专利名称：：一种能生物降解天然雌激素的燕麦食酸菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种能生物降解天然雌激素的燕麦食酸菌(Acidovoraxavenae)菌株及其应用，特别是利用该燕麦食酸菌有效降解雌酮、1713-雌二醇和/或雌三醇。
背景技术：
：雌酮(Estrone,El)、17P-雌二醇(17P-Estradiol,E2)、雌三醇(Estriol，E3)属于天然雌激素，由人和动物的卵巢分泌出来，会随着粪尿排放进入污水处理厂、土壤、农田等环境。人工合成雌激素17a-乙炔雌二醇(17a-Ethynylestradio1，EE2)，是低剂量口服避孕药、月经不调治疗药和更年期治疗药的主要成分，亦会随粪尿排泄到污水处理厂中。图l为上述雌激素的化学结构式。牲畜养殖业排放的雌激素亦会通过堆肥发酵等处理处置后通过施肥进入农田土壤中。常规活性污水处理系统不能有效去除原水中的雌激素，雌酮与1713-雌二醇虽能得到部分降解，17a-乙炔雌二醇却基本不被降解，导致受纳水体及土壤中ng/L水平的雌激素被检出(Ternesetal.，Sci.Total.Environ.Vol.225，91-99，1999)。统计来自瑞典、德国、加拿大、德国、意大利、英国、荷兰等污水处理厂出水中雌激素的检测结果，雌酮、17P-雌二醇与17a-乙炔雌二醇的平均浓度范围在l-llng/L。其中加拿大污水厂出水中1713-雌二醇和17a-乙炔雌二醇的最大浓度分别为64ng/L和42ng/L(Ternesetal.，Sci.TotalEnviron.225，81-90，1999b)。雌激素随着污水处理厂出水排放进入河流中，文献表明在河流中数ng/L的雌酮、17P-雌二醇与17a-乙炔雌二醇亦被检出(JurgensMetal.，Environ.Toxicol.Chem，21(3)，480-488，2002)。日本建设省从1998年开始对全国109个水系的雌激素浓度进行了调查，雌酮、1713-雌二醇与17a-乙炔雌二醇最高检出浓度分别为1.3、5.4和0.9ng/L(松井等，内分泌干扰物的最前线，日本季刊化学综说，No.50，2001)。近年来，雌激素作为环境中典型内分泌干扰物质，其所导致的鱼类等生物生殖机能异常现象等内分泌干扰问题引起了学术界与社会的广泛关注。80年代在英国泰晤士河接纳污水处理厂出水的下游河段中，发现雌雄同体的鲤鱼；证明了ng/L水平的雌酮、17P-雌二醇与17a-乙炔雌二醇可以导致雄性虹鳟鱼的雌性化；是引起鱼类雌性化的主要原因物质，是危及人类健康的水质安全隐患(Desbrowetal.，Environ.Sci.Technol.32，1549-1558，1998)。鱼类的vitro毒理实验研究结果表明，雌激素效应大小顺序为17a-乙炔雌二醇>170-雌二醇>雌酮(Spengleretal，Environ.Toxicol.Chem.20(10):2133-2141,2001)。2002-2003年间，日本东京都环境科学研究所的研究亦表明，在东京湾靠近污水处理厂的水域内，发现多条鲻鱼、青麟雄鱼体中存在雌性鱼才会发育的卵细胞，鱼类雌性化现象的主要原因物质是长期排入东京湾中的污水处理厂出水中所含有的天然雌激素。雌激素对水源水质，进而对城镇供水、公共卫生以及生态系统质量形成的潜在威胁不容忽视。污水处理厂对阻止雌激素进入水体环境应该担负重要作用，因此必须探索污水处理厂对雌激素的处理方法，在此之中，利用具有降解能力的微生物进行生物降解成为学3术界关注的重要方法之一。寻找能够有效降解雌激素的微生物菌株成为研究热点。近年来，陆续报道表明发现了一些可以降解雌激素的微生物菌株。史江红(本申请人之一)等(Shietal.，WaterSci.Technol.45(12):175-179，2002)报道以雌激素作为唯一碳源，从日本的牛粪堆肥中驯化筛选出17a-乙炔雌二醇、以及1713-雌二醇与雌酮的降解菌株HNS-l株---真菌类镰刀菌Fusariumproliferatum。Yoshimoto等(Yoshimotoetal.，WaterSci.Technol.47(9):77-84,2004)报道从普通活性污泥中分离出马红球菌Rhodococcuszopfii和Rhodococcusequi(革兰氏阳性杆菌)可以降解雌酮、17P-雌二醇、雌三醇和17a-乙炔雌二醇。史江红(本申请人之一)等(Shietal.，WaterScienceandTechnology.Vol.50，No.8，153-159，2004)发现硝化污泥中的硝化细菌欧洲亚硝化单胞菌Nitrosomonaseuropaea能降解上述4种雌激素雌酮、17P-雌二醇、雌三醇和17a-乙炔雌二醇。任海燕等(RenHaiyanetal.，Chemosphere66340-346，2007)报道，从北京某避孕药厂污水处理站的活性污泥中分离出鞘氨醇杆菌属Sphingobacteriumsp，可以降解17a-乙炔雌二醇。目前我国为了控制水体富营养化现象，北京上海等城市广泛采用脱氮除磷污水处理工艺。然而，在脱氮除磷工艺系统活性污泥中是否存在着雌激素的降解菌？关注脱氮除磷的同时如何强化对雌激素的降解效率成为了亟待解决的科技前沿问题。
发明内容本发明针对污水处理工艺中如何强化对雌激素的降解效率之问题，提供一种高效去除天然雌激素(雌酮、17l3-雌二醇和/或雌三醇)的微生物菌种，该菌能高效降解天然雌激素，可以用于去除环境中雌激素的微生物降解技术。本发明所提供的高效降解菌SS-1来源于污水处理厂活性污泥中，经过人工富集、筛分及纯化所得。采集脱氮除磷工艺系统活性污泥作为微生物源，分别以上述四种雌激素作为唯一碳源进行富集培养，分离出可以有效降解雌酮、17!3-雌二醇与雌三醇，但不降解17a-乙炔雌二醇的一株微生物单菌，被命名为SS-1菌株。SS-1菌落呈白色圆形，边缘规则，表面粗糙，表面湿润。将本发明分离出的SS-1菌株送到中国微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)委托鉴定，基于对菌株16SrDNA序列分析，表明该菌株为燕麦食酸菌Acidovoraxavenae，杆菌，革兰氏阴性菌。SS-1菌株于2010年2月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCCNo.3633。本发明提供的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株可以有效去除天然雌激素。SS-1菌株能以雌激素作为唯一碳源生长，其培养基的无机成分为K2HP04，0.lg/L;(NH4)2HP04，0.lg/L;MgS04*7叫0.02g/L;FeCl3，0.Olg/L;CaCl2*21120，0.lg/L;NaCl，O.lg/L，蒸馏水，1000mL。培养液pH值为7.0-7.2，高压灭菌锅12rC灭菌20min。在上述培养条件下，SS-1菌株能在12小时内将初始浓度为lmg/L的雌酮降解掉99%，在24小时内能分别将初始浓度为lmg/L的1713-雌二醇与雌三醇降解掉99%。降解反应符合一级动力学反应定律，雌酮、1713-雌二醇与雌三醇降解数度常数分别为0.15h—\0.31h—1与0.23h—、依据本发明，由于燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株具有有效降解环境中的天然雌激素雌酮、1713-雌二醇与雌三醇的特性，因此SS-1菌可以应用于含雌激素废污水治理技术或土壤的修复技术中。本发明与现有已发现的雌激素降解菌相比，其降解雌酮、17!3-雌二醇与雌三醇的速率有了较大的提高。图1为雌酮、17P-雌二醇、雌三醇和17a-乙炔雌二醇的化学结构式；图2为本发明的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株的平板划线图；图3为本发明的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株降解雌酮(El)、17|3-雌二醇(E2)和雌三醇(E3)过程中培养液在600nm下的吸光度值随时间变化图；图4为本发明的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株分别降解雌酮(El)、17|3-雌二醇(E2)和雌三醇(E3)的浓度随时间变化图。具体实施例方式—、本发明提供的AcidovoraxavenaeSS-1菌株的分离筛选与保藏采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源，冷藏运回实验室。制备含有50mg/L雌激素为唯一碳源的无机培养基，按照2.5%的活性污泥接种量接种于100mL上述无机培养基的500mL三角瓶中。培养基中所含无机成分为K2HP04，0.lg/L;(NH4)2HP04，0.lg/L;MgS04*7叫0.02g/L;FeCl3，0.Olg/L;CaCl2*21120，0.lg/L;NaCl，O.lg/L。培养基使用2。；乙酸调节pH值为7.0-7.2，高压灭菌锅12rC灭菌20min，待温度降低到3(TC左右后，在超净台下接种。污泥接种后在30°C，120rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养。如此反复培养7次后，在琼脂(2g/100mL)固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单纯菌株，再将菌株接种入上述液体培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的可以降解雌酮、17P-雌二醇和雌三醇的SS-1菌株，如图2所示，其菌落呈白色圆形，边缘规则，表面粗糙，表面湿润。实验过程中，纯化后菌株在液体和固体培养基中继续连续培养保存。菌种加甘油于-8(TC冷冻保藏。SS-1菌株于2010年2月10日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCCNo.3633。二、本发明提供的AcidovoraxavenaeSS-1菌株的鉴定本发明将分离出的SS-1菌株送到中国微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心委托鉴定，SS-1菌株的16SrDNA序列表明该菌为燕麦食酸菌Acidovoraxavenae，杆菌，革兰氏阴性菌。三、本发明提供的AcidovoraxavenaeSS-1菌株对雌酮、17P-雌二醇、雌三醇的降解能力将含有50mg/L的17P-雌二醇的AcidovoraxavenaeSS-1菌株培养基混合液，按照1%的接种量，接种于分别以lmg/L雌酮、17P-雌二醇、雌三醇或17a-乙炔雌二醇为唯一碳源的液体培养基中，于3(TC，120rpm恒温振荡培养箱中培养5_7天，进行降解实验，同时制备相应的无SS-1菌株的空白样品进行培养。在培养期内不同时间采集2个平行样品，采样时间分别为0h、2h、4h、8h、12h、24h及36h。采用紫外分光光度仪(UV-2100spectrophotometer，Unic)测定600nm下吸光度值以示微生物生长情况，如图3所5不。在采集样品内加入等体积乙腈混合均匀，采用0.22ym有机系尼龙滤膜(13mm，天津贺世科技发展有限公司)过滤后，采用高效液相色谱(HPLC，Waters1525)测定雌激素浓度。检测器为UV(Dual入AbsorbanceDetector,Water2487)，色谱柱为Nova-PakC18柱(4iim粒径、3.9mmX150mml.D.，Waters)，流动相体积比为乙月青:水=1:l，检测波长为280nm，流速为lmL/min。表1列出降解过程中雌激素浓度随时间变化的数据，雌激素的测定结果如图4所示，在雌激素为唯一碳源的培养条件下，SS-1菌株能在12小时内将初始浓度为lmg/L的雌酮降解掉99%，在24小时内能分别将初始浓度为lmg/L的17P-雌二醇与雌三醇降解掉99%，17a-乙炔雌二醇没有明显的降解现象。降解反应符合一级动力学反应定律，一级动力学反应方程如下dc/dt=_kc利用该方程计算分解速率常数，得到雌酮、17!3-雌二醇与雌三醇降解数度常数分别为0.15h—31h—1与0.23h—、表1SS-1菌株降解雌激素过程中雌激素浓度变化(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注<L0D:<LimitofDetection(有检出，但浓度小于最低检出限)；n.d.:notdetected(未检出)。本发明发现SS-1菌株可以有效降解雌酮、17|3-雌二醇与雌三醇，不降解17a_乙炔雌二醇。并且发现SS-1菌株降解1713-雌二醇的速度最快，且在1713-雌二醇的降解过程中证实有雌酮的生成，该生成的雌酮亦被逐渐降解。本发明与现有公开文献报道中雌激素降解菌株的降解速度进行比较，如表2所示，可以看出本申请专利中筛选出的SS-1菌株对雌酮、17P-雌二醇、雌三醇的降解效果较佳。表2与文献报道中雌激素菌株降解速度常数比较结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1.FujiiKetal.，A卯l.Environ.Microbiol.68(4)，2057-2060，2002.2.ShiJHetal.，WaterSci.Technol.45(12)，175-179，2002.3.ShiJHetal.，WaterRes.38(9)，2322-2329，2004.4.RenHaiyanetal.，Ch面sphere，66，340-346，2007.SEQUENCELISTING〈110〉北京师范大学〈120〉一种能生物降解天然雌激素的燕麦食酸菌菌株及其应用〈130〉〈140>201010119350.1〈141>2010-03-08〈160>1〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>1424〈212>DNA〈213>Acidovoraxavenae〈400>1gcggcatgccttacacatgcaagtcgaacggtaacaggtcttcggatgctgacgagtggcgaacgggtgagtaatacatcggaacgtgcccgatcgtgggggataacgaagcgaaagctttgctaataccgcatacgatctacggatgaaagcgggggatcttcggacctcgcgcggacggagcggccgatggcagattaggtagttggtgggataaaagcttaccaagccgacgatctgtagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacgggccagaatcctacg360420■54060066072078084090096010201080114012001260132013801424ggagggagcagtggggaattttggacaatgggcgcaagcctgatccagcccttgccgcgtgcaggatgaaggccttcgggttgtaaactgcttttgtacggaacgaaaaggtgccttctaat肌3gggcgctcatgacggtaccgt肌gaat肌gcaccggct肌ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttttgtaagacagaggtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcctttgtgactgcaaggttggagtgcggcagaggaggatggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcggtagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcaatcccctgggcctgcactgacgctcatgcacga肌gcgtggggagc肌3C3ggattagatatcctggtagtccacgcccta肌cgatgtcaactggttgttgggtcttaattttctcagtaacgaagctaacgcgtgaagttgaccgcttggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggttt肌ttcgatgc肌cgcg肌3肌ccttacccacctttgacatgtatgg肌tcccgaagagatttgggagtgctcgaaagagagccataacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgccattagttgctacgaaagggcactctaatgggactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttataggtggggctacacacgtcatacaatggctggtacagagggtagccaacccgcgagggggagccaatcccacaaagccagtcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagcgggtctcgccagaagtgggtagcctaaccgcaaggagggcgcttaccacggcg权利要求一种能生物降解天然雌激素的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株，其特征在于其保藏编号为CGMCCNo.3633。2.根据权利要求l所述的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株在降解天然雌激素中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其中所述天然雌激素为雌酮、1713-雌二醇和/或雌三醇。4.根据权利要求l所述的燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株在含雌激素废污水治理技术或土壤的修复技术中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其中所述天然雌激素为雌酮、1713-雌二醇和/或雌三醇。全文摘要本发明涉及一种能生物降解天然雌激素的燕麦食酸菌(Acidovoraxavenae)菌株及其应用，其保藏编号为CGMCCNo.3633，能以天然雌激素作为唯一碳源生长，能够高效降解雌酮、17β-雌二醇以及雌三醇，可以用于去除雌激素的微生物降解技术。SS-1菌株能在12小时内将初始浓度为1mg/L的雌酮降解掉99％，在24小时内能分别将初始浓度为1mg/L的17β-雌二醇与雌三醇降解掉99％。降解17β-雌二醇的过程中有雌酮的生成，其雌酮亦被逐渐降解。由于燕麦食酸菌AcidovoraxavenaeSS-1菌株具有有效降解环境中的天然雌激素的特性，因此SS-1菌株可以应用于含雌激素废污水治理技术或土壤的修复技术中。文档编号C12R1/01GK101787355SQ201010119350公开日2010年7月28日申请日期2010年3月8日优先权日2010年3月8日发明者史江红,宿凌燕,曹金铃,韩蕊申请人:北京师范大学