Am, Chem. Soc. 2006网络7〉 开时间2006年12月1日)DOI: 10.1021/ia065923u. Wei, C; Cheng， J.; Huang, C; Yen, M.; Young, T. Nucleic Acids Research 2005, 33， (8), 1-11)。 为了确认用于蛋白质检测的多核苷酸编码蛋白质策略，进行了其它测定， 其中利用编码抗体在多种标准免疫测定中检测相关抗原。
在标准免疫测定(Engvall， E.; Perlmann， P. O. J. Immunol. 1972， 109， 129-135)中，第一抗体被吸附在固体支持物上，然后依次引入含抗原样品 和标记的第二 "读数抗体"并孵育，其间进行冲洗步骤。为了简化这种常 规的五步式免疫测定，使用DNA所编码抗体的编码能力将整个夹层复合 体定位至用于多路读数的适当位置，将该测定减少至单步骤。
具体地，将非荧光的、DNA编码的第一抗体与抗原和荧光标记的(无 DNA)第二抗体组合。在这些条件下，只有当抗体-抗原-抗体夹层在均质 溶液中成功形成并定位在微阵列上时，才能空间编码荧光信号。
具体地，在其他的第一系列测定中，引入针对两种细胞因子(人IFN-y 和TNF-a)的DNA编码的抗体、相应抗原以及荧光标记的第二抗体。DNA 编码的抗体夹层测定自装配至其特定的空间位置，并在那里^l检测，如图 15a所示。完成这种多蛋白质免疫测定法也需要10分钟。
在使用第三白介素IL-2的第二系列测定中研究了基于微流体DNA 编码抗体的夹层免疫测定法的灵敏度极限。结果显示于图15b和图15c中， 其中使用荧光第二抗体(图b)显影并分别使用金非电沉积作为显影和放 大策略(图c)。
使用焚光读数策略，该测定法在以5 nM饱和浓度的互补DNA印制 的玻片上达到约l nM的灵敏度极限峰值(数据未显示)。对人IL-2-浓度 系列而言，首先将第一 DNA-抗体缀合物铺在表面上，然后与抗原和第二 抗体接触。这是因为在较低的抗原浓度下信号减弱，因为高比例的未结合 抗原的第一抗体与结合有抗原的第一抗体竟争与DNA阵列杂交。通过先 将阵列与第一 DNA-抗体缀合物接触，在随后与抗原和第二抗体接触之前洗掉了过量物，增强了信号。
使用了多种策略来提高灵敏度。首先，申请人推断，提高载玻片对
DNA的载荷能力会提高定位的多核苷酸编码缀合物的密度，因而提高可能 的捕获事件数。常规DNA微阵列被印制在胺^J^烷与玻璃Jl应而产生的 伯胺表面上(Pirrung, M. Angew. Chem. Int. Ed. 2002， 41,1276-1289)。通 过DNA磷酸主链上的负电荷与来自质子化胺的正电荷之间的静电相互作 用，在中性pH^Hf下固定DNA链。为了提高玻片的载荷能力，产生了多 聚赖氨酸表面，从而提高电荷密度以及与DNA相互作用的表面积。通过 釆用这些改变，有可能以100 nM的饱和浓度在载玻片上印制互补DNA。 相应地，基于荧光的测定法的灵敏度提高至10 pM (图15b )。
在一种不同的显影途径中，使用以金纳米颗粒标记的第二抗体，然 后使用非电沉积沉积(Hainfeld， J. F.; Powell, R. D.， Silver- and Gold-Based Autometallography of Nanogold. Gold and Silver Staining: Techniques in Molecular Morphology, Hacker, G. W" Gu， J.， Eds. CRC Press: Washington, DC， 2002; 29-46页)进一步放大信号，并将基于荧光的读数转 化为光读数。这是可能的，因为使用了空间而不是比色的多游"化。
具体地，以与上文公开相似的方式进行基于微流体的金放大实验， 重要的区别是使用生物素-第二抗体代替荧光标记的抗体。随后向每条通道 0ng/jil)中引入金-链霉亲和素(Nanoprobes)保持10分钟，之后用緩冲液将 通道彻底冲洗。去除PDMS后，根据制造商的方案用金增强试剂盒 (Nanoprobes)对整个玻片进行放大。
采用这些改i^，可在低于10 fM的浓度极限下容易地检测IL-2白 介素的存在(图15c),这代表高于基于荧光的微流体免疫测定法至少1000 倍的灵敏度。相比较而言，该方法比常规的ELISA灵敏度高100-1000倍 (Crowther, J. R.， ELISA; Theory and Practice. In Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc.: Totowa， New Jersey, 1995)， t匕来自命J造商的 相应人 IL-2 ELISA 数据灵敏度高 150 倍 (http:〃www.bdbiosciences.com/ptProduct.isp prodId=6725)。
这些实验的结果显示，与1步式免疫测定法相比，特别是在^[氐抗原 浓度下，通过与试剂依次接触进行的测定法具有提高的灵敏度。这很可能 是由于带有或不带有载荷的DNA抗体缀合物之间对下层DNA微阵列上杂交的竟争性结合。通过将阵列依次与多核苷酸编码的缀合物、抗原接触， 然后与第二抗体接触，提高了灵敏度。最合适的方法必须根据在便利性和
灵敏度方面所期望的结果来进行选择。然而仍然要强调，在微流体流动条
件下对各步骤而言仍然在10分钟内达到最大信号。因此在完全自动化的设 备中，可在1小时(包括30分钟的金放大步骤)内以低至10 fM的灵敏 度获得完整的微流体免疫测定。
实施例13:使用以金属纳米颗粒标记的DNA编码抗体进行靼标定量
使用以DNA编码的抗体与DNA阵列组合，根据图16和17中所述 策略检测数字蛋白质组学情况。具体地，进行测定来检测某些细胞因子 (IL2、 TNF-a和IFN-y )。以与上述3步式免疫测定相似的方式进行所有 的实验，重要的区别是使用40nm金颗粒并且检测方案是暗视野光散射显
具体地，在数字方法中，用40 nm金纳米颗粒标记第二抗体，所述 金纳米颗粒通过暗视野光散射显微术可容易地检测。更具体地，使用40 纳米的金纳米颗粒-链霉亲和素缀合物作为数字测定的检测探针。
用图18所示方法进行相关数字免疫测定的检测。根据图18所示方 法，使用暗视野显微镜的物镜测量散射光。即便是非常小的金纳米颗粒的 等离振子应答也容易地选取和检测。手动或使用颗粒计数的自动化软件包 计数个体颗粒。注意所有颗粒的散射颜色是非常类似的-黄至绿色。这是因 为金纳米颗粒(10)具有相当窄的尺寸范围(~60纳米直径)。在光散射显微 镜中可使用滤光片消除所有其它散射颜色，因而降低背景。
实验结果显示于图19到22中，其中使用瑞利光Jt射来显影缀合物。
在图19和20中显示了根据本文所公开方法和系统的一个实施方案 进行的数字测定法的灵敏度，其中展现了 TNF-a的浓度系列。来自该蛋白 质的信号可在低至IOO aM的浓度下被容易地鉴定。图19和20显示用本 文公开的方法和系统在不同的浓度下进行的TNF-a数字免疫测定的代表 性暗视野图像。使用由NIH提供的一种科学图像处理软件ImageJTM来自 动计数颗粒数。金纳米颗粒和TNF-a浓度绘制在图20的直方图中。
为了进一步评价该新技术在血清测量中的能力，在人血清(购自 Sigma-Aldrich )中加入上述三种细胞因子蛋白(IL2、 TNF-a和IFN-y)并进行与上文相同的基于金纳米颗粒的测定法。结果显示于图21中。具体 地，图a的图像从加入了下述三种蛋白质的血清样品中收集IFN-y、TNF-a 和IL-2。图b的图像来自数字免疫测定，其根据本文公开的方法和系统的 一种实施方案从健;^A血清中测量。所有这三种蛋白质通常均以低于可检 测的浓度存在于Aj6l清中。tnf-a低于检测限，但是ifn- y和il-2以数 飞摩尔/升(10"5M)的浓度水平存在。这一蛋白量远低于常规吸光度或荧光 elisa或甚至用本文公开的方法和系统的另一实施方案进行的免疫检测 的检测限。
发现根据上文所述的实施方案的方法在血清中运行良好，具有高灵 敏度和非常小的背景噪音。重要的是，数字免疫测定实施方案对这样的细 胞因子是灵敏的，所述细胞因子是生物信息性分子，但是以痕量存在于纯 的健;^^^jk清中。如图21右侧显示，存在对应于人ifn-y和il-2的信号， 但是未检测到tnf-a。该结果显示了其中使用金属纳米颗粒进行检测的本 文所>&开方法和系统的能力。
测试了均以相同浓度制备的上述三种人细胞因子蛋白的检测(图 22)。具体地，将三种不同的ssDNA'分子点样到衬底上，各个ssDNA'与标 记在第一抗体(抗IFN-y;抗TNF-a和抗IL-2 )上的ssDNA寡聚体互补。 在衬底与血清/蛋白质混合物接触后，引入用60纳米直径金纳米颗粒标记 的第二抗体。使用暗视野光散射显微镜显影纳米颗粒。
图22中所示结果可明确地显示出来，并且与基于荧光的测定一致的 是，由于与第一抗tnf-a抗体的高亲和力，tnf-a显示最佳信号强度。
应当注意，背景接近零，并且检测到蛋白质的动态范围为至少106。 这些类型的测定已被用于从健;^Ajk清中检测某些细胞因子(il2、 TNF-a 和IFN-y)。这在之前是不可能的，因为这些蛋白质仅以l-5飞摩尔/升的水 平存在(通过我们的测量)。应当注意， 一旦表征了抗体/蛋白质亲和力， 则这些类型的测定就是绝对和定量的，意味着它们不需要校准。
用本文公开的方法和系统对分子的数字检测易于适用于微流体环境 (来自图21的结果在微流体环境中进行)。除了这类微流体免疫测定带来 的样品大小和时间尺度益处外，还存在其它优点。例如，因为在读数之前 整个测定在溶液中进行，所以蛋白质变性(点样抗体微阵列的一个问题) 不降低结合效率。另外，涉及衬底支持抗体的任何测定都无法承受微流体芯片装配(其涉及在80匸的长时间烘烤)。将该方法设计成得到坚固的 PDMS微流体通道，其随后可解体用于光学读数步骤。
进行溶液相测定的另一益处是抗原和抗体均享有取向自由，确保固 体支持物不会限制分析物对捕获剂结合口袋的接近。
实施例14:诊断方法和系统
用于分析生物标志物的本文所公开方法和系统的一些初步校正和定 量在PI3K通路中进行，该通路在许多癌症中尤其是在成胶质细胞瘤中是 混乱的。具体地，在图23中显示了一种实施方案，其中应用该技本险测生 物标志物pten，它是成胶质细胞瘤(脑癌)中的重要标志物。
本文公开的方法和系统首先被用于基于荧光的测定中，以通过使用 pten作为标准品校准设备(图23，图a和b )。蛋白pten的校准用左侧7 个格表示，范围从25 nM到375 pM。右侧三个裆^R表pten阳性和pten 空白的样品。通过与校准格比较。能够内插得到pten的浓度在1 nM附近。 发明人随后继续定量成胶质细胞瘤细胞系U87中的pten表达水平(图a 和c)。显然，如图23所示，合理的pten水平(lnM)使用本文公开的方法 和系统是可检测的。
使用本文公开的方法和系统还可以在血清中进行生物标志物的检测 和相关分析，作为个体健康状态的指示。具体地，可使用本文公开的方法 和系统进行肝毒性研究。肝中的结果是特别有意义的，因为肝是人体中第 二大的器官(第一是皮肤)，并且与血持续接触。因此很有可能该器官中 的混乱会导致血清中所存在的肝特异性蛋白质生物标志物数量发生显著 改变。
从血清生物标志物发现到临床确认的示例性途径示于图24。
血清生物标志物发现的第一个步骤涉及通过现有方法在串联质谱法 中对血中蛋白质进行蛋白质组学分析。因此，使用串^t镨法发现在对鼠 模型施用高水平对乙酰氨基酚(acetomaniphen )后，约25种蛋白质的初 步蛋白质列表被上调或下调(图24的图a(l))。具体地，将所检测的肽回 复作图(map back),产生候选蛋白质生物标志物的列表。使用现有方法 在表面等离振子共振中筛选和验证这些生物标志物及其相关的捕获剂(抗 体)。具体地，使用SPR确认尤其有效的抗体对(图24的图b(2))。最后，为了能够进行高灵敏度的多i^监测，将这些经证实的蛋白质捕获剂转变到 根据本文公开的实施方案的微流体系统，使得可以监测血中的血清生物标
志物。具体地，设计并测试芯片，以检测来自全血清的4种肝特异性血清 蛋白和3种免疫特异性蛋白(图24的图c(3))。图24所示的结果表明，从 血清中亳无困难地检测出了所有的靶标。
所有上述证实均已在鼠或人或二者的血清样品中完成。
总而言之，本文提供了用于在样品中检测和/或分选乾标的方法和系 统，其基于组^H"吏用多核苷酸编码蛋白质和衬底多核苷酸。所述以多核苷
苷酸的编码多核苷酸组成，其中所述衬底多核苷酸附着于衬底。
提供了上文公开的实施例以对本领域普通技术人员完整公开和描述 如何制造和使用;^^开内容的设备、系统和方法的实施方案，而不旨在限 制发明人认为的公开内容的范围。用于实施;^/>开内容的上^式的修改 对本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包含于以下的权利要求范围 内。说明书中提到的所有专利和出版物代表了;$^>开内容所属领域技术人 员的技术水平。；^^开内容中引用的所有参考文献均通过引用并入，其程 度相当于各参考文献单独地通过引用以其整体并入。
在背景技术、发明详述和实施例中引用的每篇文献(包括专利、专 利申请、杂志文章、摘要、实验手册、书籍或其他公开内容)的全部公开 内容均通过引用并入本文。另外，与本文一起提交的序列表的硬拷贝和相 应的计算机可读形式均通过引用整体并入本文。
应当理解，；^/>开内容不限于具体的组合物或生物系统，它们当然 可以变化。还应当理解，本文使用的命名法仅用于描述具体实施方案的目 的，并不旨在限制。本说明书及所附权利要求书中使用的无数量词修饰的 名词均包括其复数含义，除非上下文明确表明不是这样。术语"多个"包 括两个或更多个指代物，除非上下文明确表明不是这样。除非另有i兌明，
员通常所理解的相同含义。尽管实践中能够使用与本文公开的相似或等同 的所有方法和材料，但是在本文中描述了用于测试具体实例的合适材料和 方法。已描述了4^>开内容的大量实施方案。尽管如此，应当理解，可进 行多种修改而不偏离本公开内容的构思和范围。因此，其他实施方案也在 以下权利要求书的范围之内。
权利要求
1. 检测样品中靶标的方法，该方法包括将附着于衬底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质相组合，该以多核苷酸编码的蛋白质包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸特异性结合；和检测与附着于衬底的衬底多核苷酸相结合的以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体。
2. 权利要求l的方法，其中如下进行附着于衬底的衬底多核苷酸 与以多核苷酸编码的蛋白质的组合提供附着于衬底的衬底多核苷酸；提供以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白质的 编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述靶标特异性结合，且所述编码多 核香酸与所述衬底多核苷酸特异性结合；和将该以多核苷酸编码的蛋白质与样品和衬底在一定条件下接触一 定时间，以允许所述以多核普酸编码的蛋白质在以多核普酸编码的蛋白 质-靶标复合体中与靶标结合，并且允许所述编码多核苷酸与所述衬底 多核苷酸结合。
3. 权利要求2的方法，其中如下进行所述以多核苷酸编码的蛋白 质与样品和与衬底的接触将所述以多核苷酸编码的蛋白质与样品在一定条件下接触一定时 间，以允许该以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶 标复合体中与靶标结合；和将所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体与衬底在一定条件下 接触一定时间，以允许所述编码多核普酸与所述衬底多核普酸结合。
4. 权利要求2的方法，其中如下进行所述以多核普酸编码的蛋白 质与样品和与衬底的接触将所述以多核苷酸编码的蛋白质与所述衬底在一定条件下接触一 定时间，以允许所述编码多核苷酸与所述衬底多核普酸结合；和将所述以多核苷酸编码的蛋白质与样品在一定条件下接触一定时间，以允许所述以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中结合。
5. 权利要求1到4中任一项的方法，其中如下对衬底上所述以多核 苷酸编码的蛋白质-靶标复合体进行检测提供经标记的分子，其包含与靶标特异性结合的分子和附着于该分 子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号；将所述经标记的分子与所述以多核普酸编码的蛋白质-乾标复合体 在一定条件下接触一定时间，以允许所述经标记的分子与所述以多核苷 酸编码的蛋白质-靶标复合体结合；和检测来自与衬底上以多核香酸编码的蛋白质-耙标复合体相结合的 经标记分子的标记信号。
6. 权利要求5的方法，其中所述标记化合物是金属纳米颗粒。
7. 权利要求1到6中任一项的方法，其中所述以多核苷酸编码的蛋 白质是抗体。
8. 权利要求1到4中任一项的方法，其中所述靶标是多种靶标，且 其中如下将附着于村底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质相 组合提供多种附着于衬底的衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特 异性的，并且在位置上可彼此区分；提供多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核苷酸编码的蛋白质 包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核普酸，其中所述蛋白质与所述 多种靶标中的靶标结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核普酸 中的序列特异性且位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合，各种蛋白 质和编码多核苦酸在结合方面可彼此区分；和将所述多种以多核苷酸编码的蛋白质与样品和所述多种衬底多核 苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述蛋白质与靶分子在多种以 多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中结合，并且允许所述编码多核苷 酸与所述衬底多核苷酸结合。
9. 权利要求8的方法，其中如下对衬底上多种以多核苷酸编码的 蛋白质-靶标复合体的进行检测提供多种经标记的分子，每种经标记的分子包含与所述多种靶标的 一种靶标特异性结合的分子以及提供标记信号的标记化合物，该标记化 合物附着于所述经标记的分子，各种经标记的分子在检测方面可彼此区分；将所述多种经标记的分子与所述多种以多核香酸编码的蛋白质-靶 标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许所述多种以多核苷酸编码 的靶标复合体与所述多种经标记的分子结合；和检测来自与村底上多种以多核苷酸编码的靶标复合体结合的多种 标记分子的标记信号。
10. 权利要求9的方法，其中所述标记化合物是金属纳米颗粒。
11. 权利要求8到10中任一项的方法，其中所述以多核苷酸编码的蛋白质中的蛋白质组分是抗体。
12. 权利要求1到4中任一项的方法，其中所述靶标是多种靶标， 该靶标包含至少一种靶多核苷酸，且其中如下将附着于衬底的衬底多核 苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质相组合提供多种附着于衬底的衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特 异的并且在位置上可彼此区分；提供至少一种经标记的多核苷酸，其特异性结合至少一种靶多核苷 酸，各种标记多核苷酸在结合方面可彼此区分；将所述至少一种经标记的多核苷酸与样品在一定条件下接触一定 时间，以允许所述经标记的多核苷酸与靼多核苷酸结合从而提供至少一 种经标记的靶多核苷酸，其中所述至少一种经标记的乾多核苷酸由这样 的序列组成，所述序列与序列特异性且位置上可区分的衬底多核苷酸特 异性结合；提供至少一种以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该 蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的靶标特异 性结合，且所述编码多核苷酸与序列特异性且位置上可区分的衬底多核 苷酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分， 各种蛋白质在结合方面与各种经标记的多核苷酸可区分，各种以多核苷 酸编码蛋白质在结合方面与各种经标记的靶多核苷酸可区分；将所述至少一种以多核苷酸编码的蛋白质与样品在一定条件下接触一定时间，以允许所述蛋白质与靶标在至少一种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中结合；和将所述至少一种经标记的靶多核苷酸与所述至少一种以多核苷酸 编码的蛋白质-靶标复合体和多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定 时间，以允许所述至少一种经标记的靶多核普酸与相应的衬底多核苷酸 结合，并且允许所述至少一种编码多核普酸与相应的衬底多核普酸结 合；该方法还包括检测与衬底上多种空间定位的衬底多核苷酸相结合的所述经标记 的靶多核苷酸。
13. 权利要求12的方法，其中如下对衬底上所述以多核苷酸编码的 蛋白质-靶标复合体进行检测提供多种经标记的蛋白质，每种经标记的分子包含与所述多种乾标 的一种靶标特异性结合的分子组分以及提供标记信号的标记化合物；该 标记化合物附着于所述经标记的分子；将所述多种经标记的分子与所述多种以多核香酸编码的蛋白质-靶 标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许所述多种以多核苷酸编码 的靶标复合体与所述多种经标记的分子结合；和检测来自与衬底上多种以多核苷酸编码的靶标复合体相结合的所 述多种经标记蛋白质的标记信号。
14. 权利要求13的方法，其中所述标记化合物是附着于该蛋白质的 金属纳米颗粒。
15. 权利要求12到14中任一项的方法，其中所述以多核普酸编码 的蛋白质中的蛋白质组分是抗体。
16. 用于检测样品中的靶分子的系统，该系统包含衬底，带有附着于该衬底上的衬底多核苷酸；和以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码 多核苷酸，其中所述蛋白质与靶标特异性结合，且所述编码多核普酸与 所述衬底多核普酸特异性结合。
17. 权利要求16的系统，该系统还包含经标记的分子，其包含特异性结合靶标的分子和附着于所述蛋白质 的标记化合物，该标记化合物提供标记信号。
18. 权利要求16的系统，其中靶标是多种靶标，该系统包含衬底，其带有附着于该衬底上的多种衬底多核苷酸，所述多种附着 于衬底上的衬底多核苷酸中的各种多核苷酸是序列特异性的且在位置 上可彼此区分；和多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核苷酸编码的蛋白质包含 蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种 靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核香酸与所述多种附着于 衬底上的多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的多核苷酸特异性 结合，各种蛋白质和编码多核普酸在结合方面可彼此区分。
19. 权利要求18的系统，该系统还包含多种经标记的分子，每种经标记的分子包含与所述多种靶标中 一种 靶标特异性结合的分子以及附着于该蛋白质组分的标记化合物，该标记 化合物提供标记信号，各种经标记的分子在检测方面可彼此区分。
20. 权利要求16的系统，其中所述靶标是多种靶标，所述多种靶标 包含至少一种靶多核苷酸，该系统包含衬底，其带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸，各种衬底多核苷 酸是序列特异性的且在位置上可彼此区分；至少一种经标记的多核苷酸，其与所述至少一种靶多核普酸特异性 结合，各种标记多核普酸在结合方面可彼此区分，各种经标记的多核普 酸用于生产经标记的靶多核苷酸，所述经标记的靶多核苷酸与所述多种 空间定位的衬底多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的衬底多核 苷酸特异性结合；至少一种以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白 质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标的靶标特异性结 合，且所述编码多核苷酸与序列特异性且在位置上可区分的衬底多核苷 酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分；各种蛋白质在结合方面可与各种经标记的多核苷酸区分；各种以多核苷酸编码的蛋白质在结合方面可与各种经标记的把多 核普酸区分。
21. 权利要求20的系统，该系统还包含至少一种经标记的分子，其包含与至少一种靶标特异性结合的分子 以及附着于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号。
22. 从多种靶标中分选靶标的方法，该方法包括提供附着于衬底的多种衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特 异性的并且在位置上可彼此区分；提供多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核普酸编码的蛋白质 包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中该蛋白质与所述多 种靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核普酸与所述多种衬底 多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合， 各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分；将所述多种以多核苷酸编码的抗体与样品在一定条件下接触一定 时间，以允许所述抗体与靶标结合，从而提供多种以多核普酸编码的蛋 白质-靶标复合体；和将所述多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体与所述多种衬底 多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述编码多核苷酸与附着 于衬底的衬底多核苷酸结合；由此在与衬底结合的多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中 分选所述多种靶标。
23. 权利要求22的方法，其中所述靶标是细胞。
24. 分选多种靶标的系统，该系统包含衬底，其带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸，所述附着于衬底 的多种衬底多核苷酸中的各种多核苷酸是序列特异性的且在位置上可 彼此区分；和多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核普酸编码的蛋白质包含 蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种 靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核苦酸与所述多种附着于 衬底的多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的多核普酸特异性结 合，各种蛋白质在结合方面可彼此区分，各种编码多核苷酸在结合方面 可彼此区分。
25. 用于在样品流体中检测一个或多个靶标的微流体阵列，其包含具有用于装载样品流体的微流体构件的微流体组件，和衬底组件，其带有多种附着于该衬底组件的衬底多核普酸，该衬底 多核苷酸是序列特异性的且在位置上可区分，该衬底组件与用于分析样 品流体的微流体组件中的微流体构件有效关联；其中每种所述衬底多核普酸由与其他衬底多核苷酸的序列互不影 响的序列组成。
26. 在样品流体中检测一种或多种靶标的方法，包括用权利要求25 的微流体阵列进行权利要求1到7中任一项的方法。
27. 在样品流体中检测一种或多种靶标的方法，包括用权利要求25 的微流体阵列进行权利要求8到11中任一项的方法。
28. 在样品流体中检测一种或多种耙标的方法，包括用权利要求25 的微流体阵列进行权利要求12到15中任一项的方法。
全文摘要
本文提供了基于将以多核苷酸编码的蛋白质与衬底多核苷酸组合使用而检测和/或分选样品中靶标的方法和系统。所述以多核苷酸编码的蛋白质由与预定靶标特异性结合的蛋白质以及与衬底多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸组成，其中所述衬底多核苷酸附着在衬底上。
文档编号C12Q1/68GK101522915SQ200780036725
公开日2009年9月2日 申请日期2007年8月1日 优先权日2006年8月2日
发明者荣 樊, 瑞安·贝利, 盖布·克翁, 詹姆斯·R·希思 申请人:加州理工学院