一种空心苋生防镰刀菌的制作方法

专利名称：一种空心苋生防镰刀菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及杂草的生物控制及微生物领域，特别是涉及一种空心苋生防镰刀菌 背景技术空心苋"7ter/7朋t力era p/Lz7orero^es)，又名空心莲子草或革命草，原产于巴西， 是世界十大害草之一，也是国家保护总局和中国科学院2003年1月拟定的第一批外来入侵 16种物种之一，已在我国20多个省、市、自治区广泛发生分布和危害成灾，危害各种水旱 农作物(包括粮食、蔬菜、水果、烟草、棉花、糖料、花卉和药材作物等)，造成严重的产 量和经济损失。据测定，空心莲子草在全生育期为害水稻、小麦、玉米和红苕等几种作物 引致的产量损失分别达45%， 36%， 19%和63%(谭万忠，1994)。它的水生类型在鱼塘等水生 环境中生长繁殖迅速，大大降低水中溶解氧含量，腐败后又污染水质，严重影响鱼、虾等 水生生物的生长。在河道和沟渠中的大量生长会堵塞水道，限制水流速度，增加沉积量， 对水上运输和农田灌溉造成极为不利的影响(李怀明，1994)。在路边、公用绿地、居民区 等生长破坏环境的美观，并且有可能滋生蚊蝇等一些害虫，危害人类健康(林金成等， 2003)。另外由于空心莲子草的适应力很强，因此有可能入侵湿地等，从而排挤其他植物 的生长，使得群落物种向着单一化方向发展，破坏生态环境中的生物多样性(余柳青等， 1998)。在我国，防除空心莲子草的措施主要是人工拔除和使用草甘膦等化学除草剂，但人工 除草费工费时且难以达到理想的效果，而过多地使用化学除草剂会造成环境污染和残留 (娄远来等，2002)。所以近年来杂草的生物控制受到了高度的重视。1987年中国农业科学 院生物防治研究所从美国佛罗里达州引入曲纹叶甲"《a^c7" A^rop力i7s)，该食草昆虫 的食性比较专一，引放后可能不会对主要农作物构成威胁(吴珍泉等，1994)。除了曲纹叶 甲外，我国科研人员还致力于空心莲子草的其他天敌调查研究。林冠伦(1990)和曹华国 (1997)等发现了多种取食空心莲子草的昆虫。我国在利用微生物防除空心莲子草方面也有进展。谭万忠等在空心莲子草上发现了一 种炭疽病菌，经初步鉴定病原为盘长孢刺盘孢(CbL ""n'c力鹏g7oeM力oro印ora)，并经 实验证明对空心莲子草有较强的抑制作用(谭万忠，1993)。向梅梅等(1999)分离到对空心莲子草有抑制作用的莲子草假隔镰刀菌(A^'/^ya a"exv7朋Merae)，并对其生长和产孢条 件进行了探索。植物病原微生物在侵染寄主植物使之发病的过程中往往会产生致病毒素 (Strobel， 1992)，这些毒素的发现为新除草剂的开发提供了足够的依据。这些天然的生 理活性物质具有高效、低毒、安全、不污染环境、无残留以及与微生物除草剂相比易贮藏、 加工、施用、其效果不依赖于环境条件、容易预测等优点。近年来，随着生化技术、分子生物学技术和生物工程技术的发展以及以菌治草研究的 深入，杂草科学家和农药化学家们更加关注微生物代谢产物的除草活性，为寻找新的天然 化合物除草剂或为仿生合成新型除草剂提供重要依据。目前，各国学者已对一些杂草病原 真菌毒素的培养条件、作用范围、分离纯化、除草活性、组分及结构等进行了研究。利用 植物病原真菌毒素，特别是某些寄主选择性毒素来控制杂草生长，已显示出良好的发展前 景，也是开发新型除草剂的重要途径。尽管如此，空心莲子草在我国的发生区域仍然在不断扩大，危害和造成的经济损失越 来越严重。因此，寻求对这种恶心杂草有强致病性和生防控制作用的病原微生物，由此进 一步研制无残留、不污染环境的生物除草剂，将不仅具有重要的商业开发应用价值，而且 能安全有效地控制空心苋的为害，避免由此造成的巨大经济损失。发明内容本发明的目的是提供一种对空心苋有很强致病作用和控制效果的杀草真菌。根据形 态学特征和基于"翻译延长因子"基因(TEF)的分子生物技术将其鉴定为一个镰刀菌 (Fusarimn)新种，通过试验测定确定了它生长产孢和侵染致病的最适条件，研究发现其通 过产生毒素使杂草植株发病死亡的致病机理，分析了病菌及其毒素的寄主专化性。 本发明目的是通过以下技术方案来实现的本发明的空心苋生防镰刀菌菌株通过以下步骤分离纯化而来在重庆和四川地区不同季节多次采集空心苋自然发病植株，采用马铃薯蔗糖琼脂培养 基(PSA),经室内组织培养和纯化得到不同类型的真菌，用柯赫氏证病方法确定其中的致 病菌，最后经过致病性试验比较筛选获得对空心苋有很强致病作用的杀草病原真菌 (FPT001菌株)。提取菌株的基因组DNA，用引物efl [5， -ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3，)] 和ef2 [5' -GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3，]做PCR扩增得到此真菌的翻译延长因 子基因序列，其长度为670bp，在Genbank的登录号为EU668362。通过Blast分析比对和 美国镰刀菌研究中心建立的"镰刀菌鉴定"(Fusarium-ID)软件鉴定，该菌为镰刀菌属一 新种。4本发明的空心苋生防镰刀菌菌株已于2008年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，邮编100101)，保藏号CGMCCN0.2570。 以下是空心苋生防镰刀菌的详细描述
FPT001杀草菌株的形态特征与分子技术鉴定在马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基上，菌 落生长速度很快，培养4天测量为30 40mm，初期白色，以后由于分生孢子团的产生而变 成淡粉红色；菌落圆形，表面的气生菌丝稀疏，白色，巻曲；产孢细胞瓶梗状，其上着生 单个大分生孢子；大分生孢子大量产生，呈镰刀状，较直或微弯，分3 5隔(少有6隔)， 顶细胞呈鸟喙状，孢子大小40.6 55.2X5.5 6. 1 Mm;基本上不产生小孢子；厚垣孢子 球型，无色，表面光滑，直径9. 1 12.0刚，大量产生于菌丝或大分生孢子的细胞之间。 根据这些形态特征，结合TEF基因鉴定结果，将这种真菌定名为空心苋镰刀菌，拉丁文学
这是真菌分类学上的一个新种，其依据主要有1)査阅现有镰刀菌属的相关分类文 献和其他参考资料(陈其，1988，镰刀菌属.农业出版；Booth C, 1971, The genus fiisarium; http:〃ww. doctorfungus.org/),这种镰刀菌的形态特征与其他种类有明显差异；这一 点经美国农业部"镰刀菌研究中心"的Gerser博士等验证；2)通过Blast分析和用镰刀 菌属分类专用的Fusarium-ID软件分析，该镰刀菌的TEF基因序列与所有已经记载的镰刀 菌种的TEF基因相似性小于96%以上(真菌中相似性小于98%即可确定为不同的种)。
空心苋生防镰刀菌的最佳培养和接种侵染条件该真菌菌落生长和产生分生孢子的最 适培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PSA),最适温度25。C，最适酸碱度为pH7.2,.在这些条件下， 菌落生长快，大量产生大分生孢子和厚垣孢子；光照对真菌生长产孢无明显影响。病菌侵 染致病的最佳条件是接种浓度在105/ml数量级或更高，接种后保湿和暗光24小时，并在 整个侵染期保持温度23 28°C。
空心苋生防镰刀菌的致病性和专化性空心苋镰刀菌对空心苋具良好的致病作用和生 长抑制效果。主要侵染植株叶片和茎秆。在室内用病菌的分生孢子悬浮液直接喷雾接种后， 3天即可发病，病株率达100%，植株顶部开始萎蔫，叶片失水黄化；9天以后整个植株萎 蔫死亡，其对空心苋的控制效果与草甘膦相当。在田间接种后效果显现稍延迟，第5天植 株顶部全部黄化，2周后萎蔫死亡。
在适宜条件下用高浓度分生孢子悬浮液(108/ml)接种试验结果表明，该真菌对水稻、 小麦、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在内的6科18种水、旱作物都 不致病，也不影响它们的种子萌发和植株生长，这说明空心苋生防镰刀菌是空心苋的专性致病菌，若用于研制空心苋除草剂，可以保证生境中其它植物的安全。
空心苋生防镰刀菌粗毒素用真菌的培养液，经过乙酸乙酯或活性炭吸附法萃取、旋
转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素。用该毒素的水液分别浸渍空心苋叶片和茎秆后24小
时内即表现毒性症状，72小时内叶片黄化。用此粗毒素溶液处理前述20种植物的种子和
植株后未观察到毒性症状，说明这种毒素也是高度专化的。


图1为空心苋生防镰刀菌菌落的形态特征
图2为空心苋生防镰刀菌的形态特征A为大分生孢子；B为分生孢子梗；C为分生 孢子产生厚垣孢子；D为菌丝产生厚垣孢子
图3为空心苋生防镰刀菌的翻译延长因子基因TEF序列
图4为空心苋生防镰刀菌对空心觅的室内和田间杀草效果上图为温室内喷雾接种分 生孢子悬浮液9天后空心苋植株全部萎蔫死亡(右边植株为对照)，下图为田间接种5天后 空心苋植株上部黄化。
图5为空心苋毒素的杀草效果A和B为对照，C和D分别是用乙酸乙酯和活性炭分
离的粗毒素处理叶片效果。
本发明的优点是从自然环境中分离获得的空心苋生防镰刀菌(,"sri"历 /^W^erwVes)，是首次发现并鉴定的一个真菌新种，其分生孢子接种体对世界十大恶性 杂草之一的空心苋""e/77朋t力era p力i";rerw'o^)具有很强的致病控制作用，它分泌的 毒素对这种杂草也具有很强的毒性致死功效。病菌的菌剂和毒素对重要作物及环境中其它 植物都没有不良影响，表现出针对空心苋的高度专化杀草活性，可通过发酵菌体或仿生合 成技术生产无残留的环保型真菌性除草剂，具有潜在的商业开发和应用价值，同时在空心 苋的生物防治实践中也具有重要的开发应用前景。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述 实施例h
杀草真菌的分离纯化与筛选
(1 )真菌分离培养用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，其配方是去皮的新鲜马铃薯200g, 蔗糖和琼脂各20g，加自来水至1000ml。先加水将马铃薯煮烂，双层纱布过滤后加入蔗糖 和琼脂，补充适量的水至1000ml，充分搅和均匀后装入三角瓶中，放入消毒器中灭菌后放 置。使用前加热熔融，倒入灭菌培养皿或试管中制成平板或斜面培养基，供真菌分离培养或菌种保存用。
(2) 分离培养和纯化从自然条件下采集具有典型病害症状的空心苋植株样品，漂
洗干净后剪取叶片病斑与健康部分交界的组织小块儿(2 mm),放入5%次氯酸钠溶液中表面 消毒以后用灭菌水漂洗3次，置于PSA平板中，在25。C温箱中培养并每天观察，待不同菌 落长出后适时分别割取菌丝先端，转移到新的PSA平板上继续培养成纯的菌落，再转移到 PSA试管斜面培养基上，并编号标明菌株，保存备用。
(3) 确定病原菌根据柯赫氏证病律步骤确定病原菌。用病叶组织分离纯化后获得 各种真菌给健康空心苋植株叶片涂抹或针剌点滴接种，避光保湿24小时，在28T下生长， 观察发病情况。引起接种叶片发病、表现相同症状的真菌即可确定为病原菌。
(4) 强致病菌筛选将上述试验确定所有病原菌以相同的方法(涂抹雾或针刺点滴) 给空心苋植株接种，并在相同适宜条件下培养观察接种植株上病害的严重程度，比较筛选 出引起空心苋发病严重的菌株，由此筛选获得了空心苋生防镰刀菌。
(5) 病原菌的鉴定l)形态学观察与鉴定.在PSA平板上培养病原菌，适时观察菌 落形态、分生孢子和厚垣孢子的显微特征；2)分子生物学鉴定.根据Geiser建立的技术， 提取菌株的基因组DNA,用引物efl [5， -ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3，)]和ef2 [5， -GGA (G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3，]做PCR扩增得到此真菌的翻译延长因子基因 序列，测序，并将序列登录到Genbank中；对该序列做Blast分析，同时采用Fusarium-ID 软件中全部现有镰刀菌属的种类比较，确定该镰刀菌的分类地位和种的命名。
实施例2:
空心苋生防镰刀菌的培养和接种条件试验
(1) 温度试验在培养5d的PDA平板上用打孔器取直径为0. 5cra的FPT001菌株的 菌丝块，接种于PDA培养基上，分别设10°C、 15°C、 20°C、 25°C、 30°C、 35。C和40°C 8 个温度处理，每个处理重复3次。置于7个预先设定好所需温度的光照培养箱中培养，并 用垂直十字法逐日测量菌落大小，每24h测量l次，连续测量5次，记录数据。培养基的 酸碱度约为pH7.0。由此确定镰刀菌的最适生长温度。
(2) 酸碱度实验实验采用PDA培养基，共设置11个酸碱度处理。分别用1.Omol/L 的NaOH和HC1溶液将培养基的pH值分别调节到4. 0、 5.0、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0 (用电子pH计测定)，每个处理重复5次；病菌接种和生长测量 方法同上。接菌处理后置于25。C下培养，每24h测量一次菌落直径，连续测量6次。由此 确定镰刀菌生长的最佳pH值。
7(3) 培养基种类的筛选实验共比较了6种培养基对空心苋生防镰刀菌菌落生长的 影响，除了马铃薯蔗糖培养基(PSA)外，另外五种培养基分别是1)马铃薯葡萄糖琼脂培 养基(PDA):水1000ml、马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂粉20g; 2)清水洋菜培养基(WA): 水1000 ml及琼脂粉20g; 3)胡萝卜培养基(CAA):水1000ml、胡萝卜200g、琼脂粉20g;
4) 空心莲子草根茎煎汁培养基(ARS):水IOOO ml、空心莲子草根茎200g及琼脂粉20g;
5) 空心莲子草叶片煎汁培养基(ALA):水1000 ml、空心莲子草叶片200g和琼脂粉20g。 在配制PDA、 CAA、 ARS及ALA时，先将所需量的马铃薯、胡萝卜、杂草根茎或叶片切碎并 放入水中煮烂(约煮沸30分钟)，而后过滤除掉残渣并定容至1000ml，最后再加入所需量 的化学物质成分，搅拌均匀，分别盛入三角瓶中湿热灭菌后备用。各种培养基的pH值约 为6. 8-7.0，培养温度25'C。由此确定病菌培养的最佳培养基。
(4) 病菌接种条件优化 一般影响植物病原真菌侵染的影子主要有几种浓度、温度、 保湿时间和光照。本发明中设置了 7个几种浓度(4. 50X103/ml， 1.25X104/ml, 6. 26X 104/ml， 1.62Xl05/ml, 3. 20X 105/ml, 5. 28X 106/ml， 1. 37 X 108/ml)，并根据前述空 心苋生防镰刀菌的最佳生长条件设置了位于20 3(TC间的5个温度，保湿(%)时间0、 12、 24、 32和48h，光照设置为1200Lux和3000Lux下分别照射0、 6、 12、 18和24h。每个 温度处理3株空心苋，每株5 6个叶片。由此分析确定病菌的适宜接种发病条件(接种浓 度、温度、保湿时间和光照)。
实施例3:
病原菌粗毒素分离
(1) 病菌培养滤液的准备在500ml三角瓶中分别倒入250ral马铃薯蔗糖(PS)培养 液，灭菌后待用。选取培养6-7d长势良好的菌落，用打孔器取06mm大小的菌饼，接种 到装有250mlPS培养液的三角瓶中，每瓶接种8片，在25'C培养箱中12h光照/天条件下 静止培养15天。在超净工作台上，用定性滤纸(中速)过滤，即可得到培养滤液。由此准 备足够的病菌培养滤液供毒素分离提取之用。
(2) 毒素的萃取及活性试验l)碳吸附法提取将培养滤液加5%的活性碳粉充分震 荡后，置于5 6'C冰箱内静置12h，用滤纸过滤碳粉，然后将过滤得到的活性碳粉浸泡于 10倍体积的4(TC热甲醇中，充分搅拌后静置，去除不溶物，浓縮淡黄色甲醇溶解液至黄 褐色，再将浓縮物溶于50mL热甲醇(4(TC)中，再次移出不溶物，上清液加3倍体积的氯 仿沉淀，移出黄色不溶物，把剩下的甲醇-氯仿溶解液蒸发至干，即获得粗毒素。2)有机 溶剂萃取用乙酸乙酯对培养滤液进行萃取，每一体积的培养滤液用等体积的乙酸乙脂萃取3次，每次用1/3体积的乙酸乙脂，然后合并有机相，经旋转蒸发，回收有机溶剂后即 可得到浓縮物。
将乙酸乙酯萃取和活性炭吸附法获得粗毒素分别用水溶解后用作对空心苋叶片浸渍 处理，测定其活性。结果两种提取物对空心苋都表现出很强的毒性。 实施例4:
病原菌及其毒素的安全(专化)性测定
(1) 供测试的作物选择了 6个科的18种重要水旱作物，包括禾本科的水稻、小 麦、玉米，茄科的番茄、辣椒和烟草，葫芦科的黄瓜和西瓜，十字花科的萝卜、甘蓝、油 菜和白菜，豆科的花生、豌豆、蚕豆、大豆和绿豆，以及锦葵科的棉花。
(2) 种子萌发试验选择前述18种作物的健康种子，分别用菌丝和孢子悬浮液、
病菌粗毒素溶液和清水(对照)浸泡12 36小时(小粒种子处理时间短，大粒种子处理时间 长)，放置在湿滤纸上，在25DC生长箱中萌发后记载种子萌发率。结果表明所测试的作物 种子萌发率与对照都没有显著差异。
(3) 作物植株生长试验用温水浸泡12 36h (根据种子大小而定)，放置在湿滤纸 上，在25T生长箱中催芽。待胚芽露出后播种到盆栽钵中。钵内加入经过水洗和高温烘干 的沙土，然后加入一定量营养液(水中加入适量的尿素、硫酸铵和磷酸钾)。播种后在温室 条件下生长，待植株长到适当大小时分别用菌丝和孢子悬浮液、病菌粗毒素溶液和清水(对 照)喷雾处理，同时以处理空心苋植株为发病对照。处理后每天观察记录各种植物的病变 情况，到第15天时收获植株，测定不同处理的生长量。结果表明，用空心苋生防镰刀菌 菌液和毒素液处理后空心苋植株分别在处理后第3天和第2天即表现出明显的病害和毒素 症状，而所有18种作物植株在处理15天后也没有任何病变，用菌液和毒素液处理后的植 株生长量与清水对照植株的生长量之间没有显著差异。这说明这种病菌及其毒素对供试作 物无任何不良影响。序列
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权利要求
1、一种空心苋生防镰刀菌(Fusarium philoceroides)，其特征在于菌株为FPT001，该菌株的保藏号为CGMCC NO.2570。
全文摘要
一种空心苋生防镰刀菌(Fusarium philoceroides)，从自然环境中分离获得，该菌在常规培养条件很容易产孢，最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PSA)，最适温度25℃，最适pH7.2；病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在＞10⁵/m，接种后保湿24h并保持温度23～28℃。其菌体制剂和毒素液对恶性杂草空心苋具有很强致病杀草作用，经发酵菌体或毒素仿生合成技术可生产环保型真菌除草剂，具有潜在的商业开发应用价值。用真菌培养液经乙酸乙酯萃取和活性炭吸附可得到致病粗毒素。该菌菌体悬浮液及其毒素液对水稻等18种重要作物都没有不良影响。
文档编号C12N1/14GK101555456SQ200810237209
公开日2009年10月14日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者军 周, 周冠军, 唐秀丽, 毕朝位, 王利君, 谭万忠, 谭舒心 申请人:西南大学