专利名称：一株苯并[a]芘高效降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株新型降解高环多环芳烃苯并[a]芘(BaP)的真菌降解特性的筛选及其在污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。
背景技术：
^1^77 (polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs) Mi^MΦWWI/l 污染物，因为某些PAHs具有“三致”效应，16种PAHs被美国环保局列为环境优先监测污染物，其中五环的PAH-BaP因其高的致癌和致畸作用而被广泛关注，是中国环境主要污染物之一。微生物修复技术是PAHs污染去除最主要的方式。虽然，微生物修复技术具有经济、 高效、无二次污染、适用范围广等优点，但是PAHs污染的微生物修复却因高环(四环以上) PAHs的难降解性而受到限制。以往报道中，研究者发现了一系列的菌株能够降解、共代谢氧化或是矿化部分的高环多环芳烃，其中包括红球菌、洋葱伯克氏菌、少动鞘氨醇假单胞菌等，它们能以四环多环芳烃(如芘和屈)为唯一的碳源和能源进行矿化作用，而能够利用 BaP作为唯一的碳源和能源进行降解的菌株非常少见。Sudarat等报道了由真菌一微紫青霉菌和细菌-嗜麦芽糖寡养单胞菌组成的复配菌群可以利用BaP作为唯一的碳源和能源进行降解，但两株菌单独使用时都不能利用其作为唯一的碳源和能源，这也增加了实际修复中的难度。Rafin等筛选出一株腐皮镰孢霉菌，能以BaP为唯一的碳源和能源进行降解，但对BaP(100mg/L)的12d降解率仅为4%。因此，筛选一株能单独、高效降解BaP的菌株是非常有科学价值和环境污染修复现实意义的。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有BaP降解技术存在的瓶颈问题，提供一种能高效、 快速降解高浓度BaP的菌株，并对其降解特性进行研究。本发明的另一目的是提供上述菌株进行污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。本发明提供的BaP高效降解真菌来源于北京焦化厂污染土壤，经人工富集、筛分及纯化所得到。经中国科学院微生物研究所鉴定，该菌株具有以下分类学特征麦芽汁琼脂培养基(MEA)上菌落生长快，25°C黑暗条件下3天菌落直径65-70mm，初期白色，后期灰黑色，质地絮状，稀疏；菌落背面与正面同色，无水溶性色素。菌丝无色，光滑，多分枝，具分隔，宽2. 5-12. 1 μ m。培养后期形成少量黑点，为分生孢子器，发育成熟后分生孢子从孔口挤出。分生孢子深褐色，椭圆形或卵圆形，直，双细胞。此外，进行rRNA基因序列测定(包括 18SrRNA片段，ITSl、5. 8rRNA, ITS2的全序列及^S区序列片段)，最终，鉴定为可可毛色二 3 (Lasiodiplodia theobromae)。与现有技术相比，本发明菌株L. theobromae在无机盐培养基(MSM)中，对 BaP(100mg/L)10天降解率达到52. 5%，此外在加入营养物质(ImL) 土豆培养基(PDA)、调节PH = 5及加入底物水杨酸和琥珀酸钠时，都能促进菌株对于BaP的降解，最高降解率可达58.7%。L. theobromae同样能降解高浓度(200mg/L)的菲(PHE)和芘(PYR)，对三者的降解能力PHE > PYR > BaP。此外L. theobromae在优化条件(ImL PDA, pH = 5，水杨酸 (200mg/L))下对于BaP染毒(50mg/L) 土壤35天降解率可达到51. 4%，对于实际焦化厂污染土壤中16种PAHs 20天的降解率达到39.0% 96.7%，降解率随着苯环数增加而降低。 利用这些特点，本发明L. theobromae可用于降解单一高环多环芳烃BaP或PAHs，或者用于 PAHs污染土壤的生物修复，并为利用BaP作为唯一碳源和能源进行降解提供了一种新的种质资源。
图1L. theobromae对MSM及PDA加入体系中BaP的降解比较2L. theobromae对不同pH下BaP的降解比较3添加不同代谢底物L. theobromae对BaP的降解比较 4L. theobromae 对 PHE、PYR 和 BaP 的降解比较5初始和优化条件下L. theobromae对土壤中BaP的降解比较6L. theobromae对实际焦化厂污染土壤中PAHs的降解图
具体实施例方式下面结合实施对本发明进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。实施例1 :BaP降解菌L. theobromae的筛选分离。45mL无机盐培养基(MSM)中加入5g焦化厂污染土壤和20颗玻璃珠，摇床振荡培养1 后静置。取5mL静置分层后的上清液于含有45mL MSM(BaP浓度25mg/L)的灭菌三角瓶中，300C、150r/min避光振荡培养。5d后，取5mL菌液转移至BaP浓度为50mg/L的MSM 中，重复上述步骤，依次提高BaP浓度为25，50，75，100mg/L。在富集培养过程中，在MSM中加入了少量葡萄糖(每IOOmL MSM加入0. Ig葡萄糖)加快微生物生长。将最后一周期的培养液涂布于含有BaP(100mg/L)的牛肉膏固体培养基和土豆培养基(PDA)平板(60mg/L青霉素和100 μ g/mL链霉素)上，30°C恒温培养。菌落生长至大小适中后，经过数次平板划线分离后得到单一 BaP降解细菌和真菌。上述所有操作都在无菌条件下进行。无菌条件下，从斜面上用接种环挑取一环菌，接种于液体营养培养基中，真菌和细菌分别置于30°C，150r/min的摇床上培养24h和72h。培养后的菌液3000r/min离心分离 20min,倒掉上清液，加入一定量的灭菌MSM清洗，重复上述步骤清洗三次，MSM定容得到所需浓度的菌悬液。无菌条件下50mL三角瓶中加入18mL MSM、2mL菌悬液和一定体积的BaP丙酮储备液，使微生物密度分别达到104个(细胞)/mL或0. Olg (菌丝湿重)/mL，BaP的浓度达到 100mg/L，30°C、150r/min避光振荡培养。分别在1、2、4、7、IOd取样测定BaP的残留量。空白对照实验采用高温灭菌(121°C，30min)菌悬液。各实验组中每一处理均为3个重复。焦化厂污染土壤中共筛出5株降解BaP的活性菌株。其中细菌两株，分别命名为 B-I和B-2 ；真菌三株，分别命名为F-l，F-2和F-3，测定了所有菌株对BaP的降解能力(见表1)。菌株F-I (鉴定结果为L. theobromae) IOd降解率最高，这是首次发现L. theobromae 对BaP有好的降解特性。表1筛选菌株的BaP降解率比较
权利要求
1.筛选出一株苯并[a]芘(BaP)高效降解菌，其特征在于该菌为可可毛色二孢菌 (Lasiodiplodiatheobromae)，并具有降解BaP和多环芳烃混合物(PAHs)的能力。
2.权利1中的L.theobromae对BaP的降解特征在无机盐培养基(MSM)中能够利用BaP为唯一的碳源和能源对其进行降解，降解率达到50%以上;MSM中加入土豆培养基(PDA)在降解初期显著促进BaP的降解速率，提高总体降解率； L. theobromae可耐受较广的pH范围，在pH = 5时对BaP的降解率最高； 添加代谢底物琥珀酸钠和水杨酸能促进L. theobromae对BaP的降解； L. theobromae能够修复单独BaP染毒土壤和实际中多环芳烃污染的土壤。
3.权利要求1或2所述L.theobromae降解单一高环多环芳烃BaP污染物或PAHs污染物，或者在PAHs污染土壤生物修复中的应用。
全文摘要
本发明筛选出一株降解高浓度苯并[a]芘(BaP)的新菌株-可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)。L.theobromae以BaP作为唯一碳源和能源10d降解率为52.5％。土豆培养基(PDA)在降解初期显著促进BaP的降解。L.theobromae耐受较广的pH范围，pH＝5时降解率最高。水杨酸和琥珀酸钠能够促进L.theobromae对BaP的降解。菲、芘和BaP混合存在时，单个多环芳烃的降解率均降低。染毒土壤中的BaP(50mg/L)35d降解率可达51.4％。污染土壤修复后，多环芳烃降解率从39.0％到～96.7％，能够用于多环芳烃污染土壤的实际修复中。
文档编号C12N1/14GK102465100SQ20101054840
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者刘海滨, 孙红文, 张志远, 王翠苹, 许伟 申请人:南开大学