专利名称：一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备及冰鲜保藏的方法
技术领域：
本发明涉及一种冰点活性蛋白酶的制备方法及其应用。
背景技术：
金枪鱼作为一种深海鱼类，素来以营养价值高、纯天然、无污染而享誉国际市场， 并有"海洋黄金"之称，肉富含优质蛋白、高肌内脂肪和高维生素A、 D，其氨基酸组成与人体 必需的氨基酸组成相似，因此利用率很高。长期以来，金枪鱼一直以冻品的形式出口，随着 国外消费者对肉制品的需求越来越高，以冰鲜品形式出口的肉质食品比例越来越大(罗殷 等，200S)。所谓冰鲜品，是指海产品金枪鱼杀后，尽快加工，经过预冷、分割、包装后，迅速冷 却至肉中心温度_2 Ot:然后装入保温容器的一种肉质食品的保鲜产品(赵燕宁，1998)。 冰鲜品与冻品相比，更好的保持了海产品原有的色泽和香味，免去了冻品解冻过程，减少了 肉类的营养成分的损失。在海产品的冰鲜品基础上，如何增加冰鲜品的风味，提高冰鲜品的 质量，是需要解决的关键问题。由于冰点活性蛋白酶在(TC及以下的温度下具有催化效率高 的特点，因此在肉食品和水产品加工等低温环境工业具有广泛应用前景。但现有方法制备 得到的用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的极端耐受性差，极大的限制了其在金枪鱼 类冰鲜品的应用。
发明内容
本发明是为了解决现有方法制备得到的用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶 的极端耐受性差的问题，而提供了一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备及冰 鲜保藏的方法。 本发明用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法按照以下步骤进行
—、南极海冰细菌Colwellia sp. NJ341接种于优化培养基上，在温度为7. 5 8. 5t:、转速为180 220r/min的条件下振荡培养93 100h得到培养液，其中优化培养基 按照重量份数比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的柠檬酸钠、0. 15 0. 25份的吐 温_80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陈海水组成，pH 值为7. 5 ; 二、培养液在10000r/min条件下离心10min，然后将上清液和硫酸铵按照2. 5 3.5 : 6. 5 7. 5的重量比混合，在O 0. 5。C条件下静置7. 5 8. 5h，然后在12000r/min 条件下离心30min，弃去上清液，将离心后的沉淀和50mmol/L、 pH为7. 5的Tris-HCl缓冲 液按照1 : 0. 8 1. 2的重量比混合，在4t:条件下透析7. 5 8. 5h，然后在fC条件下经 超滤膜浓縮后即得到用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶。 本发明冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法按照以下操作进行将金 枪鱼清洗干净，切成3cm 4cm厚的鱼片，向鱼片中加入本发明的冰点活性蛋白酶，冰点 活性蛋白酶的加入量为210 220U/g鱼肉，同时向每克的鱼片中加入0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按层鱼层冰的形式放入塑料薄膜袋内，密封，快速冷却，放 入-2 (TC冷库，即实现了对金枪鱼的冰鲜保藏。 本发明制作得到的冰点活性蛋白酶，其最适温度为34 26°C，在0 l(TC条件能 保持30%以上的相对活力，在NaCl浓度为0 2mol/L的条件下酶的活力保持不变，本发明 的冰点活性蛋白酶极端耐受性好，使用本发明冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的金枪鱼有明显 嫩化现象，本发明冰点活性蛋白酶明显的抑制了金枪鱼的TvB脬值、pH值和菌落总数的上 升速度，达到保鲜的目的，使用本发明冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏的金枪鱼，与新鲜的金 枪鱼肉相比较，谷氨酸和组氨酸含量均增加了 1.5%以上，增加肉类的风味，增鲜作用明显， 使用本发明冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏的金枪鱼的保鲜期达到50天以上，保鲜期长，由 此可知，使用本发明的冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏的金枪鱼能更好的保持原有的色泽和 香味，免去了冻品解冻过程，减少了肉类的营养成分的损失，在保鲜的基础上，又能增加冰 鲜品的风味，提高冰鲜品的质量。
图1为用具体实施方式
十制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的大目金枪鱼 冰鲜品中挥发性盐基氮含量变化图； 图2为用具体实施方式
十制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金枪鱼 冰鲜品中挥发性盐基氮含量变化图； 图3为用具体实施方式
十制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的大目金枪鱼 冰鲜品中pH变化图； 图4为具体实施方式
十制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金枪鱼冰 鲜品中pH变化图； 图5用具体实施方式
十制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的大目金枪鱼冰 鲜品中总菌数量图； 图6为具体实施方式
十制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金枪鱼冰 鲜品中总菌数量图。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一 本实施方式用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法 按照以下步骤进行 —、南极海冰细菌Colwellia sp. NJ341接种于优化培养基上，在温度为7. 5 8. 5t:、转速为180 220r/min的条件下振荡培养93 100h得到培养液，其中优化培养基 按照重量份数比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的柠檬酸钠、0. 15 0. 25份的吐 温_80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陈海水组成，pH 值为7. 5 ; 二、培养液在10000r/min条件下离心10min，然后将上清液和质量浓度为65% 75%的硫酸铵按照2. 5 3. 5 : 6. 5 7. 5的重量比混合，在0 0. 5"条件下静置7. 5 8. 5h，然后在12000r/min条件下离心30min，弃去上清液，将离心后的沉淀和50mmol/L、 pH 为7. 5的Tris-HCl缓冲液按照1 : 0. 8 1. 2的重量比混合，在4。C条件下透析7. 5
8. 5h，然后在4t:条件下经超滤膜浓縮后即得到用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶。 本实施方式步骤三中陈海水是放置15天以上的海水，去除了海水中的部分微生 物和一些代谢产物等。 本实施方式步骤二中超滤膜的分子量为50Kda。 用实施方式冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法按照以下操作进行 将金枪鱼清洗干净，切成3cm 4cm厚的鱼片，向鱼片中加入本实施方式的冰点活性蛋白 酶，冰点活性蛋白酶的加入量为215U/g鱼肉，同时向每克的鱼片中加入0. 5 3g的碎冰 和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按层鱼层冰的形式放入塑料薄膜袋内，密封，快速冷却，放入 (TC -2t:冷库，即实现了对金枪鱼进行冰鲜保藏。 本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶，其最适温度为34 26t:，在0 l(TC条 件能保持30%以上的相对活力，在NaCl浓度为0 2mol/L的条件下酶的活力保持不变，本 实施方式的冰点活性蛋白酶耐受性好，使用本实施方式冰点活性蛋白酶对冰鲜保藏后的金 枪鱼有明显嫩化现象，本实施方式冰点活性蛋白酶明显的抑制了金枪鱼的TvB脬值、pH值 和菌落总数的上升速度，达到保鲜的目的，使用本实施方式冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏 的金枪鱼，与新鲜的金枪鱼肉相比较，谷氨酸和组氨酸含量均增加了 1.5%以上，增加肉类 的风味，增鲜作用明显，使用本实施方式冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏的金枪鱼的保鲜期 达到50天以上，保鲜期长。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中优化培养基 按照重量份数比由5份的酪蛋白、3. 75份的柠檬酸钠、0. 2份的吐温-80、 1份的酵母提取 物、10份的NaCl和1000份的陈海水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一至二不同的是步骤一中在温度 为『C、转速为200r/min的条件下振荡培养96h得到培养液。其它步骤及参数与具体实施 方式一至二相同。 具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三不同的是步骤二中上清液 和硫酸铵按照3 : 7的重量比混合。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四不同的是步骤二中在0°C 条件下静置8h。其它步骤及参数与具体实施方式
一至四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五不同的是步骤二中透析 8h。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五相同。
具体实施方式
七本实施方式冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法按照 以下操作进行将金枪鱼清洗干净，切成3cm 4cm厚的鱼片，向鱼片中加入本发明的冰 点活性蛋白酶，冰点活性蛋白酶的加入量为210 220U/g鱼肉，同时向每克的鱼片中加入 0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按层鱼层冰的形式放入塑料薄膜袋内，密封， 快速冷却，放入_2 ot:冷库，即实现了对金枪鱼的冰鲜保藏。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
七不同的是冰点活性蛋白酶的加入 量为215U/g鱼肉。其它步骤及参数与具体实施方式
七相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
七或八不同的是向每克的鱼片中加入2g的碎冰和5g的NaCl。其它步骤及参数与具体实施方式
七或八相同。
具体实施方式
十本实施方式用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法
按照以下步骤进行 —、南极海冰细菌Colwellia sp. NJ341接种于优化培养基上，在温度为7. 5 8. 5t:、转速为180 220r/min的条件下振荡培养93 100h得到培养液，其中优化培养基 按照重量份数比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的柠檬酸钠、0. 15 0. 25份的吐 温80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陈海水组成，pH值 为7.5 ; 二、培养液在10000r/min条件下离心10min，然后将上清液和硫酸铵按照3 : 7的 重量比混合，在0 0. 5t:条件下静置7. 5 8. 5h，然后在12000r/min条件下离心30min， 弃去上清液，将离心后的沉淀和50mmol/L、pH为7. 5的Tris HC1缓冲液按照1 : 1的重量 比混合，在4t:条件下透析7. 5 8. 5h，然后在4t:条件下经超滤膜浓縮后即得到用于金枪 鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶。 本实施方式步骤三中陈海水是放置15天以上的海水，去除了海水中的部分微生 物和一些代谢产物等。 本实施方式步骤二中超滤膜的分子量为50Kda。 用实施方式冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法按照以下操作进行将 大目金枪鱼或黄鳍金枪鱼清洗干净，切成3cm 4cm厚的鱼片，向鱼片中加入本实施方式的 冰点活性蛋白酶，冰点活性蛋白酶的加入量为215U/g鱼肉，同时向每克的鱼片中0. 2g的碎 冰和0. 03g的质量浓度为4%的NaCl，然后按层鱼层冰的形式放入塑料薄膜袋内，密封，快 速冷却，放入(TC -21:冷库，即实现了对金枪鱼的冰鲜保藏(得到了金枪鱼冰鲜品)。
本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶，其最适温度为34 26t:，在0 l(TC条 件能保持30%以上的相对活力，O 2丽aCl浓度下酶的活力保持不变，本实施方式的冰点 活性蛋白酶耐受性好，使用本实施方式冰点活性蛋白酶的金枪鱼冰鲜品有明显嫩化现象。
图1为用本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的大目金枪鱼冰鲜 品中挥发性盐基氮含量变化图，图1中^""^^表示用实施方式冰点活性蛋白酶制作金枪 鱼冰鲜品醫表示未经任何处理的金枪鱼；图2为用本实施方式制作得到的冰点活 性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金枪鱼冰鲜品中挥发性盐基氮含量变化图，图2中^ ^^表 示用实施方式冰点活性蛋白酶制作金枪鱼冰鲜品，醫表示未经任何处理的金枪鱼； 图3为用本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的大目金枪鱼冰鲜品中pH变 化图，图3中^ ^^表示用实施方式冰点活性蛋白酶制作金枪鱼冰鲜品，醫表示 未经任何处理的金枪鱼；图4为用本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄 鳍金枪鱼冰鲜品中pH变化图，图4中^""^^表示用实施方式冰点活性蛋白酶制作金枪 鱼冰鲜品，醫表示未经任何处理的金枪鱼；图5为用本实施方式制作得到的冰点活 性蛋白酶冰鲜保藏后的大目金枪鱼冰鲜品中总菌数量图，图5中》 ^ 表示用实施方式 冰点活性蛋白酶制作金枪鱼冰鲜品，墨表示未经任何处理的金枪鱼；图6为用本实 施方式制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金枪鱼冰鲜品中总菌数量图，图6中 ""^^^表示用实施方式冰点活性蛋白酶制作金枪鱼冰鲜品，墨表示未经任何处 理的金枪鱼
6
从图1 6中可以看出，大目金枪鱼和黄鳍金枪鱼在冰点性蛋白酶处理后，能够较 明显的抑制TvB脬值、pH值和菌落总数的上升速度，使用本实施方式制作得到的冰点活性 蛋白酶实现了金枪鱼保鲜的目的。 冰点活性蛋白酶对大目金枪鱼和黄鳍金枪鱼酶解影响如表1所示。 表l
大目金枪鱼黄鳍金枪鱼氨基酸冰点活性蛋白酶对照冰点活性蛋白酶对照
(%)(。/。)(%)(%)
谷氨酸(Glu)1. 250. 621. 040. 57
甘氨酸(Gly)0. 230. 180. 340. 13
丙氨酸(Ala)0. 400. 260. 280. 24
天冬氨酸(Asp)0. 240. 150. 230. 14
苏氨酸(Thr)0. 160. 100. 140. 09
丝氨酸(Ser)0. 160. 100. 160. 12
缬氨酸(Val)0. 350. 270. 270. 24
蛋氨酸(Met)0. 520. 370. 480. 33
异亮氨酸(Ile)0. 640. 450. 510. 28
亮氨酸(Leu)0. 380. 250. 420. 27
酪氨酸(Tyr)0. 290. 190. 280. 19
苯丙氨酸(Phe)0. 260. 170. 260. 16
赖氨酸(Lys)0. 310. 200. 370. 21
组氨酸(His)2. 851. 702. 431. 54
精氨酸(Arg)0. 160. 110. 150. 13
脯氨酸(Pro)0. 140. 090. 170. 09
游离氨基酸总量9. 575. 227. 534. 73 注"冰点活性蛋白酶"表示用本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后 的黄鳍金枪鱼冰鲜品，"对照"表示未经任何处理的金枪鱼。 从表1中的数据看出，本实施方式制作得到冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金 枪鱼冰鲜品中释放出了更多的游离氨基酸，谷氨酸和组氨酸含量显著增加，增加肉类的风 味，起到增鲜作用，经本实施方式制作得到冰点活性蛋白酶冰鲜保藏后的黄鳍金枪鱼冰鲜 品保鲜期为50天，保鲜期长。 使用本实施方式制作得到的冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏的金枪鱼更好的保持 原有的色泽和香味，免去了冻品解冻过程，减少了肉类的营养成分的损失，在保鲜的基础 上，又能增加冰鲜品的风味，提高冰鲜品的质量
权利要求
一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法，其特征在于用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法按照以下步骤进行一、南极海冰细菌Colwellia sp.NJ341接种于优化培养基上，在温度为7.5～8.5℃、转速为180～220r/min的条件下振荡培养93～100h得到培养液，其中优化培养基按照重量份数比由4.8～5.2份的酪蛋白、3.6～3.9份的柠檬酸钠、0.15～0.25份的吐温-80、0.8～1.2份的酵母提取物、8～12份的NaCl和950～1050份的陈海水组成，pH值为7.5；二、培养液在10000r/min条件下离心10min，然后将上清液和硫酸铵按照2.5～3.5∶6.5～7.5的重量比混合，在0～0.5℃条件下静置7.5～8.5h，然后在12000r/min条件下离心30min，弃去上清液，将离心后的沉淀和50mmol/L、pH为7.5的Tris-HC1缓冲液按照1∶0.8～1.2的重量比混合，在4℃条件下透析7.5～8.5h，然后在4℃条件下经超滤膜浓缩后即得到用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶。
2. 根据权利要求1所述的一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法，其 特征在于步骤一中优化培养基按照重量份数比由5份的酪蛋白、3. 75份的柠檬酸钠、0. 2份 的吐温80、 1份的酵母提取物、10份的NaCl和1000份的陈海水组成。
3. 根据权利要求1或2所述的一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方 法，其特征在于步骤一中在温度为『C、转速为200r/min的条件下振荡培养96h得到培养 液。
4. 根据权利要求3所述的一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法，其 特征在于步骤二中上清液和硫酸铵按照3:7的重量比混合。
5. 根据权利要求1、2或4所述的一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方 法，其特征在于步骤二中在ot:条件下静置8h。
6. 根据权利要求1所述的一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备方法，其 特征在于步骤二中透析8h。
7. 冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法，其特征在于冰点活性蛋白酶对金枪 鱼进行冰鲜保藏的方法按照以下操作进行将金枪鱼清洗干净，切成3cm 4cm厚的鱼片， 向鱼片中加入本发明的冰点活性蛋白酶，冰点活性蛋白酶的加入量为210 220U/g鱼肉， 同时向每克的鱼片中加入0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按层鱼层冰的形 式放入塑料薄膜袋内，密封，快速冷却，放入_2 ot:冷库，即实现了对金枪鱼的冰鲜保藏。
8 根据权利要求7所述的冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法，其特征在于 冰点活性蛋白酶的加入量为215U/g鱼肉。
9. 根据权利要求7或8所述的冰点活性蛋白酶对金枪鱼进行冰鲜保藏的方法，其特征 在于向每克的鱼片中加入2g的碎冰和0. 03g的NaCl。
全文摘要
一种用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的制备及冰鲜保藏的方法，它涉及一种冰点活性蛋白酶的方法及其应用。本发明解决了现有方法制备得到的用于金枪鱼冰鲜保藏的冰点活性蛋白酶的极端耐受性差的问题。方法一、南极海冰细菌Colwellia sp.NJ341接种于优化培养基上进行培养得到培养液；二、培养液经离心、透析、超滤膜浓缩得到冰点活性蛋白酶；冰鲜保藏的方法向鱼片中加入冰点活性蛋白酶，同时加入碎冰和NaCl，密封，冷却。本发明方法得到的冰点活性蛋白酶极端耐受性好，使用本发明的冰点活性蛋白酶进行冰鲜保藏的金枪鱼能更好的保持原有的色泽和香味，在保鲜的基础上，又能增加冰鲜品的风味，提高冰鲜品的质量。
文档编号A23B4/09GK101724616SQ20101030028
公开日2010年6月9日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日
发明者侯艳华, 李宁, 林学政, 沈继红, 王全富, 闫培生 申请人:哈尔滨工业大学