专利名称：用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定snp标记组合及检测方法
技术领域：
本发明涉及使用SNP标记进行荷斯坦牛亲子鉴定的检测体系，具体涉及28个或50 个标记组合以及引物序列和检测方法。
背景技术：
据文献报道，全世界各国牛群平均系谱错误率可达11% (Banos等，2001)，不同国 家由于饲养方式和生产管理情况不同，系谱错误率也存在一定差异，但系谱错误在实际生 产管理中难以完全避免。如果按照世界平均11%的系谱错误率发生在实际生产中，美国的奶牛群体产奶性 状的遗传进展将降低12% 15% (Banos等，2001)，，同时会导致近交系数、公畜方差和跨 国间的遗传相关等的估计值偏低。Israel和Weller等(2000)的模拟研究表明，如果系谱 错误率达10 %，假设遗传力为0. 25，在20年内以色列奶牛的群体遗传进展将会损失4. 3 %。因此，完整、准确的系谱对整个奶牛业生产与研究的发展是十分必要的，亲子鉴定 已日益成为生产和科研工作的必要内容之一。目前，应用于奶牛亲子鉴定最多的是微卫星亲子鉴定方法，如国际上 ISAG(International Society for Animal Genetics)推荐的。中国农业大学课题组田菲 (2006)、张毅(2009)分别对微卫星标记亲子鉴定方法进行了构建和进一步完善。但是，微卫星标记的判型工作比较复杂，判型周期长，一般需要三天以上，并且一 些特点和技术体系不利于其用于亲子鉴定1)标记本身多态性高，不同等位基因的长度相 差不大，区分、判型较困难；2)人为操作与判断不当情况存在。以上都会导致判型错误，一 般每个PCR反应的判型错误率可达1 % 5 % (Bonin等，2004 ；Wel Ier等，2004)，Hoffman和 Amos (2005)的研究表明微卫星标记的错判率为0.001-0.0127。判型错误率直接影响亲子 关系推断的准确性，也会导致各个实验室之间甚至是同一实验室不同时期的同一微卫星标 记的同一个体判型结果不一致，使得数据可交流、比较性差，试验的可重复性也较差(Bonin 等，2004)。而SNP标记，即单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)标记，与微 卫星标记相比，SNP标记具有以下优点(1)数量丰富，分布广泛，代表性强。SNP标记很丰富，90%以上的基因中都有SNP 分布。如在牛基因组平均每443bp就存在一个SNP位点(Heaton等，2001)。(2)遗传稳定，突变率低，受选择影响小。SNP的突变概率非常低，仅为1 X 10_9 5 XlCT9 (Martinez-Arias 等，2001)，远低于微卫星的 1(Γ4 1(T6 (Herraez 等，2005)。此夕卜， SNP在单个基因或整个基因组中的分布是不均勻的，在非转录序列中要多于转录序列，而且 即使在转录区也是非同义突变的频率较大(Cargill等，1999)。因此无论在自然选择还是 人工选择的过程中，SNP标记都能够很稳定的遗传，不受选择压的影响。(3)准确性高，方便自动化、高通量检测。SNP通常只是二等位基因或二态 (biallelic)的遗传变异，即在该位置上存在两种不同的碱基，因此判型非常简单，二进制的形式可以通过计算机实现自动化，大大减少了人为错误的发生(Kruglyak等，1997 ； Fries等，2001)，提高判型准确性，节约劳动力和成本。据报道在目前大规模SNP检测的研 究中，SNP的判型错误率为0. 0001 0. 005 (Anderson等，2006)，并且SNP判型和数据处理 技术与软件发展快速，方便了实验室互相交流和重复实验。(4)DNA样品量要求低。SNP是单碱基突变，在PCR过程中一般只需要扩增IOObp 左右片段长度，因此对DNA样品量以及样品的质量要求进一步降低(Morin等，2004)，例如， 使用时间飞行质谱(MALDI-T0F)的方法对SNP标记进行分型使用的DNA样品量只需达到 2. 5 5ng艮阿。(5)检测技术丰富。随着应用的增加和技术的发展，SNP标记判型的方法越来越丰 富，可以根据不同的群体规模、成本预算选择不同的检测方法。如果在小规模样本情况下考 虑成本，应用PCR-RFLP等方法检测SNP位点是比较经济适用的。如果检测样本大，传统方 法耗时长、工作量大，更适合选择飞行质谱(MALDI-T0F)或芯片等高通量的方法。因此，虽然单个SNP标记多态性比微卫星标记低，但具备代表性强、稳定性高、测 定准确简便、可自动化高通量检测等优势，可望很好地解决在亲子鉴定中微卫星标记判型 错误率较高、重复性差的问题，通过使用多个SNP标记能够弥补其多态性差的缺点，因此将 其用于亲子鉴定的前景十分广阔。
发明内容
本发明的目的是针对现在微卫星标记判型难以自动化，错误率高的缺点，利用SNP 标记高通量、易检测、自动化的优点，针对荷斯坦牛群，建立一套可用于荷斯坦牛群体的亲 子鉴定标记组合，并建立简便、准确的飞行质谱来检测此套SNP标记多态性的技术。为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP 标记组合，其包含如下表1所示的28个SNP标记
权利要求
一种用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP标记组合，其特征在于，包含28个SNP标记，其中所述28个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.73～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.123～150所示。
2.如权利要求1所述的亲子鉴定SNP标记组合，其特征在于，包含50个SNP标记，其 中所述50个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 1 50所示；下游引物 的核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 51 100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 101 150 所示。
3.权利要求1或2所述的亲子鉴定SNP标记组合在荷斯坦牛群体亲子鉴定中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述的亲子鉴定标记组合进行荷斯坦牛亲子鉴定检测的方 法，包括以下步骤(1)提取基因组包括提取抗凝血DNA和提取公牛冻精基因组DNA ； (2) 飞行质谱检测SNP多态；(3)用软件进行亲子推断。
全文摘要
本发明公开了用于荷斯坦牛群体的亲子鉴定SNP标记组合，一种含28个SNP标记，其中所述28个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.73～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.123～150所示；一种含50个SNP标记，其中所述50个SNP标记的上游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～50所示；下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.51～100所示；单碱基延伸引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.101～150所示。本发明提供的SNP标记组合用于荷斯坦牛群，结果准确，优选利用飞行质谱方法，可快速、高通量、简便的检测SNP标记多态，从而推断牛群的亲子关系。
文档编号C12Q1/68GK101984077SQ20101056768
公开日2011年3月9日 申请日期2010年11月25日 优先权日2010年11月25日
发明者俞英, 孙东晓, 张毅, 张沅, 李 东, 王雅春 申请人:中国农业大学