高产率产生异丁醇的酵母生物的制作方法

专利名称：高产率产生异丁醇的酵母生物的制作方法
技术领域：
本发明提供了代谢上经工程改造的微生物和产生这种生物体的方法。还提供了制 备作为生物燃料的代谢产物的方法，所述方法通过将合适的底物与代谢上经工程改造的生 物和来自该生物的酶制备物接触来进行。
背景技术：
生物燃料具有很长的历史，其可以追溯到20世纪初。早在1900年，Rudolf Diesel 在法国巴黎世界博览会上展示了依赖于花生油运转的机器。此后不久，Henry Ford展示了 他的依赖于源自玉米的乙醇运行的福特T型车。由于石油衍生的燃料供应量增加和较低成 本下的高效率，在20世纪30年代和40年代石油衍生的燃料取代了生物燃料。在20世纪70年代与美国油产量下降相伴随的市场波动导致了原油价格增长，而 生物燃料重新得到关注。今天，许多利益集团，包括政策制定者、工业策划者、有所意识的市 民和金融界都对用生物质衍生的生物燃料取代石油衍生的燃料感兴趣。发展生物燃料的主 要动机是其经济性、政治性和环保性。其中之一“油品高峰(peak oil)，，的威胁，即原油消耗率超过供给率，从而导致燃 料成本价显著增加，这导致对替代性燃料需求的增加。另外，中东和其他富油区域的不稳定 性增加了对本土生产生物燃料的需求。此外，与二氧化碳相关的气候变化的可能性有关的 环境问题是一个重要的社会和道德的驱动力，这种驱动力开始致使形成政府的规章和政策， 如汽车的二氧化碳排放量的上限、对二氧化碳排的税收以及对使用生物燃料的税收激励。乙醇是目前最丰富的发酵生产的燃料，但是其与汽油相比有几个缺点。相比之下， 丁醇作为燃料与乙醇相比有几个优点其可以由与生产乙醇相同的原料制备，但是与乙醇 不同，它可以与汽油以任何比率相容，并且也可以不经过改性在现存的内燃机中作为纯燃 料使用。与乙醇不同，丁醇不吸水并因此可以在现有的石油化工基础设施中储存和分销。由 于其接近于汽油的高能含量，其燃料经济性(英里/加仑)优于乙醇。此外，丁醇-汽油混 和物比乙醇-汽油混和物具有更低的蒸气压，其在降低蒸发性碳氢化合物排放中很重要。异丁醇具有与丁醇相同的优点，并且由于支化的碳链其还具有更高的辛烷值这个 额外的优点。异丁醇作为商品化的化学品也很有用，并且也是MTBE的前体。异丁醇可以在 表达异源性代谢途径的微生物中产生，但是这些微生物由于其固有的低性能特征而不适用 于商业，低性能特征包括低繁殖力、低滴度、低产率和在发酵过程中对氧的需求。

发明内容
在一个实施方式中，提供了产生异丁醇的方法。该方法包括提供包含产生异丁醇
10的代谢途径的重组微生物，所述微生物经选择从而以至少5%的理论产率(at a yield of at least 5 percent theoretical)从碳源产生异丁醇。该方法进一步包括在包含提供碳 源的原料的培养基中培养微生物，直至产生可回收量的异丁醇，以及回收异丁醇。在一些方 面，所述微生物经选择从而在以高于约10%、20%或50%的理论产率产生异丁醇。在另一实施方式中，此处提供的方法包括经工程化改造从而与亲本微生物相比包 括降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的重组微生物。在一方面，所述重组微生物在至少一种 丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包括突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性 的降低。在另一方面，所述重组微生物包括对丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的部分缺失，其导致 由该基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在另一方面，所述重组微生物包含对丙 酮酸脱羧酶(PDC)基因的完全缺失，其导致由该基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降 低。在又一方面，所述重组微生物包括对与至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因相关的调节 区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在另一方面，所述重 组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录的减少。在另一方面，所 述重组微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽 的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在另一实施方式中，此处提供的方法利用已经进一步工程改造从而表达将丙酮酸 (pyruvate)转化成异丁醇的异源代谢途径的重组微生物。在一方面，所述重组微生物经进 一步工程改造从而增加将丙酮酸转化成异丁醇的天然(naive)代谢途径的活性。在另一方 面，所述重组微生物经进一步工程改造从而包括至少一种由异源基因编码的酶和至少一种 由天然基因编码的酶。在又一方面，所述重组微生物经选择从而包括将丙酮酸转化成异丁 醇的天然代谢途径。在一个实施方式中，此处提供的方法包含酵母属进化枝(Saccharomyces clade) 的酵母重组微生物。另一个实施方式中，此处提供的方法包括重组生物体，其为酵母属狭义酵母微生 物(Saccharomyces sensu stricto yeast microorganism) 在一方面，酵母属狭义酵母 微生物选自如下的种之一酿酒酵母、酿酒酵母、库德里阿兹威酵母(S. kudriavzevii), S. mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis或其杂种。在另一实施方式中，此处提供的方法包括Crabtree-阳性重组酵母微生物。在一 方面，Crabtree-阳性酵母微生物选自如下的属之一酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、 德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。在另外的方面，Crabtree-阳性酵母微生物选自 酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克 鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母菌、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵 母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。在另一实施方式中，此处提供的方法包括后-WGD (全基因组倍增)酵母微生物。在 一方面，后-WGD酵母选自酵母菌属或假丝酵母属之一。在另一方面，后-WGD酵母选自酿酒 酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。在另一实施方式中，提供了一种产生异丁醇的方法。该方法包括提供重组微生物， 其包括产生异丁醇的代谢途径并经选择从而由碳源产生异丁醇。重组体进一步包括与亲本 微生物相比减少的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。该方法包括在包含提供碳源的原料的培养基
11中培养所述微生物直到产生可回收量的异丁醇并回收异丁醇。在一些方面，所述微生物是 酵母进化枝的酵母。在其他方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物 生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。在一方面，所 述微生物是酵母属狭义酵母。在另一方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲 本微生物生长速率的生长速率不依赖C2化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。在其他方面，所述微生物是Crabtree-阴性酵母微生物，其选自如下的属之一 克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属。在其他方面，所述Crabtree-阴 性酵母微生物选自乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、异 常汉逊酵母、产朊假丝酵母或Kluyveromyces Waltii0在其他方面，所述Crabtree-阴性 酵母微生物选自茁牙丝孢酵母、嗜木红酵母或Myxozyma vanderwaltii、乙醇假丝酵母、 Debaromyces carsonii> Pichia castillae。在另一方面，所述微生物是Crabtree-阳性酵母微生物。在一些方面，所述微生 物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在 葡萄糖上生长而PDC活性不改变。Crabtree-阳性酵母微生物可以选自如下的属之一 酵母菌属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。在其 它方面，所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、 Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁 氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。在其它方面， 所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率生长不依赖 C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。在其它方面，所述微生物是选自酵母属或假丝酵母属之一的后-WGD (全基因组 倍增)酵母。在其它方面，后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、 Saccharomyces casteili和光滑假丝酵母。在其它方面，所述微生物经工程改造从而以基 本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性 不改变。在另一方面，所述微生物是前-WGD(全基因组倍增)酵母，其选自如下的属之一 酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、管囊酵母属 (Pachysolen)、西洋蓍霉属或裂殖酵母属。在其它方面，前-WGD酵母选自如下克鲁弗酵 母、耐热克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假 丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、 嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tarmophilis)、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。在其它方面，此处提供的方法包括是非-发酵酵母微生物的微生物，其选自如下 的属之一丝孢酵母属、红酵母属或Myxozyma。在另一实施方式中，提供了重组微生物。该微生物包括产生异丁醇的代谢途径，所 述微生物经选择从而由碳源产生异丁醇。所述微生物还包括与亲本微生物相比降低的丙酮 酸脱羧酶(PDC)活性。在多个方面，此处提供的微生物包括Crabtree-阴性酵母微生物、酵 母进化枝的微生物、酵母属狭义酵母微生物、Crabtree-阳性酵母微生物、后_WGD(全基因 组倍增)酵母微生物、前-WGD (全基因组倍增)酵母微生物和非发酵酵母微生物。在一些实施方式中，此处提供的微生物已经工程修饰从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。附图简述在附图中说明了本发明的例示性实施方式，其中

图1例示了异丁醇途径的示范性实施方式；图2A例示了经由糖酵解产生丙酮酸，以及将丙酮酸转化成异丁醇的异丁醇途径 和将丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳的PDC途径；图2B例示了异丁醇途径，由于PDC途径的缺失或减少，该异丁醇途径接受额外的 丙酮酸以高产率地形成异丁醇；图EX4-1例示了在酿酒酵母Pdc-负型菌株GEV01584恒化进化过程中随时间变化 的碳源组成以及进料速率。该图显示乙酸盐怎样在480小时的时间内从0. 375g/L减少到 Og/L。其还显示了总进料速率。较高的进料速率意味着生长速率较高。由于恒化器包含 200ml培养物，稀释速率可以通过将进料率除以200ml计算得到；图EX4-2例示了与亲本菌株GEVOl 187相比在YPD中进化的(evolved) Pdc-负型 突变株GEV01863的生长。图EX4-3例示了与亲本菌株GEVOl 187不同，变体PCD突变株GEV01863在YPD培
养基中不产生乙醇。图EXl-I例示了质粒pGV1503的示意图。图EX1-2例示了质粒pGV1537的示意图。图EX5-1例示了质粒pGV1429的示意图。图EX5-2例示了质粒pGV1430的示意图。图EX5-3例示了质粒pGV1431的示意图。图EX5-4例示了质粒pGV1472的示意图。图EX5-5例示了质粒pGV1473的示意图。图EX5-6例示了质粒pGV1475的示意图。图EX6-1例示了质粒pGV1254的示意图。图EX6-2例示了质粒pGV1295的示意图。图EX6-3例示了质粒pGV1390的示意图。图EX6-4例示了质粒pGV1438的示意图。图EX7-1例示了质粒pGV1590的示意图。图EX7-2例示了质粒P GV1726的示意图。图EX7-3例示了质粒pGV1727的示意图。图EX8-1例示了质粒pGV1056的示意图。图EX8-2例示了质粒pGV1062的示意图。图EX8-3例示了质粒pGV1102的示意图。图EX8-4例示了质粒pGV1103的示意图。图EX8-5例示了质粒pGV1104的示意图。图EX8-6例示了质粒pGV1106的示意图。图EX8-7例示了质粒P GV1649的示意图。图EX8-8例示了质粒pGV1664的示意图。
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图EX8-9例示了质粒pGV1672的示意图。图EX8-10例示了质粒pGV1673的示意图。图EX8-11例示了质粒pGV1677的示意图。图EX8-12例示了质粒pGV1679的示意图。图EX8-13例示了质粒pGV1683的示意图。发明详述除非上下文中另有明确表示，如在此处及所附权利要求书中所使用的，单数形式 的“一种/ 一个”、“和”以及“该/所述”(“a"，“ and" and" the")包括复数的所指 对象。因此，例如，提及“一种/ 一个多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸，而提及“该/所 述微生物”包括提及一种或多种微生物等。除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属的技术领域一 个普通技术人员所理解的相同的含义。尽管与那些在此处描述的方法和材料相似或等价的 方法和材料可以用于所公开的方法和组合物中，此处描述了示例性的方法、装置和材料。上文以及全文中讨论的任何出版物仅是为了它们在本申请申请日之前的公开内 容而提供的。都不应理解为发明人由于在先公开的内容而承认本文的内容不能置于这些内 容之前。术语“微生物”包括来自古细菌域、细菌域和真核域(Domains Archaea，Bacteria and Eucarya)的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原 生生物(Protista)。术语“微生物细胞”和“微生物(microbe)”与术语微生物可以互换使用。“细菌”或“真细菌”，指原核生物的一个域。细菌包括如下的至少11个不同 的类群(1)革兰氏-阳性(gram+)细菌，其中有两个主要的亚类⑴高G+C组(放 线菌(Actinomycetes)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)、其它) (2)低 G+C 组(芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳杆菌(Lactobacillus)、 U 胃 求胃(Staphylococci)、f连 求胃(Streptococci)、^帛 # (Mycoplasmas)) ； (2) ^ 形菌(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰氏-阴性细菌(包括大多数“普 通”革兰氏-阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如氧光能利用菌；(4)螺旋体 (Spirochetes)和相关物种；(5)浮游菌(Planctomyces) ； (6)拟杆菌(Bacteroides)、黄杆 菌(Flavobacteria) ； (7)衣原体(Chlamydia) ； (8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(又称 厌氧光能利用菌)；(10)抗辐射微球菌和相关菌；(11)热袍菌(Thermotoga)和嗜热栖热腔 菌(Thermosipho thermophiles)。“革兰氏-阴性细菌”包括球菌、非肠杆菌(nonenteric rods)和肠杆菌(enteric rods)。革兰氏-阴性细菌的属包括，例如，奈瑟氏菌属(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、 巴斯德氏菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西 丝菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、博德特氏菌属(Bordetella)、埃希氏 菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆 菌属(Bacteroides)、乙酸杆菌属(Acetobacter)、产气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属 (Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋 体属(Treponema)禾口梭形杆菌属(Fusobacterium)。“革兰氏阳性细菌”包括球菌、不产孢子的杆菌(nonsporulating rods)和产 孢子的杆菌(sporulating rods) 0革兰氏阳性细菌的属包括，例如，放线菌、芽孢杆 菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌 属(Erysipelothrix) > ff lif M (Lactobacillus)、李其Jf 特菌属(Listeria)、分枝杆菌 属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Norcardia)、葡萄球菌属 (Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)禾口链霉菌属(Streptomyces)。术语“属”定义为*艮据 Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea(细菌禾口 古细菌的分类大纲)(Garrity，G. M.，Lilburn, T. G.，Cole, J. R.，Harrison, S. H.，Euzeby， J. , and Tindall, BJ. (2007)The Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea. TOBA Release 7. 7, March 2007. Michigan State University Board of Trustees, [http:// www. taxonomicoutline. org/])定义为相关禾中的分类群。术语“种”定义为密切相关的生物体的集合，其具有大于97%的16S核糖体RNA序 列同源性和大于70%的基因组杂交，并且与所有其它生物体有充分的区别从而被认为是不 同的单位。术语“重组微生物”与“重组宿主细胞”在此处可互换使用并指如下的微生物，所 述微生物经遗传修饰以表达或过表达内源多核苷酸，或表达异源性多核苷酸(例如包含在 载体中的那些)，或在内源基因的表达上有变化。“变化”的意思是基因的表达、或RNA分子 水平或编码一种或多种多肽或多肽亚基的等效RNA分子水平、或一种或多种多肽或多肽亚 基的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在没有该变化时所观察到的。例 如，术语“改变”可以表示“抑制”，但是词语“改变”的意思并不限于这个定义。关于基因序列的术语“表达”指该基因的转录，以及在适当时，将所得的mRNA转录 物翻译成蛋白质。这样，从上下文中可明确，蛋白质的表达是由开放读码框序列的转录和翻 译产生的。宿主细胞中期望产物的表达水平可基于细胞中存在的相应mRNA的量或由所选 序列编码的期望产物的量来决定。例如，从所选序列转录的mRNA可以由PCR或Northern
( 0M Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))。由所选序列编码的蛋白质可以通过多种方法 定量，例如，通过ELISA，通过测定蛋白质生物活性的含量，或通过采用不依赖这种活性的测 定法，如蛋白质印迹或放射免疫测定，其使用识别蛋白质并与蛋白质结合反应的抗体。参见 Sambrook et al，1989，见上文。所述多核苷酸通常编码与产生期望代谢产物的代谢途径有 关的目标酶。术语“重组微生物”和“重组体宿主细胞”应理解为不仅仅指具体的重组微生 物，还指这种微生物的子代或潜在子代。由于某些修饰可能因为突变或环境影响而在在后 代中产生，所以事实上这些子代可能与亲本细胞不同，但是其仍然包含在此处所用的术语 的范围之内。术语“野生型微生物”描述出现在自然界的细胞，S卩，未经遗传修饰的细胞。野 生型微生物可以被遗传修饰以表达或过表达第一目标酶。这种微生物可以在经修饰而表达 或过表达第二目标酶的微生物的产生中充当亲本微生物。依次类推，可以修饰经修饰以表 达或过表达第一和第二目标酶的微生物以使其表达或过表达第三目标酶。
因此，“亲本微生物”起到连续遗传修饰事件的参照细胞的作用。每次修饰事件都 可以通过将核酸分子引入参照细胞来完成。这种引入促进目标酶的表达或过表达。应该理 解的是术语“促进”包含通过对亲本微生物中的例如启动子序列进行遗传修饰而活化编码 目标酶的内源多核苷酸。还应理解的是术语“促进”包含向亲本微生物中引入编码目标酶 的异源多核苷酸。术语“工程改造”指的是导致微生物中可查的变化的任何操作，其中所述操作包括 但不限于插入对于所述微生物是异源的多核苷酸和/或多肽和突变对于所述微生物是天 然的多核苷酸和/或多肽。术语“代谢上工程改造的”或“代谢上工程改造”涉及为了产生 期望的代谢产物而进行的合理的途径设计以及组装生物合成基因、与操纵子相关的基因及 这些多核苷酸的控制元件。“代谢上工程改造的”还可包括通过调节优化代谢通量和使用遗 传工程和适当的培养条件优化转录、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质功能，包括将与通向期望 途径的中间物竞争的竞争性代谢途径减少、破坏或敲除。术语“代谢上工程改造的微生物”和“修饰的微生物”在说明书中可以互换使用并 且不仅仅指特定的题述细胞，还涉及这种细胞的子代及潜在子代。因为可能因突变或者环 境影响而在后代中发生修饰，所以事实上这种子代可能与亲本细胞不同，但是仍然包含在 此处所使用的术语范围内。此处所用的术语“突变”表明任何导致改变的核酸或多肽的对核酸和/或多肽的 修饰。突变包括，例如，多核苷酸中的点突变、缺失或单个或多个残基的插入，其包括出现在 基因的蛋白编码区内的改变以及在蛋白编码序列以外区域(例如，但不限于，调控或启动 子序列)中的改变。遗传改变可以是任何形式的突变。例如，突变可以构成点突变、移码突 变、插入或部分或全部基因的缺失。此外，在一些修饰的微生物的实施方式中，微生物基因 组的一部分已经被异源多核苷酸取代。在一些实施方式中，突变是天然存在的。在其他实 施方式中，突变是人工选择压力的结果。在其他实施方式中，微生物基因组中的突变是遗传 工程改造的结果。术语“生物合成途径”，也称为“代谢途径”，指的是为了将一种化学物质(chemical specie)转化为另一种化学物质的一组合成代谢的或分解代谢的生化反应。如果基因产物 平行或连续地作用于相同的底物，产生相同的产物，或作用于或产生在相同底物和代谢终 产物(即代谢产物)之间的代谢中间产物，那么他们属于相同“代谢途径”。此处使用的关于分子，且特别是酶和多核苷酸的术语“异源”表示分子在生物体中 表达，该生物体不同于分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体，而与表达 水平无关，表达水平可能低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。另一方面，此处使用的关于分子，且特别是酶和多核苷酸的术语“天然”或“内源” 表示该分子在生物体中表达，该生物体是所述分子所起源的生物体或在自然界中存在该分 子的生物体，而与表达水平无关，表达水平可能低于、等于或高于该分子在天然微生物中的 表达水平。应理解的是在重组微生物中可以修饰天然酶或多核苷酸的表达。术语“原料”定义为提供给微生物或能够产生其他产物的发酵过程的原材料或原 材料的混合物。例如，碳源，如生物质或由生物质衍生的含碳化合物是供在发酵过程中产生 生物燃料的微生物用的原料。然而，原料可以包括碳源之外的营养物。术语“底物”或“合适的底物”指的是通过酶的作用转化或要转化为另一种化合物
16的任何物质或化合物。该术语不仅仅包括单一的化合物，还包括化合物的组合，如包含至少 一种底物或其衍生物的溶液、混合物以及其他材料。此外，术语“底物”不仅包括提供适宜 作为起始材料使用的碳源的化合物，如任何生物质衍生的糖，还包括如此处描述的在与代 谢工程改造的微生物有关的途径中使用的中间产物和终产物代谢产物。术语“发酵”或“发酵过程”定义为这样的过程，其中在包含原材料(如原料和营 养物)的培养基中培养微生物，其中所述微生物将原材料(如原料)转化为产物。术语“细胞干重”或“CDW”指的是用本领域的技术人员已知的方法将包含在微生 物内的水去除以后微生物的重量。CDW以克表示。术语“生物燃料”指的是这样的燃料，其中包含在该燃料中的所有的碳都衍生自生 物质并通过微生物以生物化学方法转化(至少部分转化)为燃料。生物燃料进一步定义为 一种包含小于0. 5个氧原子/碳原子的非_乙醇化合物。生物燃料本身就是燃料，但可以 与石油-衍生的燃料混合以产生燃料。生物燃料可用作石油化工-衍生的汽油、柴油或喷 气燃料的替代品。术语“容积生产率”或“生产率”定义为单位时间每体积培养基形成的产物的量。 容积生产率是以克每升每小时(g/L/h)表示的。术语“产率”定义为每单位重量的原材料获得的产物的量且可以表示为克产物每 克底物(g/g)。产率可以表示为理论产率的百分比。“理论产率”定义为由给定量底物能够 产生的产物的最大量，如用于产生产物的代谢途径的化学计量学所规定的。例如，葡萄糖成 为异丁醇的一种典型的转化的理论产率是0. 41g/g。照这样，0. 39g/g的由葡萄糖到异丁醇 的产率可以表示为理论值的95%或95%理论产率。术语“滴度(titer)”定义为溶液的浓度或溶液中物质的浓度。例如，发酵液中生 物燃料的滴度描述为每升发酵液中的溶液中生物燃料的克数(g/L)。“兼性厌氧生物”或“兼性厌氧微生物”定义为在存在或不存在氧的条件下能够生 长的生物。“严格厌氧生物”或“严格厌氧微生物”定义为在存在氧时不能生长并且暴露于任 何氧浓度均不能存活的生物。“厌氧生物”或“厌氧微生物”定义为不能在氧的存在下生长的生物。“有氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于需氧或兼性厌氧微生物而言足以 用作末端电子受体的条件。相反，“厌氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于微生物而言太低而不能用作 末端电子受体的条件。厌氧条件可以通过将惰性气体(如氮)充入发酵培养基直到作为氧 不再能够用作微生物的末端电子受体来实现。或者，厌氧条件可以通过微生物消耗发酵中 的可用氧直至氧不能用作微生物的末端电子受体来实现。“有氧代谢”指的是如下生化过程，其中氧被用作末端电子受体以由碳水化合物产 生能量，通常以ATP的形式。例如通过糖酵解和TCA循环发生有氧代谢，其中在氧的存在下， 将单个葡萄糖分子完全代谢为二氧化碳。相反，“无氧代谢”指的是其中氧不为包含在NADH中的电子最终受体的生化过程。 无氧代谢可以分为无氧呼吸，其中不同于氧的化合物被用作末端电子受体；和底物水平 磷酸化，其中利用来自NADH的电子以通过发酵性途径产生还原产物。
在“发酵性途径”中，NAD⑵H将其电子贡献给通过产生NAD⑵H上携带的电子的 同一代谢途径所产生的分子。例如，在某些酵母菌株的发酵性途径之一中，通过糖酵解产生 的NAD (P) H将其电子传递给丙酮酸，产生乙醇。发酵性途径通常在厌氧条件下有活性，但是 也可以发生在有氧条件下，在NADH没有经由呼吸链完全氧化的条件下。例如，高于某写葡 萄糖浓度时，Crabtree阳性酵母在有氧条件下产生大量乙醇。术语“副产品”指的是与生物燃料或生物燃料前体的产生相关的不需要的产品。副 产品通常当做废品丢弃，增加了生产过程的成本。术语“非发酵酵母”是一种酵母，其不能展示出其中利用来自NADH的电子经 由发酵性途径产生还原产物的无氧代谢，例如由葡萄糖产生乙醇和C02。非发酵酵母 可以通过“德拉姆试管检测，，(J. A. Barnett，R. W Payne, and D. Yarrow. 2000. Yeasts Characteristics and Identification. 3rd edition, p. 28-29. Cambridge University Press, Cambridge, UK.)或通过监测发酵产物(如乙醇和CO2)的产生来确认。此处所用的术语“多核苷酸”可以和术语“核酸”互换使用，并且指的是由两种或多 种包括核苷酸、核苷或其类似物的单体组成的有机聚合物，包括但不限于任意长度的单链 或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当时，任意长度的单链或双链、有义或反 义核糖核酸(RNA)，包括siRNA。术语“核苷酸”指的是由结合到嘌呤或嘧啶碱并结合到磷酸 基团的核糖或脱氧核糖组成几种化合物中的任一，并且它们是核酸的基本结构单元。术语 “核苷”指的是由嘌呤或嘧啶碱与脱氧核糖或核糖的组合组成的化合物(如鸟苷或腺苷)， 并且它特别存在于核酸中。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别指的是这样的核苷 酸或核苷，其中一个或多个单独的原子被不同原子或不同的官能团替换。因此，术语多核苷 酸包括任意长度的核酸、DNA、RNA、其类似物和片段。三个或更多个核苷酸的多核苷酸也称 为核苷酸寡聚物或寡核苷酸。可以理解的是此处描述的多核苷酸包括“基因”，并且此处描述的核酸分子包括 “载体”或“质粒”。因此，术语“基因”，也称为“结构基因”，指的是编码特定氨基酸序列的 多核苷酸，其包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可以包括调节性(不转录的) DNA序列，如启动子序列，其确定例如在何种条件下表达基因。基因的转录区可以包括非翻 译区(包括内含子、5'-非翻译区(UTR)和3' -UTR)，以及编码序列。术语“操纵子”指的是由共同启动子作为单一转录单元转录的两种或更多种基因。 在一些实施方式中，构成操纵子的基因是相邻的基因。可以理解的是可以通过修饰该共同 启动子而修饰整个操纵子的转录(即，增加、减少或消除)。或者，可以修饰操纵子中的任何 基因或基因的组合以改变所编码的多肽的功能或活性。修饰能够导致编码多肽的活性的提 高。进一步地，修饰可以赋予编码的多肽新的活性。示例性新活性包括可选底物的应用和 /或在可选环境条件中起作用的能力。“载体”是任何如下的手段，即可以通过该手段使核酸在生物体、细胞或细胞成分 之间增殖(propagate)和/或转移。载体包括病毒、噬菌体、原病毒、质粒、噬菌粒、转座子 和人工染色体如YAC (酵母人工染色体)，BAC (细菌人工染色体)和PLAC (植物人工染色 体)等，这些是“附加体(印isome)”，也就是说，其自主地复制或者可以整合入宿主细胞的 染色体内。载体也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链内由DNA和RNA 二者 组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、多肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等，它们本质上不是附加体，或者载体可以是包含一种或多种上述多核苷酸构建体的生物 体，如土壤杆菌或细菌。“转化”指的是将载体引入宿主细胞的过程。转化(或转导，或转染)可以通过包 括化学转化(例如乙酸锂转化)、电穿孔、显微注射、基因枪(或粒子轰击介导的传递)或土 壤杆菌介导的转化在内的许多方法中的任意一种来完成。此处使用的术语“酶”指的是催化或促进一种或多种化学或生化反应的任何物质， 其通常包括全部或部分由多肽组成的酶，但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)组成 的酶。此处使用的术语“蛋白质/蛋白”或“多肽”表示由两种或更多种氨基酸单体 (amino acidic monomer)和/或其类似物组成的有机聚合物。此处所使用的术语“氨基酸” 或“氨基酸单体”指的是包括甘氨酸和D或L光学异构体在内的任何天然和/或合成的氨 基酸。术语“氨基酸类似物”指的是一个和多个单独的原子被不同的原子或不同的官能团 替换的氨基酸。因此，术语多肽包括任意长度的氨基酸聚合物，其包括全长蛋白质，和肽以 及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也称为蛋白寡聚物或寡肽。关于第一家族(family)或种的原始酶或基因的术语“同源物(homolog) ”指的第 二家族或种的不同的酶或基因，其是通过功能、结构或基因组分析来确定的对应于第一家 族或种的原始酶或基因的第二家族或种的酶或基因。最通常的情况，同源物会具有功能、结 构或基因组相似性。使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物的技术是已知 的。克隆的序列作为同源物的身份(identity)可以使用功能测定法和/或通过对基因的 基因组作图来确认。如果编码蛋白质的核酸序列与编码第二蛋白质的核酸序列具有相似的序列，则该 蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或与第二蛋白质是“同源的”。或者，如果蛋白质与第二 蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则两种蛋白质具有同源性。(这样，为术语“同源蛋白” 定义的含义为两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。术语“类似物”或“类似的”指的是仅在功能上彼此相关但不来自共同的谱系 (descetn)或不共有共同祖先序列的核酸或蛋白序列或蛋白质结构。由于趋同进化，类似物 在序列上可能不同但是可以共有相似的结构。例如，如果两种酶催化相同的底物转化为产 物的反应、两种酶在序列上是无关的、且不论两种酶在结构上是否相关，那么这两种酶是类 似物或者是类似的。一般的微生物1-丁醇的天然生产者，如丙酮丁醇梭菌是已知的，但是这些生物体在发酵过程中 也产生副产品如丙酮、乙醇和丁酸盐。此外，这些微生物相对难以操作，可使用的手段比更 常用的生产宿主(例如酿酒酵母或大肠杆菌)少得多。另外，对这些天然生产者的生理学 和代谢调节知之甚少，妨碍了向高效率生产的快速进展。此外，尚未鉴定出能够以工业相关 量将葡萄糖代谢成为异丁醇的天然微生物。通过多种酵母菌种(包括酿酒酵母)产生异丁醇和其它燃料醇对于酒精饮料的蒸 馏者有特别的价值，对于他们来说燃料醇通常形成不需要的怪味(off-notes)。已经证明了 在多种生长培养基中在野生型酵母中产生异丁醇，所述培养基从葡萄酒制备过程中的葡萄 酉翏(grape must)(Romano, et al. ， Metabolic diversity of Saccharomyces cerevisiae
19strains from spontaneously fermented grape musts,World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 :311_315，2003)，其中产生了 12_219mg/L 异丁醇，到补充的基本 士音养基(Oliviera, et al. (2005)World Journal of Microbiology and Biotechnology 21 :1569-1576)，其产生了 16_34mg/L 异丁醇。Dickinson 等人(J Biol Chem. 272 (43) 26871-8,1997)的研究已经鉴定出在将支链氨基酸(例如，缬氨酸或亮氨酸)转化为异丁醇 的内源酿酒酵母途径中使用了酶步骤。此处提供的重组微生物可以表达多种异源和/或天然目标酶，该目标酶与从合适 的碳源产生异丁醇的途径有关。因此，代谢上“工程改造的”或“修饰的”微生物是经由将遗传物质引入所选的宿 主或亲本微生物中和/或通过修饰天然基因的表达，由此修饰或改变该微生物的细胞生理 学和生物化学而产生的。通过遗传物质的引入和/或对内源基因表达的修饰，亲本微生物 获得新的性质，例如产生新的或更大量的胞内代谢产物的能力。如在此处所描述，亲本微生 物中遗传物质的引入和/或对内源基因表达的修饰导致新的或改良的产生异丁醇的能力。 在亲本微生物中引入的遗传物质和/或表达得到修饰的基因含有基因、或部分基因，其编 码与产生异丁醇的生物合成途径相关的一种或多种酶，并且也可以包括用于表达这些基因 和/或调节这些基因的表达的别的元件，例如启动子序列。除了将遗传物质引入宿主或亲本微生物之外，经工程改造的或修饰的微生物还可 包括基因或多核苷酸的改变、破坏、缺失或敲除以改变该微生物的细胞生理学和生物化学。 通过基因或多核苷酸的改变、破坏、缺失或敲除，微生物获得新的或改进的性质(如产生新 的代谢产物或更大量胞内代谢产物的能力，改进代谢产物沿着所需途径的流量和/或降低 副产物的产量)。此处提供的重组微生物还可以以在亲本微生物中无法获得的量产生代谢产物。 “代谢产物”指的是通过代谢产生的任何物质或特定代谢过程中所必需的物质或参与特定 代谢过程的物质。代谢产物可以是一种作为代谢的起始材料(如葡萄糖或丙酮酸)，中间产 物(如2-酮异戊酸)或终产物(如异丁醇)的有机化合物。代谢产物可以用于构成更复 杂的分子，或其可以分解成简单的分子。中间代谢产物可以由其他代谢产物合成，可能用于 制备更复杂的物质，或分解成更简单的化合物，常常伴有化学能量的释放。示例性的代谢产物包括葡萄糖、丙酮酸和异丁醇。所述代谢产物异丁醇可以通过 代谢上经工程改造以表达或过表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径的重组微生物来产 生。将丙酮酸转化为异丁醇的示例性代谢途径可以由乙酰羟酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构 酶(KARI)、二羟酸脱水酶(DHAD)、2-酮酸脱羧酶(KIVD)、醇脱氢酶(ADH)组成。因此，此处提供了产生异丁醇的重组微生物，且在一些方面所述重组微生物可以 包括目标酶(如ALS、KARl、DHAD、KIVD和ADH)的高表达。本公开鉴定了在所述方法中有用的特定基因、本公开的组合物和生物体；然而会 被公认的是与这些基因完全一致是没有必要的。例如，在包含编码多肽或酶的序列的特定 基因或多核苷酸中可以进行改变，并筛选活性。通常这些改变包含保守突变和沉默突变。可 以使用本领域已知的方法筛选这些经修饰或突变的多核苷酸和多肽的功能性酶的表达。由于遗传密码固有的简并性，编码基本上相同或功能上等同的多肽的其它多核苷 酸也可以用于克隆和表达编码这些酶的多核苷酸。
正如本领域的技术人员所了解，修饰编码序列以提高其在特定宿主中的表达是有 利的。遗传密码具有64种可能密码子，是冗余的，但是大多数生物体通常使用这些密码子 的一个亚组。在某个种中最常被利用的密码子称为最佳密码子，而那些不常使用的密码子 被归为罕见或利用率低的密码子。密码子可以被置换以反映宿主的优选密码子选择，即有 时被称为“密码子优化”或“控制种密码子偏好”的过程。例如，可以制备含有特定原核或真核宿主所优选的密码子的优化编码序列(参 见，Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17 :477_508)，从而与产自非优化序列的转录物 相比增加翻译例或产生具有期望性质(如更长的半衰期)的重组RNA转录物。也可以修饰 翻译终止密码子以反映宿主偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是UAA 和UGA0单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密 码子(Dalphin et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24 :216_218)。例如，美国专利号第 6015891 以及其中引用的参考文献中提供了为在植物中表达而优化核苷酸序列的方法。本领域的那些技术人员将会认识到，由于遗传密码的简并性，多种核苷酸序列不 同的DNA化合物可以用于编码本公开给定的酶。此处涉及的上述编码生物合成酶的天然 DNA序列仅用于说明本公开的实施方式，而本公开包括具有编码本公开方法中利用的酶的 蛋白质和多肽的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。类似地，多肽通常可以容许其氨基 酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失和插入而不损失或不显著损失所需的活性。本 公开包括这些具有不同于此处描述的特定蛋白的氨基酸序列的多肽，只要所述修饰的或变 体多肽具有参照多肽的酶促合成代谢或分解代谢活性即可。此外，在此显示的由DNA序列 编码的氨基酸序列仅例示了本公开的实施方式。此外，对产生代谢产物有用的酶的同源物涵盖在此处提供的微生物和方法中。如此处所使用的，当氨基酸序列具有至少约30%、40%、50%、60%、65%、70%、 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99% 同一性时，两 种蛋白质(或蛋白质中的区域)基本上是同源的。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序 列的百分比同一性，比对序列以便进行最佳的比较(例如，为了最佳的排列，可将缺口引入 第一和/或第二氨基酸或核酸序列中，且为了比较的目的非同源序列可以忽略)。在一个实 施方式中，为了比较目的而比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30%、通常为至 少40 %、更通常为至少50 %、甚至最通常为至少60 %，还甚至通常为至少70 %、80 %、90 %、 100%。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列 中的位置由与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么在那个位置 上所述分子是相同的(如在此所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源 性”)。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数，其考虑缺口数和每 个缺口的长度，为了两个序列的最佳比对需要弓I入缺口。当对蛋白质或肽使用“同源的”时，认为不同的残基位置是因保守氨基酸取代而不 同。“保守氨基酸取代”是这样的取代，即其中氨基酸残基由具有化学性质(如电荷或疏水 性)相似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基所取代。一般而言，保守的氨基酸取代不会从 本质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而相互有区别的情 况下，百分比序列同一性或同源性程度可以向上调整以校正取代的保守性。本领域的技术 人员熟知实施这种调整的手段(参见，例如，Pearson W. R. Using the FASTA program tosearch protein and DNA sequence databases, Methods in Molecular Biology,1994, 25 :365-89，在此处通过提述并入)。下述六个组分别包含互为保守取代的氨基酸1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T) ；2)天冬 氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K) ；5)异亮氨 酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、 色氨酸(W)。也称作百分比序列同一性的多肽的序列同源性通常使用序列分析软件来测量。 参见，例如 the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center,910University Avenue, Madison, Wis. 53705。蛋白质分析软件用指定给各种取代、缺失和其它修饰(包括保守氨基 酸取代)的同源性量度来匹配相似序列。比如，GCG包含可按默认参数使用的程序如“Gap” 和“Bestfit”，以确定密切相关的多肽(如来自不同种生物体的同源多肽)之间或野生型蛋 白与其突变体蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参加，例如GCG Version 6.1。用于将分子序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较的 一种典型算法是计算机程序 BLAST(Altschul，S. F.，et al. (1990) “ Basic local alignment search tool. " J. MoI.Bioi.215 403-410 ；Gish, W. and States, DJ. (1993) " Identification of protein coding regions by database similarity search. " Nature Genet. 3:266_272 ；Madden, T.L. , et al. (1996) " Applications of network BLAST server “ Meth.Enzymol. 266 131-141 ；Altschul, S. F. , et al. (1997)" Gapped BLAST and PSI-BLAST :a new generation of protein database search programs. " Nucleic Acids Res.25 :3389_3402 ；Zhang, J. and Madden, T. L. (1997) " PowerBLAST :A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. " Genome Res. 7 :649_656),特别是 blastp 或 tblastn(Altschul，S.F.，et al. (1997) “ Gapped BLAST and PS1-BLAST :a new generation of protein database search programs. " Nucleic Acids Res. 25 3389-3402)。BLASTp 的典型参数是期望值(Expectation value) :10(缺省)；过滤器: seg(缺省)；产生一个缺口的罚分11(缺省)；延长一个缺口的罚分1(缺省)；最大比 对100(缺省)；字长11(缺省)；说明数(No. of descriptions) :100(缺省)；罚分矩阵 (Penalty Matrix) :BL0WSUM62。当搜索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，通常比较氨基酸序列。使用 氨基酸序列的数据搜索可以通过本领域已知的不同于blastp的算法来测量。例如，多肽 序列可以用GCG Version 6. 1中的程序FASTA来比较。FASTA提供对查询序列和搜索序 列之间的重叠最佳的区域的比对及百分比序列同一性(Pearson，W. R. (1990) “ Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA" Meth. Enzymol. 183 :63_98)。 例如，氨基酸序列之间的百分比序列同一性可以使用如GCG Version 6.1中提供的FASTA 用其缺省参数(2的字长和PAM250的计分矩阵)来测定，在此通过提述并入。本公开提供了包含由合适底物以高产率产生异丁醇的生物化学途径的代谢上经 工程改造的微生物。本公开的代谢上经工程改造的微生物包含在该生物体基因组之内或在 该生物体内基因组的外部的一个或多个重组多核苷酸。所述微生物可包含野生型生物体中存在的基因的减少、破坏或敲除和/或异源多核苷酸的引入和/或内源多核苷酸的表达或 过表达。在一方面，本公开提供一种重组微生物，其包含与亲本微生物相比表达提高的至 少一种目标酶或者编码亲本生物体中不存在的酶。在另一或进一步的方面，所述微生物包 含对至少一种基因的减少、破坏或敲除，该基因编码与产生异丁醇所必需的代谢产物竞争 的酶。所述重组微生物产生至少一种与产生异丁醇的生物合成途径有关的代谢产物。一般 而言，所述重组微生物包括至少一种重组代谢途径，该途径包含目标酶并可以进一步包括 在竞争性生物合成途径中的酶的活性或表达的降低。该途径在异丁醇的产生中起到修饰底 物或代谢中间产物的作用。目标酶由源自合适生物源的多核苷酸编码并表达。在一些实施 方式中，所述多核苷酸包含源自原核或真核来源并通过重组工程改造进入本公开的微生物 的基因。在另一些实施方式中，所述多核苷酸包括对于宿主生物体是天然的基因。可以理解的是可以修改微生物的范围以包括适合产生异丁醇的重组代谢途径。在 多种实施方式中，微生物可以选自酵母微生物。用于产生异丁醇的酵母微生物可以基于如 下某些特征来选择一种特征可以包括这样的性质，即微生物经选择以将各种碳源转化为异丁醇。因 此，在一个实施方式中，此处公开的重组微生物可以将多种碳源转化为产物，这些碳源包括 但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖及其混合物。另一种特征可以包括这样的性质，即野生型或亲本微生物是非发酵性的。换句话 说，其不能在缺氧情况下代谢碳源，而酵母能够在氧存在的情况下代谢碳源。非发酵酵母指 天然存在的酵母和经遗传修饰的酵母二者。在用发酵性酵母进行厌氧发酵期间，氧化来自 糖酵解的NADH的主要途径是通过产生乙醇。乙醇是通过醇脱氢酶(ADH)经由乙醛的还原 产生的，乙醛是通过丙酮酸脱羧酶(PDC)自丙酮酸产生的。因此，在一个实施方式中，可以 通过减少或消除天然PDC活性来将发酵性酵母工程改造成非_发酵性的。因此，由糖酵解 产生的大多数丙酮酸没有被PDC消耗，并可用于异丁醇途径。这种途径的缺失增加了异丁 醇途径可用的丙酮酸和还原当量。发酵性途径促成异丁醇的低产量和低生产率。因此，PDC 的缺失可以增加异丁醇的产量和生产率。第三个特征可以包括这样的性质，即选择生物催化剂以将不同的碳源转化为异丁在一个实施方式中，酵母微生物可以选自“酵母属酵母进化枝(Saccharomyces Yeast Clade)，，，由 Kurtzman 禾口 Robnett 在 1998 年定义为子囊菌酵母(ascomycetous yeast)分类 学类另U ( “ Identification and phylogeny of ascomycetous yeast from analysis of nuclear large subunit (26S)ribosomal DNA partial sequences. “ Antonie van Leeuwenhoek 73 :331_371，图 2)。他们通过比较编码核糖体大 亚基26S的基因5'末端的D1/D2域的核苷酸序列能够测定约500个酵母种的相关性。在 酿酒酵母的D1/D2核苷酸序列和两种来自这个酵母属酵母进化枝的距离最远的酵母(即乳 酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母)的配对比较中共享超过80%的同一性。术语“酵母属狭义(Saccharomyces sensu stricto) ”分类群是这样一组酵母 种，其与酿酒酵母高度相关(Rainieri，S. et al 2003. Saccharomyces Sensu Stricto Systematics, Genetic Diversity and Evolution. J. Biosci Bioengin 96(1)1—9.Saccharomyces sensu stricto yeast species include but are not limited to S. cerevisiae，S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S，mikatae，S，bayanus, S. uvar υ m, S.carocanis and hybrids derived from these species(Masneuf et at. 1998. New Hybrids between Saccharomyces Sensu Stricto Yeast Species Found Among Wine and Cider Production Strains. Yeast 7(1)61-72)。在半子囊酵母(hemiascomycete yeast)的进化过程中发生了古老的(rncient) 全基因组倍增(WGD)事件，并且该事件是使用比较基因组工具发现的(Keliis et al 2004" Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast S. cerevisiae. " Nature 428 :617_624. Dujon et al 2004" Genome evolution in yeasts. " Nature 430 :35_44. Langkjaer et al 2003" Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes. " Nature428 848-852. Wolfe and Shields 1997" Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome. “ Nature 387 :708_713)。使用这些主要的进化事件，酵母 可以分成在WGD事件之后偏离共同祖先的种(此处称“后-WGD酵母”)和在WGD事件之前 偏离酵母谱系的种(此处称“前-WGD酵母”)。因此，在一个实施方式中，所述酵母微生物可以选自后-WGD酵母属，包括但不限 于酵母属和假丝酵母属。优选的后-WGD酵母种包括酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异 酵母、S. castelli和光滑假丝酵母。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以选自前-全基因组倍增(pre-WGD)酵母 属，其包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、德巴利 酵母属、汉逊酵母属、西洋蓍霉属和裂殖酵母属。代表性的前-WGD酵母种包括克鲁弗酵 母、耐热克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、K. waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯 德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、 汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。酵母微生物可以是Crabtree-阴性或是Crabtree-阳性的。具有Crabtree-阴性 表型的酵母细胞是任何不展现Crabtree效应的酵母细胞。术语“Crabtree-阴性”指天然 存在的或经遗传修饰的生物体二者。简单的说，Crabtree效应定义为在有氧条件下培养时 微生物由于高浓度葡萄糖的存在(如50g-葡萄糖L—1)而抑制氧的消耗。换句话说，具有 Crabtree-阳性表型的酵母细胞由于葡萄糖的存在而无论氧的可用性为多少都继续发酵， 而具有Crabtree-阴性表型的酵母细胞不会显示葡萄糖介导的对氧消耗的抑制。因此，在一个实施方式中，所述酵母微生物可以选自具有Crabtree-阴性表型的 酵母，其包括但不限于如下的属克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、汉逊酵母属和假 丝酵母属。Crabtree-阴性的种包括但不限于乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、异常 毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、异常汉逊酵母和产 朊假丝酵母。在另一个实施方式中，所述酵母微生物可以选自具有Crabtree-阳性表型的酵 母，包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵 母属。Crabtree-阳性酵母的种包括但不限于酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、 S. castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。在一个实施方式中，工程改造酵母微生物以通过糖酵解将碳源(如葡萄 糖)转化为丙酮酸，并且经由经工程改造的异丁醇途径将丙酮酸转化为异丁醇(PCT/ US2006/041602、PCT/US2008/053514)。在国际专利申请号 PCT/US2006/041602 和 Dickinson et al. ,Journal of Biological Chemistry273 :25751_15756 (1998)中描述了 产生异丁醇的可选途径。因此，经工程改造的将丙酮酸转化为异丁醇的异丁醇途径可以包含如下反应1.2丙酮酸一乙酰乳酸+CO22.乙酰乳酸+NADPH—2，3-二羟基异戊酸+NADP+3.2,3- 二羟基异戊酸一α -酮异戊酸4. α -酮异戊酸一异丁醛+CO25.异丁醛+NADPH —异丁醇+NADP+这些反应通过如下酶来进行1)乙酰乳酸合酶(ALS，EC4. 1. 3. 18)、2)酮酸还原 异构酶(KARI，EC 1. 1. 1. 86)、3) 二羟酸脱水酶(DHAD, EC4. 2. 1. 9)、4) α -酮异戊酸脱羧酶 (KIVD, EC4. 1. 1. 1)和 5)醇脱氢酶(ADH, ECl. 1. 1. 1 或 1. 1. 1. 2)。在另一实施方式中，所述酵母微生物经工程改造以过表达这些酶。例如，这些酶可 以由天然基因编码。例如，ALS可以由枯草芽孢杆菌的alsS基因、L. Iactis的alsS基因、 或肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)的ilvK基因编码。例如，KARI可以由大肠杆菌、谷氨酸 棒杆菌(C. glutamicum)、海沼甲烷球菌(M. maripaludis)或瘤胃壶菌E2的ilvC基因编码。 例如，DHAD可以由大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的ilvD基因编码。KIVD可以由L. Iactis的 kivD基因编码。ADH可以由酿酒酵母的ADH2、ADH6或ADH7编码。可以工程改造本发明的酵母微生物以使其具有提高的将丙酮酸转化为异丁醇的 能力。在一个实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酮酸转化为异丁醛 的能力。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酸转化为酮异戊 酸的能力。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酮酸转化为2， 3_ 二羟基异戊酸的能力。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙 酮酸转化为乙酰乳酸的能力。此外，可以通过基因/蛋白工程技术优化编码上述酶的任何基因(或此处提及的 任何其他酶的任何基因(或控制或调整其表达的任何调节元件))，如定向进化或合理诱 变，这些技术是本领域普通技术人员所熟知的。这些行为允许本领域的技术人员优化酶在 酵母中的表达和活性。此外，编码这些酶的基因可以从其它真菌和细菌菌种中鉴定并且可以进行表达以 调节这种途径。多种生物体可以充当这些酶的来源，包括但不限于酵母属菌种，包括酿酒 酵母和葡萄汁酵母；克鲁维酵母属菌种，包括耐热克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母和马克思 克鲁维酵母；毕赤酵母属菌种；汉逊酵母属菌种，包括多形汉逊酵母(H. polymorpha)；假 丝酵母属菌种；毛孢子菌属菌种(Trichosporon spp.) ；YamEukzyma属菌种，包括Y. spp. Stipitis，球有孢圆酵母(Torulaspora pretoriensis)；裂殖酵母属菌种，包括粟酒裂殖酵 母；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp.)；曲霉属菌种(Aspergillus spp.)；脉孢菌属菌种 (Neurospora spp.)或黑粉菌属菌种(Ustilago spp.)。来自厌氧真菌的基因来源包括但不
25限于瘤胃壶菌属菌禾中(Piromyces spp. )、Orpinomyces属菌禾中或Neocallimastix属菌禾中。 有用的原核酶的来源是包括但不限于大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、金 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、芽孢杆菌属菌种、梭菌属菌种、棒杆菌属菌种、假 单胞菌属菌种、乳球菌属菌种(Lactococcus spp.)、肠杆菌属菌种(Enterobacter spp.)禾口 沙门氏菌属菌种。一般的方法酵母微牛物中PDC的鉴定可以使用任何方法鉴定编码具有丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的酶的基因。PDC催化 丙酮酸脱梭以形成乙醛。一般而言，同源或相似的PDC基因和/或同源或相似的PDC酶可 以通过功能、结构和/或遗传分析来鉴定。在大多数情况下，同源或相似的PDC基因和/和 同源或相似的PDC酶会有功能、结构或遗传相似性。本领域的技术人员已知的技术可适用 于鉴定同源基因和同源酶。一般而言，类似基因和/或类似的酶可以通过功能分析来鉴定 并且会具有功能相似性。本领域的技术人员已知的技术可适用于鉴定类似基因和类似的 酶。例如，鉴定同源或类似基因、蛋白质或酶的技术可以包括但不限于，使用基于基因/酶 的公开序列的引物通过PCR克隆PDC基因或使用设计用来扩增PDC基因中保守区的简并引 物通过简并PCR克隆PDC基因。此外，本领域技术人员可以使用技术来鉴定具有功能同源 性或相似性的同源或类似的基因、蛋白质或酶。这些技术包括通过针对所述活性的体外酶 测定法检查细胞或细胞培养物的酶催化活性，然后通过纯化分离具有所述活性的酶，通过 如Edman降解确定所述酶的蛋白质序列，为最可能的核酸序列设计PCR引物、通过PCR对所 述DNA序列进行扩增，以及克隆所述核酸序列。用于鉴定同源或相似基因和/或同源或相似 的酶、类似基因和/或类似酶或蛋白质的技术还包括将关于候选基因或酶的数据与数据库 如BRENDA、KEGG或MetaCYC比较。候选基因或酶可以根据此处的教导在上述数据中鉴定。 此外，PDC活性可以从表型上确定。例如，可以评价在发酵条件下的乙醇产生。乙醇产生的 缺乏可能预示着酵母微生物不具有PDC活性。基因插入或缺失可以使用任何方法以将核酸分子引入酵母中，并且已知许多这样的方法。例如， 转化和电穿孔是将核酸引入酵母细胞的常用方法。参见，例如Gietz et al. , Nucleic Acids Res. 27 :69-74(1992) ；Ito et al.,J.Bacterol. 153 163-168(1983)；禾口Becker and Guarente, Methods in Enzymoiogy 194:182—187(1991)。在一个实施方式中，根据同源重组的原理，发生目标基因整合到酵母微生物的 DNA片段或目标基因中。根据这个实施方式，将包含含有至少一种酵母标记基因和/或待 整合基因的模块(内部模块)的整合盒用与目标整合位点两端的DNA片段同源的DNA片 段(引起重组的序列)从两侧包围。在通过合适的方法用所述整合盒转化酵母之后，引 起重组的序列之间的同源重组可以导致内部模块取代基因组中对应于整合盒中引起重组 之序列的两个位点间的染色体区域(Orr-Weaver et al.，Proc Natl Acad Sci USA 78 6354-6358(1981))。在一个实施方式中，用于将目标基因整合入酵母微生物的整合盒包括在适当启动 子和终止子控制下的异源基因以及选择标记，它们由引起重组的序列从侧翼包围，用于异 源基因整合入酵母染色体。在一个实施方式中，异源基因包括适当的天然基因，期望增加天然基因的拷贝数。选择标记基因可以是用于酵母的任何标记基因，包括但不限于HIS3、 TRPl、LEU2、URA3、bar、ble、hph和kan。引起重组的序列可以随意选择，取决于适合于所需 用途的理想整合位点。在另一实施方式中，将基因整合入酵母微生物的染色体可以通过随机整合发生 (Kooistra, R. , Hooykaas, P. J. J. , Steensma, H. Y. 2004. Yeast 21 :781_792)。此外，在一个实施方式中，使用本领域技术人员熟知的技术从基因组去除某些引 入的标记基因。例如，URA3标记的丢失可以通过将含URA3的细胞铺板在含有FOA (5-氟-乳 清酸)的培养基中并选择FOA抗性菌落而获得(Boeke,J. et al, 1984,Mol. Gen. Genet, 197， 345-47)。包含在本公开的酵母细胞内的外源核酸分子可以任何形式保持在细胞中。例如， 外源核酸分子可以整合入细胞的基因组或保持在附加体状态，这种状态可以稳定地传递 (“遗传”)给子细胞。这样的染色体外遗传元件(如质粒等)能够额外包含确保这样的遗 传元件在子细胞中存在的选择标记。此外，可以将酵母细胞稳定地或暂时地转化。此外，此 处所述的酵母细胞可以含有如上所述的特定外源核酸分子的单个拷贝或多个拷贝。酶活件的降低在本发明范围内的酵母微生物可以具有降低的酶活性，例如降低的丙酮酸脱羧酶 活性。如此处使用的关于特定酶活性的术语“降低”指的是与在相同种的可比较的酵母细 胞中测量的相比较低的酶活性水平。术语降低还指与相同种的可比较的酵母细胞中测量 的相比消除了酶活性。这样，缺乏丙酮酸脱羧酶活性的酵母细胞被视为具有降低的丙酮酸 脱羧酶活性，因为，即使不是全部，也是大部分的可比较的酵母菌株具有至少一些丙酮酸 脱梭酶活性。这种降低的酶活性可以是较低的酶浓度和/或较低的酶比活性的结果。可 以使用许多不同的方法以产生具有降低的酶活性的酵母。例如，可以使用常用的诱变或 敲除技术工程改造酵母细胞以使其具有被破坏的酶编码基因座。参见，例如Methods in Yeast Genetics(1997 版)，Adams, Gottschling, Kaiser 禾口 Stems, Cold Spring Harbor Press (1998) 0此外，可以引入导致具有降低活性的酶的某写点突变。或者，可以使用反义技术来降低酶活性。例如，可以工程改造酵母以使其包含编码 反义分子的cDNA，该反义分子阻止酶的产生。如此处所用的术语“反义分子”包括含有对应 于内源多肽编码链的序列的任意核酸分子。反义分子还可以具有侧翼序列(如调节序列)。 因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可具有任意的一般结构，包括但不限于， 发夹、锤头或斧头(axhead)结构，只要该分子切割RNA。具有降低的酶活性的酵母可以用多种方法鉴定。例如，具有降低的丙酮酸脱羧酶 活性的酵母可以使用普通方法容易地鉴定，该方法可以包括，例如，通过气相层析测量乙醇 的形成。异源基因的过表达从天然或异源核酸分子过表达多肽的方法是已知的。这些方法包括，但不限于，构 建核酸序列使得调节元件促进编码所需多肽的核酸序列的表达。通常调节元件是在转录水 平调节其他DNA序列表达的DNA序列。因此，调节元件包括，但不限于，启动子、增强子等。 例如，外源基因可以在诱导型启动子或组成型启动子控制之下。而且，已知在酵母种自外源 核酸分子表达多肽的方法。例如，已知用于在克鲁维酵母属和酵母属内表达外源多肽的核酸构建体(参见，对于克鲁维酵母属，例如美国专利号4，859，596和4，943，529，以及对于酵 母属，例如，Gellissen等人Gene 190(1) :87_97 (1997))。此外，某些质粒也可以含有着丝 粒序列。这些着丝粒质粒通常是单拷贝或低拷贝质粒。无着丝粒序列并利用2微米(酿酒 酵母)或1.6微米(乳酸克鲁维酵母)复制起点的质粒是高拷贝质粒。选择标记可以是原 养型的，如HIS3、TRP1、LEU2、URA3或ADE2，或者抗生素抗性，如bar、ble、hph或kan。在另一实施方式中，异源调控元件可以用于激活或抑制内源基因的表达。此外，当 表达需要受到抑制或消除时，可以通过已知的缺失技术来消除相关的酶、蛋白质或RNA的 基因。如在此处所述，本公开范围内的任何酵母可以通过针对所表达、过表达或抑制的 特定酶的选择技术来鉴定。鉴定具有所需表型的菌株的方法是本领域的技术人员熟知的。 这些方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR和核酸杂交技术如Northern和Southern分析，改变 在特定底物上或在特定底物、化合物、选择剂等存在下的生长能力。在一些情况下，免疫组 织化学和生物化学技术可以通过探测编码多肽的表达来确定细胞是否包含特定核酸。例 如，对于编码的酶具有特异性的抗体可以用于确定特定酵母细胞是否包含该编码的酶。进 一步，生物化学技术可以用于通过检测作为酶多肽表达的结果产生的产物来确定细胞是否 包含编码酶多肽的特定核酸分子。例如，用编码乙酰乳酸合酶的载体转化细胞并检测与无 载体的细胞相比乙酰乳酸浓度的增加同时表明载体存在且基因产物有活性。检测特定酶 活性或特定产物存在的方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，乙酰乳酸的存在可以按 Hugenholtz and Starrenburg, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 17-22 (1992)所描述的方 法来测定。酶活性的增加可以进一步工程改造本发明的酵母微生物以使其具有增加的酶活性。如此处所用 的关于特定酶活性的术语“增加的”指的是与在相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比 更高的酶活性水平。例如，特定酶的过表达可以导致在细胞中该酶的活性水平增加。糖酵 解或异丁醇途径中涉及的酶活性的增加会导致异丁醇的生产率和产量的增加。增加酶活性的方法是本领域的技术人员已知的。这些技术可以包括通过增加的拷 贝数和/或使用强启动子、引入减轻对酶的负调节的突变、引入增加比活性和/或降低对底 物的Km的特定突变、或通过定向进化来增加酶的表达。参见，例如Methods in Molecular Biology(vol. 231), ed. Arnold and Georgiou, Humana Press (2003)。丽此处公开的生物催化剂可将多种碳源转化为异丁醇，术语“碳源”通常指适合用 作供原核或真核生物细胞生长用的碳的来源的物质。碳源包括，但不限于，生物质水解产 物、淀粉、蔗糖、纤维素、半纤维素、木糖和木质素，以及这些底物的单体成分。碳源可以包括 各种不同形式的多种有机化合物，包括，但不限于聚合物、碳水化合物、酸类、醇类、醛类、酮 类、氨基酸类、多肽类等。这些包括，例如多种单糖(例如，葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麦 芽糖、寡糖、多糖)、饱和或不饱和脂肪酸、琥珀酸盐/酯、乳酸盐/酯、乙酸盐/酯、乙醇等， 或其混合物。光合生物可以额外地产生作为光合作用产物的碳源。在一些实施方式中，碳 源可以选自生物质水解产物和葡萄糖。所用术语“C2-化合物”指的是包括两个碳原子的有机化合物，包括但不限于乙醇和乙酸盐/酯，该“C2-化合物”用作碳源供经工程改造的酵母用，所述酵母在所有丙酮酸脱 羧酶(PDC)基因中带有突变，导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。术语“原料”定义为提供给微生物或发酵过程的、可以自其产生其他产物的原材料 或原材料的混合物。例如，碳源(如生物质或由生物质衍生的含碳化合物)是供在发酵过 程中产生生物燃料的微生物用的原料。然而，原料可以含有除碳源外的营养物。术语“传统的碳水化合物”指的是产生自专用植物如甘蔗、玉米和小麦的糖和淀 粉。通常，这些专用植物在植物的某些部分(如谷粒)中集中了糖和淀粉，该部分被收获并 加工以提取糖和淀粉。传统的碳水化合物被用作食物，以及较低程度地被用作碳源供产生 生物燃料和化学品的发酵过程用。此处所用的术语“生物质”主要是指绿色植物的茎、叶和含淀粉部分，并且主要由 淀粉、木质素、纤维素、半纤维素和/或果胶组成。生物质可以通过化学处理或酶处理分 解成组成该生物质的单体糖和酚类。(Wyman，CE. 2003 Biotechnological Progress 19: 254-62)。这样所得的物质称为生物质水解产物，对其进行中和并处理以除去痕量的可能不 利地影响生物催化剂的有机物质，然后用作原料供使用生物催化剂的发酵用。此处所用的术语“淀粉”是指容易通过消化酶水解的葡萄糖的聚合物。淀粉通常 集中在植物的专门部分，如马铃薯、玉米粒、稻粒、麦粒和甘蔗茎。此处所用的术语“木质素”是指聚合物材料，其主要由连接的酚类单体化合物(如 对香豆醇、松柏醇和芥子醇)组成，其形成植物中结构刚性的基础并且常常是指作为植物 的木质部分。木质素也被视为植物细胞壁的非-碳水化合物部分。此处所用的术语“纤维素”是指化学式(C6HltlO5)n的β-葡萄糖的长链高分子多糖 碳水化合物，通常与木质素和任何半纤维素一起存在于植物细胞壁中。术语“半纤维素”指的是一类植物细胞壁多糖，其可以为几种杂聚物中的任一。这 些包括木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡糖醛酸木聚糖、葡甘露聚糖和 半乳甘露聚糖。半纤维素的单体成分包括但不限于D_半乳糖、L-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠 李糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸。这类多糖与纤维素一起存在于几乎 所有的细胞壁中。半纤维素重量比纤维素低且不能通过热水或螯合剂萃取，但是可以通过 碱性水溶液萃取。半纤维的高分子链结合交联纤维网络中的果胶和纤维素，形成大多数植 物细胞的细胞壁。特征为以高产率产牛异丁醇的微牛物为了使生物催化剂最经济地产生异丁醇，期望产生高产率。优选地，产生的唯一产 物是异丁醇。额外的产物导致产率的减少以及资本和生产费用的增加，特别是如果副产品 价值很小或没有价值。副产品还需要额外的资本和生产费用来讲这些产物与异丁醇分离。微生物以高于理论值的5%的产率将一种或多种由生物质衍生的碳源转化为异丁 醇。在一个实施方式中，产率高于10%。在一个实施方式中，产率高于理论值的50%。在 一个实施方式中，产率高于理论值的60%。在另一个实施方式中，产率高于理论值的70%。 在又一个实施方式中，产率高于理论值的80%。在又一个实施方式中，产率高于理论值的 85%。在又一个实施方式中，产率高于理论值的90%。在又一实施方式中，产率高于理论值 的95 %。在又一实施方式中，产率高于理论值的97.5%。更具体而言，微生物以高于理论值的5%的产率将由生物质衍生的葡萄糖转化为
29异丁醇。在一个实施方式中，产率高于理论值的10%。在一个实施方式中，产率高于理论值 的50%。在一个实施方式中，产率高于理论值的60%。在另一实施方式中，产率高于理论 值的70%。在又一实施方式中，产率高于理论值的80%。在又一实施方式中，产率高于理 论值的85%。在又一实施方式中，产率高于理论值的90%。在又一实施方式中，产率高于 理论值的95%。在又一实施方式中，产率高于理论值的97. 5%。紐M爾寸表汰·PdC- ■剩■物在酵母中，丙酮酸转化为乙醛是对丙酮酸池的主要消耗(图2A)，而因此，是与异 丁醇途径竞争的主要因素。这种反应由丙酮酸脱羧酶(PDC)酶催化。酵母微生物中的这种 酶活性的降低导致用于异丁醇途径的丙酮酸和还原当量的可用性增加，并可以在表达丙酮 酸依赖性异丁醇途径的酵母微生物中改进异丁醇的产生和产率(图2B)。PDC活性的降低可以由如下方式实现1)编码PDC的结构基因的正转录调节子的 突变或缺失，或2)在给定生物体中所有PDC基因的突变或缺失。术语“转录调节子”可以指 定反向作用的蛋白质或核酸以增加或减少基因组中不同基因座的转录。例如，在酿酒酵母 中，编码PDC1，5，6基因正转录调节子的PDC2基因可以被缺失；报道缺失了 PDC2基因的酿 酒酵母仅具有野生型 PDC 活性的 10% (Hohmann, Mol Gen Genet, 241 :657_666 (1993))。 或者，例如，将PDC的所有结构基因(如在酿酒酵母中的PDC1、PDC5、PDC6或在乳酸克鲁维 酵母中的PDC1)缺失。包含对所有三个PDC等位基因的破坏的Crabtree-阳性酵母菌株(如酿酒酵母菌 株)不再通过发酵产生乙醇。然而，由PDC催化的反应的下游产物乙酰辅酶A是合成代谢 产生必要分子所需要的。因此，Pdc突变体不能单独在葡萄糖中生长，还需要二-碳的碳源， 或者乙醇或乙酸盐，以合成乙酰辅酶A (Flikweert MT, de Swaaf M, van Dijken JP, Pronk JT.FEMS Microbiol Lett. 1999May 1 ；174(1) :73_9· PMlD 10234824 and van Maris AJ, Geertman JM,Vermeulen A,Groothuizen MK,Winkler AA,Piper MD,van Dijken JP,Pronk JT. Appl Environ Microbiol. 2004 Jan ；70(1) :159_66. PMID :14711638)。因而，在一个实 施方式中，这种Crabtree-阳性酵母菌株可以进化以产生PDC突变体酵母的变体，其不需 要二碳分子且在葡萄糖上与野生型具有相似的生长速率。可以使用包括恒化器进化或系列 稀释的任何方法来产生能够在作为单一碳源的葡萄糖上以类似于野生型的速率生长的、缺 失三个 PDC 等位基因的菌株变体(van Maris et al，，Directed Evolution of Pyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae, Yielding a C2_independentt Glucose-Tolerant, and Pyruvate-Hyperproducing Yeast, Applied and Environmental Microbiology,2004，70(1)，159-166)。在以高产率由碳源产生异丁醇的方法中，将所述酵母微生物在包含碳源的适当培
养基中培养。另一个示例性的实施方式提供了用于产生异丁醇的方法，包括在包含碳源的合适 培养基中的本发明的重组酵母微生物，所述碳源可以通过本发明的酵母微生物转化为异丁醇。在某些实施方式中，所述方法进一步包括从培养基分离异丁醇。例如，可以通过本 领域的技术人员已知的任何方法(如蒸馏、全蒸发或液_液提取)从培养基分离异丁醇。实施例通用方法样品制各将来自发酵液的样品(2mL)储存在_20°C以供后续的底物和产物分析。 分析之前，将样品解冻，然后以14，OOOXg离心10分钟。上清通过0.2μπι滤器过滤。使用 可靠的标准品(>99%，购自Sigma-Aldrich)和5-点校准曲线(用1_戊醇作为内标物用 于气相层析分析)进行底物和产物的分析。光密度和细胞干重的测定在600nm用DU 800分光光度计(Beckman-Coulter， Fulierton, CA, USA)测定酵母培养物的光密度。视需要稀释样品以得到0. 1-0. 8的光密 度。通过离心50mL培养基之后倾析上清液来测定细胞干重。用50mL milliQ水洗涤细胞 团块一次，离心并将团块用25mL milliQ水再次洗涤。然后将细胞团块在80°C下干燥至少 72小时。通过从包含干细胞团块的离心管的重量中扣去离心管的重量计算得到细胞干重。气相层析对乙醇和异丁醇的分析在配备有DB-FFAP柱(Agilent Technologies ； 长度30m，ID 0. 32mm，膜厚度0. 25 μ Μ)或等效连接到火焰电离检测器(FID)的HP 5890 气相层析仪中进行。温度程序如下注射器20(TC ；探测器30(TC ；烤箱10(TC，1分钟； 700C /分钟梯度升温至235°C，然后维持2. 5分钟。高效液相层析在配备有Aminex HPX-87H离子排阻柱(Bio-Rad，300x7. 8mm)或 等同物和H+阳离子保护柱或等同物的HP-1100高效液相层析系统上进行对葡萄糖和有机 酸的分析。有机酸使用HP-1100 UV检测器(210nm，8nm 360nm参比)检测，而葡萄糖用 HP-1100折射率检测器来检测。柱温是60°C。这种方法用0.008N硫酸水溶液作为恒定流 动相。流速设为0. 6mL/min，注入量是20 μ L而运行时间是30分钟。厌氧分批发酵厌氧分批培养在30°C下在用塞密封的IOOmL血清瓶中进行。使用 初始葡萄糖浓度为20g/L葡萄糖的总共20mL合成培养基(Kaiser et al,Methods in Yeast Genetics, a Cold Spring Harbor Laboratory Manual (1994))。在 24 禾口 48 小时取出 2mL 样品。在48小时后或当所有葡萄糖耗尽时结束发酵。通过如上所述的气相层析和/或高 效液相层析来处理和分析样品。酵母转化-乳酸克鲁维酵母根据Kooistra等，Yeast 21 :781_792 (2004)通过 电穿孔进行转化。酿酒酵母的乙酸锂转化通过乙酸锂法转化了菌株(Gietz et al.，Nucleic Acids Res. 27 =69-74(1992)。通过在室温下以2700rcf离心2分钟从过夜培养物收集细胞，所述 培养物以大约0.8 1.0的OD6tltl生长在50mL成分确定的(SC)乙醇培养基中。将细胞团块 再悬浮在50mL无菌水中，通过离心法收集(2700rcf ；2min ；室温)，然后重悬在25mL蒸馏水 中。通过离心收集(2700 rcf ；2min ；室温)细胞，并重悬在ImL的IOOmM乙酸锂中。将细 胞悬液转移到无菌的1. 5ml管中，并通过全速离心10秒收集。将细胞重悬在体积为细胞团 块体积四倍的IOOmM碳酸锂中(例如，100 μ L细胞团块用400 μ L)。向制成的DNA混合物 (72 μ 1 50% PEGUO μ 1 IM碳酸锂、3 μ 1煮沸的鲑精DNA和5 μ 1的各质粒)加入15 μ 1细 胞悬液并通过涡旋振荡混合，其间短暂停顿5次。将细胞/DNA悬液在30°C下温育30分钟 并在42°C下温育22分钟。通过全速离心10秒收集细胞并重悬在100 μ 1 S0S(1M山梨醇， 0. 34% (w/v)酵母提取物，0.68% (w/v)蛋白胨，6. 5mM CaCl2)中。将所述细胞悬液铺在适当的选择性琼脂平板上。酵母菌落PCR:从琼脂培养基取酵母细胞并转移到30 μ 1 0.2% SDS中，然后在 90°C加热4分钟。离心沉降(spun down)细胞，并将1 μ 1上清用于使用标准Taq(NEB)的 PCR。 ^ ^ 除非特别声明，通常采用用于克隆和质粒构建的标准分子生物学方 法(Sambrook & Russell)。培养基YP 包含(w/v)酵母提取物、2% (w/v)蛋白胨。YPD为包含2% (w/v)葡萄糖 的YP，YPE为包含2% (w/v)乙醇的YP。SC+Complete :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加剂 (包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)和6. 7g/LDifC0TM Yeast Nitrogen Base、0. 076g/L 组氨酸、0. 076g/L 色氨酸、0. 380g/L 亮氨酸和 0. 076g/L 尿嘧啶。SC-HWUL :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加剂(包 括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)和6. 7g/LDifC0 Yeast Nitrogen Base。SC-WLU :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加剂(包括 氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6. 7g/L不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base 禾口 0. 076g/L 组氛酸。SC-HWU :20g/L 葡萄糖、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加剂(包括 氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6. 7g/L不含氨基酸的Difco Yeast Nitrogen Base 禾口 0. 380g/L 亮氛酸。SC-乙醇-HWU (w/v)乙醇、14g/L Sigma Synthetic Dropout Media 添加剂 (包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base 禾口 0. 380g/L 亮氛酸。上述培养基的固体形式含2% (w/v)琼脂。菌株、质粒和引物序列表1详细显示了本文公开的菌株的表型
权利要求
产生异丁醇的方法，该方法包括提供包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物，所述微生物经选择从而以至少5％的理论产率从碳源产生异丁醇；在包含提供碳源的原料的培养基中培养所述微生物，直至产生可回收量的异丁醇；和回收异丁醇。
2.根据权利要求1的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约10%的理论产率产生 异丁醇。
3.根据权利要求1的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约20%的理论产率产生 异丁醇。
4.根据权利要求1的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约50%的理论产率产生 异丁醇。
5.根据权利要求1的方法，其中所述重组微生物经工程改造从而与亲本微生物相比具 有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
6.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因 中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
7.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶(PDC) 基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
8.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶(PDC)基因，其 导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
9.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
10.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙 酮酸脱羧酶基因转录降低。
11.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包 含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
12.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮 酸转化为异丁醇的异源代谢途径。
13.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物经进一步工程改造从而提高将丙酮 酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。
14.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮 酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述微生物包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一 种由天然基因编码的酶。
15.根据权利要求5的方法，其中所述微生物经选择以包含将丙酮酸转化为异丁醇的 天然代谢途径。
16.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为酵母进化枝(Saccharomycesclade)的 酵母微生物。
17.根据权利要求16的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以高于约10%的理论产率产生异丁醇。
18.根据权利要求16的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以高于约20%的理论产2率产生异丁醇。
19.根据权利要求16的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而以高于约50%的理论产率产生异丁醇。
20.根据权利要求16的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而与亲本生物体 相比具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
21.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
22.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶 基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
23.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因， 其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
24.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧 酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
25.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物包含对转录调节子的修饰，其 导致丙酮酸脱羧酶基因转录降低。
26.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基 因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
27.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将 丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。
28.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而提高将 丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。
29.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将 丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少 一种由天然基因编码的酶。
30.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而包含将丙酮酸转化 为异丁醇的天然代谢途径。
31..根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物 生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
32.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为酵母属(Saccharomyces)狭义酵母微生物。
33.根据权利要求32的方法，其中所述酵母属狭义酵母微生物选自如下的 种之一酿酒酵母(S. cerevisiae)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、库德里阿兹威酵 母(S. kudriavzevii)、S.mikatae、贝酵母(S. bayanus)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、 S. carocanis或其杂禾中。
34.根据权利要求32的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约10%的理论产率产 生异丁醇。
35.根据权利要求32的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约20%的理论产率产 生异丁醇。
36.根据权利要求32的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约50%的产率产生异丁醇。
37.根据权利要求32的方法，其中所述重组酵母微生物具有降低的丙酮酸脱羧酶 (PDC)活性。
38.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
39.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基 因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
40.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
41.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因， 其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
42.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧 酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
43.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物包含对转录调节子的修饰，其 导致丙酮酸脱羧酶基因转录的降低。
44.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将 丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。
45.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而提高将 丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。
46.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将 丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述代谢途径包含至少一种由异源基因编码的酶和 至少一种由天然基因编码的酶。
47.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而包含将丙酮酸转化 为异丁醇的天然代谢途径。
48.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生 长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
49.根据权利要求1的方法，其中所述酵母微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。
50.根据权利要求49的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自如下的属之一 酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母 属(Debaryomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
51.根据权利要求49的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄 fhf^fij、贝胃(Saccharomyces paradoxus) >Saccharomyces castelli、3SL 酵母(Saccharomyces kluyveri)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光 滑假丝酵母(Candida glabrata)、拜耳接合酵母(Z. bailli)、鲁氏接合酵母(Z.rouxii)、 汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorius)、粟酒裂 殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或葡萄汁酵母。
52.根据权利要求49的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约10%的理论产 率产生异丁醇。
53.根据权利要求45的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约20%的理论产率产生异丁醇。
54.根据权利要求49的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约50%的理论产率产生异丁醇。
55.根据权利要求49的方法，其中所述酵母微生物经工程改造而从与亲本微生物相比 具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
56.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因中包含突变。
57.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基 因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
58.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶 基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
59.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因， 其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
60.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧 酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
61.根据权利要求55的方法，其中所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致 丙酮酸脱羧酶基因转录降低。
62.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸 转化为异丁醇的异源代谢途径。
63.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而提高将丙酮酸 转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。
64.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸 转化为异丁醇的代谢途径，其中所述代谢途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一 种由天然基因编码的酶。
65.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生 长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
66.根据权利要求55的方法，其中所述重组微生物经选择从而包含将丙酮酸转化为异 丁醇的天然代谢途径。
67.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母。
68.根据权利要求67的方法，其中所述后-W⑶酵母选自酵母属或假丝酵母属之一。
69.根据权利要求67的方法，其中所述后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵 母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。
70.根据权利要求67的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约10%的理论产 率产生异丁醇。
71.根据权利要求7的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约20%的理论产率产生异丁醇。
72.根据权利要求67的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约50%的理论产率产生异丁醇。
73.根据权利要求67的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而与亲本微生物相比具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
74.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因中包含突变，其导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。
75.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基 因中包含突变，其导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。
76.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶 基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
77.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因， 其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
78.根据权利要求73的方法，其中所述重组微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶基 因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。
79.根据权利要求73的方法，其中所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致 丙酮酸脱羧酶基因转录的降低。
80.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸 转化为异丁醇的异源代谢途径。
81.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而提高将丙酮酸 转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。
82.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸 转化为异丁醇的代谢途径，其中所述代谢途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一 种由天然基因编码的酶。
83.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而包含将丙酮酸转化 为异丁醇的天然代谢途径。
84.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生 长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
85.产生异丁醇的方法，该方法包括提供重组微生物，其包含a)产生异丁醇的代谢途径，所述微生物经选择从而从碳源产生异丁醇；b)与亲本微生物相比降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性；在包含提供碳源的原料的培养基中培养所述微生物，直至产生可回收量的异丁醇；和回收异丁醇。
86.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为酵母进化枝的酵母。
87.根据权利要求86的方法，其中所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微 生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
88.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为酵母属狭义酵母。
89.根据权利要求88的方法，其中所述酵母属狭义酵母微生物选自酿酒酵母、酿酒酵 母、库德里阿兹威酵母、S. mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis或其杂种。
90.根据权利要求88的方法，其中所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微 生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
91.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。
92.根据权利要求91的方法，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自如下的属之一 克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝 酵母属。
93.根据权利要求85的方法，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自乳酸克鲁 维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、 异常毕赤酵母(Pichia anomala)、树干毕赤酵母属(Pichia stipitis)、东方伊萨酵母 (I.orientalis)、罕见伊萨酵母(I. occidentalis)、菱形伊萨酵母(I. scutulata)、异常 汉逊酵母(Hanenusula anomala)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或 Kluyveromyces waltii ο
94.根据权利要求85的方法，其中所述酵母微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。
95.根据权利要求94的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而以基本上等同于亲 本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
96.根据权利要求94的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自如下的属之一 酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。
97.根据权利要求94的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄 汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑 假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母 或葡萄汁酵母。
98.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母。
99.根据权利要求98的方法，其中后-W⑶酵母选自酵母属或假丝酵母属之一。
100.根据权利要求98的方法，其中所述后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵 母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。
101.根据权利要求98的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而以基本上等同于 亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
102.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母。
103.根据权利要求102的方法，其中所述前-WGD酵母选自如下的属之一酵母属、克 鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、西洋蓍霉 属(Yarrowia)或裂殖酵母属。
104.根据权利要求102的方法，其中所述前-WGD酵母选自克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵 母、马克思克鲁维酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母属、树干毕赤酵母属、汉逊德巴利酵母、异常 汉逊酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。
105.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为非发酵酵母微生物。
106.根据权利要求105的方法，其中所述非发酵酵母微生物选自如下的属之一丝孢 酵母属(Tricosporon)、红酵母属(Rhodotorula)或 Myxozyma0
107.根据权利要求105的方法，其中所述非发酵酵母微生物选自以下的茁牙丝孢 _ 母(Tricosporon pullulans)、口誉 红 _ 母(Rhodotorula lignophila)或 Myxozyma vanderwaltii> ZiIf f^BJ (Candida ethanolica) > Debaromyces carsonii gJc Pichia castillae。
108.重组微生物，其包含a)产生异丁醇的代谢途径，所述微生物经选择从而从碳源产生异丁醇；b)与亲本微生物相比降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
109.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。
110.根据权利要求109的重组微生物，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自如下 的属之一克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属。
111.根据权利要求109的重组微生物，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自乳酸 克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵 母、菱形伊萨酵母、异常汉逊酵母、产朊假丝酵母菌或Kluyveromyces waltii.
112.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为酵母进化枝的酵母。
113.根据权利要求112的重组微生物，其中所述酵母微生物经工程改造从而使其以基 本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性 不改变。
114.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为酵母属狭义酵母。
115.根据权利要求114的重组微生物，其中所述酵母属狭义酵母微生物选自酿酒酵 母、酿酒酵母、库德里阿兹威酵母、S. mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis或这些种 的杂种。
116.根据权利要求114的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而以基本上等同于 亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。
117.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。
118.根据权利要求117的重组微生物，其中所述微生物经工程改造从而使其以基本上 等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改 变。
119.根据权利要求117的重组微生物，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自如下 属之一酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。
120.根据权利要求117的重组微生物，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒 酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维 酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟 酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。
121.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母。
122.根据权利要求121的重组微生物，其中所述酵母微生物经工程改造从而使其以基 本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性 不改变。
123.根据权利要求121的重组微生物，其中所述后_WGD(全基因组倍增)酵母选自酵 母属或假丝酵母属之一。
124.根据权利要求121的重组微生物，其中所述后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵 母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。
125.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母。
126.根据权利要求125的重组微生物，其中所述前-WGD酵母选自如下的属之一酵母 属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、西洋 蓍霉属或裂殖酵母属。
127.根据权利要求125的重组微生物，其中所述前-WGD酵母选自克鲁弗酵母、耐热克 鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴 斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、东方伊索酵 母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、解酯西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。
128.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为非发酵酵母微生物。
129.根据权利要求128的重组微生物，其中所述非发酵酵母微生物选自如下的属之 一丝孢酵母属、红酵母属或Myxozyma。
130.根据权利要求128的重组微生物，其中所述非发酵酵母微生物选自茁牙丝孢酵 (Rhodotorula lignophila) Myxozyma vanderwaltii>Debaromyces carsonii gJc Pichia castillae。9
全文摘要
本发明公开了产生异丁醇的方法。在一个实施方式中，该方法包括提供用包含至少一种外源基因的异丁醇产生途径的转化的微生物。所述微生物经选择从而以至少10％的理论产率由碳源产生异丁醇。所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养微生物直至产生异丁醇。所述方法包括回收异丁醇。在一个实施方式中，所述微生物为具有Crabtree-阴性表型的酵母。在另一实施方式中，所述微生物为具有Crabtree-阳性表型的酵母微生物。本发明公开了产生异丁醇的微生物。在一个实施方式中，所述微生物包含含有至少一种外源基因的异丁醇产生途径，并经选择从以至少10％的理论产率由碳源产生可回收量的异丁醇。
文档编号C12R1/645GK101952448SQ200880127344
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月23日 优先权日2007年12月23日
发明者克里斯托弗·史密斯, 凯瑟琳·A·邓登, 尤维尼·古纳沃德纳, 彼得·迈因霍尔德, 琼·尤拉诺, 里德·M·R·费尔德曼, 阿里斯托斯·阿里斯蒂杜 申请人:格沃股份有限公司