专利名称：云南红梨ΔPybHLH基因及其原核表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白基因的特异性片段及其原核表达载体，和原核表达载体在制备APybHLH蛋白和特异性抗体中的应用。
背景技术：
红色果皮是梨分子育种的重要性状指标。云南省因其独特的地理和气候条件而拥有较多的红皮梨种质资源，1986年以来先后已选育出早白蜜、美人酥、满天红和云红梨I号四个栽培品种。但生产中除云红梨I号外，其它3个品种都会因气候变化而导致着色较差甚至不着色，因此需要研究红梨果皮的着色机理。已有研究表明植物花青素的合成是由转录复合物MYB/bHLH/ WD40调控的。前人对MYB研究较多，而对植物中的bHLH和WD40蛋白研究较少。在拟南芥中LDOX基因启动子直接包括EGL3和TT8在内的不同的MYB-BHLH-TTG1转录复合物的调控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突变体试验也表明了 egl3和tt8是拟南芥幼苗花青素累积的必要条件。在拟南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白与WD-repeat/bHLH/MYB 转录复合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB转录因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA调控的花青素的累积和毛状体的发生，而JA诱导的JAZ蛋白的降解能够解除这种抑制。在大丽花(DahI iavariabilis)中，bHLH 转录因子 DvIVS 通过调控 DvCHSl，DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的转录来参与其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH转录因子MYCAl可能通过调控ANR和UFGT基因的表达来调控其花青素的生物合成。在龙胆花(G.中，GtMYB3和GtbHLH参与花青素的生物合成。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl，PAPl、PAP2、CPC、TRY)组合，形成 MYB/bHLH/WD40 复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、误表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获_耗尽机制在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl，GL3，GLl和GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。在云南红梨着色机理研究方面，本实验室研究了光照对云南红梨着色的影响、构建了光诱导果皮差异表达基因的SSH文库，进行了着色相关基因的分离和表达分析。前期研究结果表明云南红梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40调控的。在前人研究基础上，针对云南红梨栽培品种早白蜜、满天红、美人酥着色不稳定、在国内外尚未见有关云南红梨果皮红色着色机理方面研究报道。在云南红梨着色机理研究中，还没有人克隆转录、因子bHLH，研究中PybHLH蛋白无法进行特异性检测和分析。目前世界红梨极其稀少，世界市场缺口较大；此外，云南红梨外观和内在品质好，商品价值高，红梨将成为梨产业发展的新的增长点，红梨育种成为梨树育种的重要方向。但是，指导育种的红梨着色的科学理论匮乏，本发明的成果将为果树及花卉的分子育种奠定基础。本发明选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为试验材料，开展云南红梨‘云红梨I号’ PybHLH转录因子基因特异性片段的克隆、序列分析和原核表达、蛋白纯化和抗体制备的研究，制备的抗体可用于云南红梨PybHLH蛋白的纯化、定位检测、表达分析以及PybHLH所结合蛋白和DNA片段的高效分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一个基因的特异性片段仏该基因是云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白基因的特异性片段，具有如SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明另一目的是提供云南红梨基因的原核表达载体pET32a-z^j^K仏该载体含有基因，基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端和C端均带有6 XHis标签。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨花青素合成及毛状体发生发育调控蛋白特异性片段APybHLH蛋白中。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备PybHLH蛋白特异性抗体中，特异性抗体能应用在PybHLH蛋白亚细胞定位、组织表达检测、PybHLH蛋白纯化、免疫沉淀(IP)及染色质免疫共沉淀(ChIP)中。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案
云南红梨PybHLH基因、Λ PybHLH纯化蛋白，由下述方法制备而得
(I)根据苹果履/从基因(GenBank登录号为DQ266451. I)编码框，设计I对特异引吻\ PybHLH-F 办’ -GTCGACATGGCTCAGAATCATGAGAGGGTG-3，取 PybHLH-R ·)’ CTCGAGGCACTTACCAGCAATTTTCCAAAGC，在上下游引物的5'端分别加入fe7I和通ol酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点)。以云南红梨总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PybHLH-F 和 PybHLH-R 进行扩增；
全长片段的回收；
基因的T/A克隆和测序；
(4)/>从^7基因的生物信息学分析及GenBank登录号的获得；
(5)APybHLH片段的克隆将云南红梨果皮中的PybHLH蛋白序列与苹果、矮牵牛、拟南芥和玉米等调控花青素生物合成的bHLH转录因子进行比对，根据比对结果和pET32a载体，设计了一对引物-APvbHLH-F: CCATGGATTGCTGTGAGAAATCTTCCTCTG 和 APybHLH-R CTCGAGACCTTGCAAATTTGGGAGCAAATC,在上下游引物的5'端分别加入AfcoI和沿ol酶切位点(下划线部分为酶切位点)。以质粒pMDlST-/^^^^为模板，使用APybHLH-F取APybHLH-R进行扩增；
全长片段的回收、T/A克隆和测序；(7)构建原核表达载体使用AfcoI和沿ol对片段和pET32a进行双酶切，分别获得5'和3'末端带有分别带有AfcoI和通ol酶切位点的基因片段和pET32a载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16 h，获得原核表达载体^1 ,2a-APybHLH ；
APybHLH的原核表达载体的构建和原核表达使用热刺激法将mUybHLH铸入大肠杆菌办(DE3)中，在IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；
(9)APybHLH蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制备PybHLH蛋 白特异性抗体和用于PybHLH蛋白表达检测等。如果镍柱纯化后，蛋白仍有杂带，可以使用割胶回收的方法进行二次纯化。相对于目前使用融合GST、HA、FLAG标签的蛋白表达方法，本发明所制备的抗体具有特异性高、专一性强的特点，能够准确的检测PybHLH蛋白的亚细胞定位、高效的进行PybHLH蛋白的纯化、高效分离PybHLH蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
图I为本发明云南红梨的总RNA电泳示意图。图2为本发明PybHLH基因的PCR产物电泳示意图，其中I是DNA Marker III ；2是PybHLH基因PCR产物。图3为本发明pMD18T-PybHLH的酶切检测示意图；其中I是DNA Marker III ;2、4、6 是 pMD18T-PybHLH 质粒；3、5、7 是 pMD18T_PybHLH 质粒 2、4、6 的 SalI 和 XhoI 双酶切结
果O图4为本发明PybHLH蛋白与其它植物中花青素生物合成和毛状体发生发育调控蛋白bHLH的分子发育树；使用ClustalX2比对，使用Mega4. O中的N-J method构建，Booststrap=IOOOo图5为本发明APybHLH蛋白在16 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM条件诱导下的表达情况电泳示意图，其中I是转化pET_32a空载体的Rosetta菌体总蛋白；2_6是原核表达载体pET32a-APybHLH在16 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM条件下诱导0、2、4、6和16 h后的表达情况；7_8是原核表达载体pET32a- Δ PybHLH在16 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM条件下诱导16 h，总蛋白破碎后目的蛋白在沉淀和上清中的表达情况；9是Ni柱小量纯化的蛋白；10是蛋白质分子量标准M0431 ；11是10 μ I的O. 1% BSA。图6为本发明APybHLH蛋白的镍柱纯化电泳示意图，其中I是原核表达载体pET32a-Λ PybHLH在16 °C、0. 5 mM IPTG诱导16 h后的总蛋白；2是挂柱后的流穿液；3-5分别为30、150和500 mM咪唑洗脱后的结果；6_7是蛋白质分子量标准M0441和M0431。图7为本发明镍柱纯化后的蛋白的二次纯化电泳示意图，其中I和3是纯割胶回收后的APybHLH蛋白样品；2是蛋白质分子量标准M0441 ;4是10 μ 11 O. 1%的BSA。图8为本发明Λ PybHLH抗体检测APybHLH蛋白的Western Blot检测结果示意图。
图9为本发明APybHLH抗体检测35S: :PybHLH转基因烟草的Western Blot检测结果示意图。图10为本发明使用Δ PybHLH检测PyMYB-PybHLH互作的Western Blot检测结果示意图。图1-4为光照0、3、5、7天后、使用APyMYB特异性抗体免疫沉淀、使用APybHLH检测的云红梨I号总蛋白。图11为本发明原核表达载体pET32a_APybHLH的构建策略示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例废本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于所述内容。实施例中使用的试剂主要为分子生物学试验试剂；各种限制性内切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为大连宝生物工程有限公司产品，反转录酶为Promaga公司的，PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，Rosetta (DE3)菌株和感受态细胞为北京Transgene公司产品；其余试剂均为国产分析纯。使用的仪器为GE Health公司的His Trap (I ml)柱子,其它仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器设备。所有引物序列合成和基因测序均在上海生工生物工程公司进行。本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I :本发明基因及其特异性片段的克隆，具体步骤如下
(I)引物设计
根据苹果履&现"幻基因(GenBank登录号为DQ266451. I)编码框，设计I对特异引物PybHLH-F :5，-GTCGACATGGCTCAGAATCATGAGAGGGTG-3，和 PvbHLH-R :3’ : CTCGAGGCACTTACCAGCAATTTTCCAAAGC，在上下游引物的5'端分别加入fe7I和沿ol酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点)。(2)总RNA的提取
a、用液氮将O.I g云红梨红色果皮充分研磨成粉末以后，加入I ml RNA提取缓冲液(4M异硫氰酸胍，25 mM柠檬酸钠，O. 5 % (w/v)十二烷基肌氨酸钠，2 %(w/v) PVP, β -巯基乙醇)，转入2 ml离心管中，再研磨均匀后，再加入1/10体积2 M醋酸钠(pH 4.2)；
b、颠倒离心管数次，混匀之后，接着加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，盖紧离心管盖，剧烈摇动5 min,冰上静置15 min后,4 °C离心15 min (12000 g/min)；
C、离心结束后取上清于新离心管中，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动5min,冰上静置 15 min 后,4 °C离心 15 min (12000 g/min)；
d、取上清，加入等体积异丙醇，在-20°C沉淀RNA30 min，再次4 °C离心15 min (12
000g/min),让RNA沉淀在管壁；
e、RNA沉淀经75%乙醇清洗两次后抽真空干燥，然后加入20 μ I无RNase的DEPC处理水彻底溶解RNA ；
f、使用I.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA (见图I)。(3) RT-PCR
以云南红梨总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PybHLH-Y和PybHLH-认进行扩增，得到PCR产物基因片段(见图2)片段的回收对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段；使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。基因的T/A克隆和测序；将回收的PCR产物，按照pMD18T说明书，进行T/A克隆；转化大肠杆菌感受态DH5 α后，涂固体LB + Amp平板，挑取白色菌落，接种到液体LB + Amp培养基中，37 °C >200 rpm摇床过夜，提取质粒，进行酶切检测(见图3)，然后送上海杰瑞生物公司进行测序。(6)/>从^7基因测序和生物信息学分析及GenBank登录号的获得:/>6现"基因的读码框为1947 bp，该基因编码648个氨基酸，分子量为72925. 8 Da，等电点为5. 5LDNAMAN比对结果表明，与苹果、矮牵牛、拟南芥和玉米等调控花青素生物合成的bHLH转录因子具有很高的同源性，尤其是与苹果中的MdbHLH33的同源性为95.22 % (图4)，故将该序列命名为/基因。将该序列上传至GenBank数据库，获得其登录号为HM622265。稀有密码子分析结果表明/基因含有大约9 %的稀有密码子，其中二连体稀有密码子共7个，因此原核表达时需要使用能够补充稀有密码子的大肠杆菌/菌株进行原核表达。(.DAPybHLH片段的克隆将云南红梨果皮中的PybHLH蛋白序列与苹果、矮牵牛、拟南芥和玉米等调控花青素生物合成的bHLH转录因子进行比对，根据比对结果选取的PybHLH中特异性的区段和pET32a载体，设计了一对引物-APybHLH-F CCATGGATTGCTGTGAGAAATCTTCCTCTG 和 APybHLH-R CTCGAGACCTTGCAAATTTGGGAGCAAATC,在上下游引物的5'端分别加入Afc0I和ZAoI酶切位点(下划线部分为酶切位点)。以质粒VWim-PybHLH 为模板，使用 APybHLH-Y 和 APybHLH-R 进行扩增。(8)ζ1/^ΜΖ"全长片段的回收、T/A克隆和测序将基因的PCR产物，按照胶回收试剂盒说明书进行回收，然后使用PMD18T进行T/A克隆；转化大肠杆菌DH5 α感受态、涂平板、提取质粒酶切验证后，送上海杰瑞生物公司进行测序。测序结果表明与/>况￡//相比，没有发生突变。稀有密码子分析结果表明基因含有大约7 %的稀有密码子，其中二连体稀有密码子共3个，因此原核表达时需要使用能够补充稀有密码子的大肠杆菌沿菌株进行原核表达。实施例2 :原核表达载体V^mybHLH的构建(图11)
使用AfcoI和沿ol对ρΜ 18Τ-ζ1/^^Κ#和载体pET32a按照说明书进行双酶切，分别获得5’端带有AfcoI和3’端带有通ol的片段和pET32a载体，跑电泳后分别进行胶回收，按照摩尔比目的基因载体=3 :1加样,然后加入Ligation Solution 1,16 °〇连接16 h。将感受态大肠杆菌疋coli DH5 α 100 μ I加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30 min, 42 °C热刺激45 s后，冰浴2 min ;加入900 μ I液体培养基S0C，37 °C摇床200rpm 60min使菌体复苏；培养结束后,常温8000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约O. I ml时,使用移液枪混勻,接入带有Amp抗性的LB固体平板上,用无菌三角棒涂布均匀；37 °C过夜培养；挑取白色菌落，接种于LB液体+ Amp的培养基，37 °C ,180rpm培养12 h后，提取质粒；进行酶切验证后，再送至上海杰瑞生物公司测序进行测序验证插入基因的正确性，最后获得原核表达载体m^-APybHLH。实施例3的原核表达使用热刺激法将重组质粒转化入大肠杆菌TfoMiia (DE3)感受态细胞中。涂LB+Amp固体平板，挑取pET32a-PybHLH的重组菌落于LB + Amp液体培养基中37 0C>200 rpm振荡培养过夜，按I : 100的比例接种于相同的LB培养基上培养至OD6c 为
O.6-0. 8，加IPTG至终浓度为O. 5 mM，分别在16 °C下培养0、2、4、6和16 h后收集菌液用于分析总蛋白。4 0C >12 000 rpm离心I min,弃上清液,沉淀用100 μ I SDS凝胶加样缓冲液(Tris-HCl 50 mM, pH 6. 8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚蓝 O. I % ;甘油 10 %)重悬，煮沸5 min后，12 000 rpm离心I min，取20 μ I上清液进行SDS-PAGE检测。用考马斯亮蓝R-250染色液(O. I %考马斯亮蓝R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脱色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)进行脱色后，使用凝胶成像系统进行拍照。结果显示插入有外源片段的重组质粒pET32a- NPybHLH经IPTG诱导后，在预期的蛋白分子量约50 kD (包括载体上TRX蛋白)左右有I条蛋白条带，而未诱导的转化重组质粒和pET-32a对照质粒未出现这条蛋白带(图5)，表明重组质粒pET32a-A/y/^Z"在大肠杆菌沿xseiia (DE3)中诱导表达了 APybHLH蛋白。超声破碎后，SDS-PAGE检测后，发现该蛋白主要在上清表达(图5)。
实施例4 : APybHLH蛋白纯化
(I)APybHLH蛋白的镍柱纯化，在16 0C>0.5 mM IPTG下大量摇菌，收集菌体后
a、菌体破碎将大量诱导表达IL后的菌体，经超声破碎菌体(工作3 S，休息6 s)5
min ；
b、收集上清和沉淀将菌体破碎液40C >12 000 rpm离心20 min，分别保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用O. 22 μ m滤器进行过滤，除去杂质；
d、His-TrapHP柱的预处理使用5倍柱体积纯水洗柱；5倍柱体积结合缓冲液(磷酸钠缓冲液20 mM (pH7. 4), NaCl 0.5 M，咪唑30 mM)平衡柱子，流速为I ml/min ;
e、蛋白样品上柱流速为Iml/min,收集流出液；
f、洗柱使用5倍柱体积结合缓冲液(磷酸钠缓冲液20mM(pH7.4),NaCl 0.5 M，咪唑30 mM)洗脱；
g、洗脱分别使用5倍柱体积洗脱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，NaCl 0.5 M，咪唑30、150、500 mM)依次洗脱，收集洗脱液；(见图6)
h、His-TrapHP柱的后处理5柱体积洗脱缓冲液(磷酸钠缓冲液20 mM(pH7. 4),NaCl
0.5 M，咪唑500 mM)洗去所有蛋白；5倍柱体积纯水洗柱；5倍柱体积20 %乙醇洗柱；柱子前后封口，于4 °C、20 %的乙醇中保存；
i、SDS-PAGE检测分别取50μ I各咪唑梯度流出液，加入5 μ I的5Χ蛋白上样缓冲液，混匀后，煮沸5 min,4 °C>13 000 rpm离心5 min后，各取20 μ I上样，进行SDS-PAGE分析。(2)二次纯化镍柱纯化后，蛋白仍有杂带，使用割胶回收的方法进行二次纯化，具体操作如下
a、透析袋的预处理剪取适当长度(10-20cm)的透析袋(截留范围为8 000-12 000Da);置于500 ml含2 %(ff/V)碳酸氢钠和I mM EDTA (pH8. O)水溶液中，煮沸10 min ;蒸馏水彻底清洗透析袋；置于ImM EDTA(pH8. O)溶液中再次煮沸10 min ;冷却后4 °C保存；
b、取已溶解的蛋白沉淀，加1/5体积5X蛋白上样缓冲液进行SDS-PAGE电泳；C、电泳结束后将胶放在O. 25 M预冷的KCl中，4 °C浸泡5分钟使蛋白显白色。蒸馏水冲洗蛋白胶，用刀片从SDS-PAGE电泳凝胶上切下目的蛋白，切成I mm X I mm X I mm的碎片，放入预处理好的透析袋中，注入2 ml SDS-PAGE电泳缓冲液，将透析袋前后封口 ；
d、电泳回收在水平核酸电泳槽中加入适量SDS-PAGE电泳缓冲液，将装有凝胶的透析袋置入其中，100 V电压，4 °C电泳4-5 h，直至凝胶变透明，说明目的蛋白从凝胶中洗脱出来；
e、透析洗脱完毕，吸出透析袋内溶液，SDS-PAGE检测(以10μ I的BSA标准蛋白定量)电泳结果，鉴定后正确的蛋白溶液装入干净的透析袋中，用预冷的IXPBS溶液(I XPBS (IL)KCl O. 2 g、NaCl 8 g、Na2HPO4 I. 42 g、KH2PO4 O. 27 g)添加尿素[8 M(96 g)、6M(72 g)、4 M(48 g)、2 M(24 g)、0 Μ]于4 °C下分别透析3-5 h，其间换透析液2-3次；
f、将鉴定正确的蛋白溶液(见图7)纯化后的蛋白送云大生物公司制备PybHLH蛋白特异性抗体，该特异性抗体可用于PybHLH蛋白表达水平检测、亚细胞定位检测、PybHLH蛋白 的纯化、免疫沉淀(IP)和染色质免疫共沉淀(ChIP)试验。实施例5 PybHLH蛋白特异性抗体的Western检测
为检测PybHLH蛋白特异性抗体的有效性，使用APybHLH蛋白抗体分别对大肠杆菌中Δ PybHLH蛋白和PybHLH过表达转基因烟草进行了检测，本实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体内容如下
本实施例中使用的试剂与仪器如下
垂直蛋白电泳仪、PVDF膜(millipore)，半干转膜仪(BIO-RAD)；
丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED, I X甘氨酸Buffer，I XPBS, I XPBT,脱脂奶粉，Whitman 3MM滤纸等SDS-PAGE和Western试验试剂。本实施例中材料及处理方法如下
I、Λ PybHLH蛋白的处理使用在16 °C、0. 5 mM IPTG诱导16 h下的菌体，添加5X蛋白上样缓冲液后，沸水煮10 min ;冰上放置2 min ；4 °C >13 000 rpm离心5 min后即可上样进行SDS-PAGE。2、35S:转基因烟草总蛋白的提取取I g烟草叶片，在研钵中使用液氮研磨后，加入 900 μ I 蛋白质抽提液(10 % 甘油，100 mM Tris-HCl (pH 8. O), I mM PMSF, 5%PVP, 10 mM巯基乙醇)研磨混匀；在4 °C >12 000 rmp离心10 min，将上清转移到新的I. 5ml离心管中，放置在冰上；取100 μ I上清于新的离心管中，其余的置于-20 °C保存备用；向离心管中添加25 μ I 5Χ蛋白上样缓冲液后，沸水煮10 min ;冰上放置2 min ；4 °C,13
000rpm离心5 min后即可上样进行SDS-PAGE。3、SDS-PAGE 检测 Cl)配制 SDS-PAGE 胶；
(2)样品制备见I和2，上样后进行电泳恒流，浓缩胶30 mA，分离胶40 mA。4> Western blot 检测
(1)转膜设定电流为2.O mA/cm2,转膜I h ；
(2)封闭；
(3 )添加一抗(Δ PybHLH抗体)；
(4)添加二抗；(羊抗兔的商业化抗体)(5)结果观察
弃I X PBTjP I ml工作液(500 μ I稳定剂+ 500 μ I发光底物，混匀)，浸润整个PVDF膜，转入成像系统Chemidoc XRS (BIO-RAD)，将成像系统上方调至O档，选Chemi HiSensitivity进行成像。Western Blot检测结果如图8和图9,图8中在大约50 kDa出现条带，图9中在大约73 kDa出现条带，这与预期的结果相一致，表明本发明制备的PybHLH蛋白特异性抗体有效，且特异性非常好，适用于PybHLH蛋白的亚细胞定位检测、与PybHLH蛋白结合的蛋白质和DNA片段的分离、PybHLH蛋白的表达检测等。实施例6 PybHLH蛋白特异性抗体验证PyMYB-PybHLH互作的Western检测 为检测PybHLH蛋白特异性抗体的在验证蛋白互作中的有效性，首先使用Λ PyMYB特异
性抗体沉淀光照0、3、5、7天的云红梨I号果皮的总蛋白，然后使用Λ PybHLH蛋白抗体检测PybHLH蛋白。具体内容如下
I、实施例中使用的材料为云红梨I号光照0、3、5和7天的果皮，削皮后，液氮冷冻，-80°C保存。2、免疫沉淀
(1)云红梨I号总蛋白的提取分别取红梨I号光照0、3、5和7天的果皮Ig，在研钵中使用液氮充分研磨成粉末后，加入5 ml蛋白质抽提液(10 %甘油，100 mM Tris-HCl (pH8. O), I mM PMSF, 5 % PVP, 10 mM巯基乙醇)研磨混匀；在4 °C抽提3 h后，4 °C >12 000 rmp离心10 min ;将上清转移到新的离心管中，放置在冰上；
(2)使用Bradford缓冲液检测蛋白浓度后，各取500μ g总蛋白于新的离心管中；
(3)分别添加10μ I PyMYB特异性抗体，4 1摇床过夜；
(4)次日，添加20 μ I Protein-A-Agarose (Santa Cruz), 4 °C摇床 I h;
(5)4°C >2500 rmp 离心 5 min,弃上清；
(6)添加Iml IX磷酸缓冲液,4。(!'摇床清洗5 min ；4 °C >2500 rmp离心5 min,弃上
清；重复清洗3次；
(7)向沉淀中添加32μ I IX磷酸缓冲液、8 μ I的5Χ蛋白上样缓冲液后，沸水煮10min ;冰上放置2 min ；4 °C、13 000 rpm离心5 min后即可上样。3、SDS-PAGE 及 Western 检测
操作同实例5，结果如图10，光照0、3、5、7天后的云红梨I号果皮总蛋白中检测到PybHLH蛋白，这表明使用PyMYB-PybHLH在云红梨I号果皮中存在相互作用，这些结果为世界上首次为云南红梨果皮中PyMYB-PybHLH-PyWD40复合物模型调控花青素的生物合成提 供理论支持，同时表明本发明制备的PybHLH的特异性抗体专一性强，适合检测PybHLH的表达及分离PybHLH结合的蛋白和DNA分子等。
权利要求
1.云南红梨基因，其特征在于:基因具有如SEQID NO. 5所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求I所述云南红梨基因的原核表达载体pET32a-z^j^K仏其特征在于该载体含有/！/基因，基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS, T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，基因的N端和C端均带有6XHis标签。
3.权利要求2的所述的原核表达载体在制备云南红梨花青素合成及毛状体发生发育调控蛋白 APybHLH中的应用。
4.权利要求2的所述的原核表达载体在制备PybHLH特异性抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种云南红梨花青素生物合成及毛状体发生发育调控蛋白PybHLH基因的特异性片段ΔPybHLH及其原核表达载体，利用RT-PCR技术从云南红梨中克隆特异性片段ΔPybHLH，并构建其原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达，获得云南红梨ΔPybHLH纯化蛋白，云南红梨ΔPybHLH纯化蛋白应用在制备PybHLH特异性抗体中，该抗体可用于PybHLH蛋白表达检测及免疫沉淀和染色质免疫共沉淀中，该抗体特异性强，能够准确的检测PybHLH蛋白的亚细胞定位、高效的进行PybHLH蛋白的纯化、高效分离PybHLH蛋白所结合的蛋白和DNA片段及检测其在转基因植物中的表达情况。
文档编号C12N15/29GK102660553SQ20121006499
公开日2012年9月12日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者崔道雷, 张晓东, 李昆志, 樊磊, 舒群, 苏俊, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学