专利名称：一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因及其表达纯化方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。
背景技术：
蜈蚁(centipede)是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有 3300 种(Edgecombe, G.D.，Giribet, G.，Ann.Rev.Entomo1.2007.52，151-170.)。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣(以下所称蜈蚣皆为此类)为其中最凶猛的捕食性动物，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食；大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一祥，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的石开究相当薄弱(E.F.Schwartz, C.B.F.Mourao, K.G.Moreira, T.S.Camargos, M.R.Mortari,Pept Sc1.2012.98(4):385-405.)，迄今未见一例蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组表达。最新的研究掲示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon57(2011)512-524)，包括多种离子通道毒素(Yang 等，Mol Cell Proteomics.2012 ;11 (9):640-50.)，因而被学界称为“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒液中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前
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发明内容
本发明根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。具体来说，本发明提供了一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因，是序列表中SEQ ID NOl的核苷酸序列，其具体序列为:CAG GTG CTG GTT GAA GAC GAT GTCCCG TTC CCG GAA MG MG TTC GCC GAC CGT GGT GAA TGT ATC CGT GCG TGT GCT GCC AAGTTT ACC GAT GGC GAC CTG AGC AAA ATC AAA GAT GTG CTG CCG CGT TAC TAC AAG TGTGTG TGT TGG TAT TAT CCG ACC TCG TAA。同时,本发明还公开了重组蜈蚁抗昆虫毒素Scolotoxin_Ssm2.1基因突变形成至少含有64%的与SEQ ID NOl中的密码子相同的突变体基因。根据本发明的发明目 的，发明人对预测的少棘蜈蚣天然毒素Sc0l0t0Xin-Ssm2a成熟肽的55个氨基酸残基序列按大肠杆菌高表达基因简并密码子的相对使用频率作优化设计，改造了其中36个密码子(占55个密码子的65.5% )的42个位点，使改造后的Scolotoxin-Ssm2.1更适于在大肠杆菌中表达。同时根据重组克隆的需要，在该基因的末端加上限制性内切酶XhoI的识别序列,采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.1成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。进ー步地，本发明公开了ー种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，包括如下步骤:A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重组蜈蚣抗昆虫韋素 Scolotoxin_Ssm2.1 突变体基因的重组质粒 pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1 ；B，将重组质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体；D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；E，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rbcolotoxin-Ssm2a0特别地，本发明还公开了上述步骤c的具体步骤为:将重组质粒的工程菌株接种到LB培养基溶液中，当工程菌培养液浓度OD6tltl达到0.6 0.8吋，逐步加入IPTG至终浓度0.5mol/L,于18°C表达6小时,获得含有重组蜈蚁抗昆虫毒素的菌体。进ー步地，本发明还公开了所述宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
利用本发明所公开的表达纯化方法，可以获得重组蜈蚣抗昆虫毒素，根据SDS-PAGE和胶图扫描灰度分析，蛋白表达量占菌体总蛋白的24.79%。更进一歩地，本发明还公开了由重组蜈蚣抗昆虫毒素基因表达得到的重组蜈蚣抗Si虫讀素 rScolotoxin_Ssm2a0以及上述毒素rScolotoxin-Ssm2a在制备神经毒性类制剂中的应用，特别是在制备杀虫剂中的应用。利用本发明获得的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对昆虫具有强烈的神经毒性和致死作用。可用于制备神经生物学研究试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。最后，本发明还公开了所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2a中含有两对正确连接的共价ニ硫键，这一高活性重组蜈蚣抗昆虫毒素的蛋白结构形式。本发明实施中对昆虫神经毒性的活性检测采用昆虫整体活性測定法，对三种不同昆虫作腹腔注射鉴定，结果(见表1、2和图9)表明基因工程产生的重组多肽rScolotoxin-Ssm2a具有明显的昆虫神经毒性和杀虫效果。
图1少棘蜈蚁天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列测定图谱。图2重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1与天然Scolotoxin-Ssm2.1基因及其编码的氨基酸序列比对图；其中第一行为少棘蜈蚁天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列，为了方便标示，仅给出与人工设计序列不同的碱基，其余未标出部分与第二行中的碱基相同；第二行为重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.1的DNA序列；第三行为对应的重组少棘蜈蚁抗昆虫毒素Scolotoxin_Ssm2a的多肽序列。图3重组少棘蜈蚁抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin_Ssm2.1的DNA序列测定图レ曰。图4表达载体pSUMO-Mutant的物理图谱和多克隆位点示意。图5重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1的构建流程图6重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin_Ssm2.1的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳中M:分子量标记，1:重组质粒Xhol/Xbal酶切結果，2:空载质粒Xhol/Xbal酶切结果。图7经过IPTG诱导的工程菌表达融合蛋白的SDS-PAGE分析图谱图中M:分子量标记；1:未诱导菌总蛋白；2、3:诱导菌总蛋白；4:诱导菌超声沉淀；5:诱导菌超声上清。图8重组融合蛋白与目标多肽rScolotoxin_Ssm2a分离的SDS-PAGE分析图谱图中M:分子量标记；1:超声上清；2:镍柱纯化上样流出液；3:镍柱纯化洗脱液；4:酶切混合液；5:酶切液再过柱的流出液(目标肽)；6:酶切液再过柱的洗脱液(标签蛋白)。图9重组少棘蜈蚁抗昆虫神经 毒素rScolotoxin_Ssm2a对家蚬的毒性鉴定实验结果中A:10ug/ml 组，B:lug/ml 组，C:0.lug/ml 组，D:0.01ug/ml 组，E:0.0Olug/ml组，F:对照组。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进ー步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。在本实施例中，选用少棘蜈蚣的天然毒素基因作为原料。实施例1:蜈蚣毒腺总RNA的提取与少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1cDNA克隆及序列测定活体解剖分离蜈蚣毒腺并立即投入液氮中。于液氮中磨碎毒腺后，用Trizol试齐[I (Invitrogen 公司)试剂盒提取总 RNA,按 SMART cDNA Library Construction Kit 说明书操作进行cDNA第一链合成，LD-PCR扩增合成第二链，蛋白酶K消化、SfiI酶切和柱回收cDNA,与载体入TriplEx2连接、包装。带有插入片断的载体通过电转化倒入E.coliDH10B感受态细胞，SOC培养基37°C Ih IOOrpm恢复，涂于带有诱导剂IPTG和X-Gal显色剂的琼脂培养基上培养过夜。挑取白斑，PCR快速鉴定插入片断大小。检验合格的cDNA文库大规模培养，标准碱裂解法提取模板，ABI 3730测序仪测序，获得少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1cDNA序列，测序结果參见附图1。实施例组2实施例2-1重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1的构建(I)重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.1的优化与合成按照大肠杆菌的密码子偏好将少棘蜈蚁天然毒素基因Scolotoxin_Ssm2.1的cDNA序列优化，并在该基因的末端加上限制性内切酶Xho I的酶切位点，合成出全长的重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.1，其核苷酸序列与天然毒素的核苷酸序列比对參见附图2。(2)重组表达载体 pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1 的构建:将合成的Scolotoxin-Ssm2.1DNA经限制酶XhoI酶切后连接到表达载体pSUMO-Mutant中，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，测序。结果正确，说明克隆成功，得到重组表达载体质粒pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1,重组基因序列參见附图3。实施例2-2重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a的高效原核表达(I)重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的表达制备大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，将测序正确的重组表达载体pSUM0-M-Scolotoxin-Ssm2.1利用热休克法(42°C热激45秒)转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株，其构建基础及构建流程參考图4与图5，构建结果检测參见图6。挑取工程菌株单菌落接种于Kan+LB液体丰富培养基中，37°C振荡培养过夜。次日取该过夜菌按1: 100体积比接种于新鲜的Kan+LB丰富培养基中，37°C剧烈振荡放大培养至OD6tltl约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于18°C诱导表达6h。诱导结束后，4°C、
10,OOOrpm 离心 IOmin,收菌。 所得菌体用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤ー次，离心，再用预冷的LysisBuffer (50mmol/L NaH2P04，300mmol/LNaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0)以 I: 10 的比例重悬。以200W功率在冰浴下超声20min破碎细菌细胞。超声结束后，用4°C、12，OOOg离心20min，收集含重组融合蛋白的上清液。含空载质粒PSUMO-M的对照菌株BL21 (DE3)同样处理，收集含标签蛋白的上清液。SDS- PAGE电泳检测到该基因的表达产物占全菌蛋白的24.79%,电泳结果见附图7。(2)重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a的制备(2.1)重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的亲和层析采用Biologic LP层析系统对重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白进行层析。首先米用20mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl,5mmol/L imidazole,6mol/Lguanidine-HCl,, pH8.0 的缓冲液预平衡 Ni2+-1DA Sepharose CL-6B 亲和层析柱(0.8cm X 2cm)。将含重组融合蛋白的上清液以0.5ml/min流速上样至上述已经预平衡的Ni2+-1DASepharose CL-6B 亲和层析柱；用Ni2+-1DABinding Buffer(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，5mmol/Limidazole, 6mol/L guanidine-HCl,, pH8.0)以 0.5ml/min 流速洗脱，至流出液 OD28c!值到达基线，收样留以电泳，參看附图8中的第一泳道；用Ni2+-1DA Washing Buffer(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0)以0.5ml/min流速冲洗,至流出液OD28c!值到达基线,收样留以电泳,參看附图8中的
第二泳道；用Ni2+-1DA Elution Buffer(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mM imidazole,pH8.0)以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD28tl值到达基线，收样。通过上述亲和层析步骤对上述重组融合蛋白作进ー步纯化，收集，多次纯化后产品參看附图8中的第三泳道。对照样品同样处理获得纯化后的标签蛋白——SUMO蛋白。(2.2)重组少棘蜈蚁抗昆虫毒素rScolotoxin_Ssm2a的制备取上述收集的纯化后重组融合蛋白按20: 1(V/V)比例加入SUMO蛋白酶，30°C切割半小时，混合液參看附图8中第四泳道，获得目标蛋白——重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a多肽(附图8中的第五泳道)与标签SUMO蛋白的混合物(见附图8中的第六泳道)。对照样品同样处理，仅含标签SUMO蛋白。实施例3重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对鳞翅目模式昆虫家蚕的毒性鉴定基本方案:体腔注射法。本实施例中通过对鳞翅目模式昆虫家蚕幼虫的体腔注射实验鉴定由重组少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm〗.1编码的多肽rScolotoxin-Ssm2a的昆虫神经毒性。实验步骤:实验对象为鳞翅目模式昆虫家蚕多化性品种大造(由中国农业科学院蚕业研究所张国政研究员提供)的三龄幼虫，每组30头，重复3次。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin_Ssm2a多肽与SUMO标签蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin_Ssm2a的工作浓度为lug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从蚕体第8和第9腹节右侧的节间膜处注入试药IOul后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡数量，计算死亡率。结果分析:注入毒液后2-10秒，蚕体即剧烈扭转、痉挛，迅速吐液，持续数分钟后，家蚕头胸伸出、躯体收缩、肛门拖粪、腹足失去抓握力而侧翻倒地、软瘫至死。10分钟内，3个给药组的死亡率皆达100% (表I)。而注射SUMO标签蛋白的对照组家蚕仅在注射后数分钟内静伏，I小时后全部恢复正常爬动，无任何中毒症状；24小时内也无一死亡。由此可得，多肽rSC0l0t0Xin-Ssm2a对鳞翅目模式昆虫家蚕具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。表I rScolotoxin_Ssm2a对家蚕幼虫的神经毒性与致死性
权利要求
1.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因，其特征是:SEQ ID NOl的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的ー种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因，其特征是:重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因突变形成至少含有64%的与SEQ ID NOl中的密码子相同的突变体基因。
3.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，其特征是包括如下步骤: A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素 Scolotoxin_Ssm2.1 突变体基因的重组质粒 pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1; B,将重组质粒pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.1转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株； C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体； D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液； E，将上清液反复通过Ni2+-1DA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白； F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rbcolotoxin-Ssm2a0
4.根据权利要求3所述重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因的表达纯化方法，其特征是所述步骤c 的具体步骤为:将重组质粒的工程菌株接种到LB培养基溶液中，当工程菌培养液浓度OD6tltl达到0.6^0.8吋，加入IPTG至终浓度0.5mol/L,于18°C表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体。
5.根据权利要求3所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm〗.1基因的表达纯化方法，其特征是:所述宿主细胞是大肠杆菌BL21 (DE3)。
6.一种根据权利要求3至5中任意一项所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法得到的重组蜈蚁抗昆虫毒素rScolotoxin_Ssm2a。
7.组蜈蚁抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a在制备神经毒性类制剂中的应用。
8.根据权利要求7中所述的应用，特别是重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a在制备杀虫剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素rSC0l0t0Xin-Ssm2a在制备神经毒性类制剂中的应用，其特征是所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a中含有两对正确连接的共价ニ硫键。
全文摘要
本发明属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。利用本发明获得的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a对昆虫具有强烈的神经毒性和致死作用。可用于制备神经生物学研究试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。
文档编号C12N15/70GK103088030SQ20121051822
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者华卫建 申请人:江苏教育学院