作为疾病信号的同种型谱的检测的制作方法

作为疾病信号的同种型谱的检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于检测和定量包含多种不同细胞群的生物学样品中的免疫球蛋白同种型的非侵入性技术。采用测序技术执行该方法，以检测并例举异种生物学样品中的免疫球蛋白同种型谱。
【专利说明】作为疾病信号的同种型谱的检测
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35U.S.C.§ 119(e)的规定，要求2011年9月22日提交的美国临时申请号61/537，878的优先权，该申请内容通过引用全文纳入本文。

【技术领域】
[0003]本发明涉及核酸定量分析领域。更具体地，本发明提供用于检测和定量生物学样品中存在的免疫球蛋白同种型和产生作为疾病信号的特定同种型谱的非侵入性技术。
[0004]背景
[0005]免疫系统包括先天免疫系统和获得性免疫系统。先天免疫系统包括利用一般方法来识别外来病原体的细胞和机制。先天免疫中涉及的细胞包括中性白细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜碱细胞、嗜伊红细胞、肥大细胞和树突细胞。这些细胞进行吞噬作用，并释放杀灭入侵病原体的多种化学物质。此外，这些细胞还与先天免疫防御机制(包括补体级联和炎症)有关。最后，这些细胞中的一些参与在获得性免疫系统中起作用的抗原呈递过程。
[0006]获得性免疫系统经进化以攻击其靶标上的特定特征。针对特定靶标发生过某种应答，将为宿主提供关于其的“记忆”，导致其再次发生时引起更强的应答。通常，任何蛋白质或多糖都能成为所述获得性免疫应答细胞的一些亚组或其产物的靶标，所述亚组或其产物识别所述靶标上特定表位。将获得性免疫应答分为两类:体液免疫应答和细胞介导的免疫应答，B细胞和T细胞分别在这些应答中起着特定作用。
[0007]由于自体免疫疾病涉及获得性免疫系统的一些元件对自身靶标的识别，已验证获得性免疫系统的一些方面以协助诊断和预后。已采用标准免疫学技术，通过寻找循环自身抗体来研究体液免疫系统。已鉴定针对若干疾病的自身抗体，例如抗核抗体、抗dsDNA抗体和类风湿因子。这些抗体可能本身不是病理性的，并且其在身体中识别的靶标也不必然同于体外测试的靶标；但是，对其水平的检测协助诊断，并且在一些情况下具有一些预后和治疗指示。
[0008]研究自体免疫疾病中的获得性免疫系统的其它方法基于对获得性免疫细胞的多样性分析。获得性免疫细胞的激活导致其克隆扩张。该克隆扩张的证据通常通过从血液RNA或DNA扩增编码所述抗原识别区域的部分核酸序列来获得。例如，用以扩增具有T细胞受体中β链的特定V区段(类似于抗体重链)的序列的PCR引物被用于扩增连接至该特定V区段的J区段或J和D区段。当存在不同细胞群时，希望扩增具有扩增子大小略不同的分布的片段，但克隆扩张导致特定大小被富集，并因而导致凝胶上呈现更强的条带。在称作谱型分析的技术中，扩增带有J和D区段的各V区段，以评估这些扩增子中是否显示克隆扩张。
[0009]谱型分析法的一个问题是，多种不同序列可能具有相同长度并因此无法区分。因此，通过该技术仅能辨别明显的克隆扩张。需要用于自体免疫疾病和自体免疫疾病状态以及免疫系统起中心作用的其它疾病的诊断和预后协助的改进方法。免疫系统的广泛多样性使其具有潜在有用细胞的极大储备，但也显示出对于尝试采用该库以达推测目的的研究者的挑战。靶向抗原的任何单一序列均是可能涉及和/或关联指定个体中疾病过程的为数众多的序列之一。能够鉴定给定个体的多种细胞中有哪些涉及疾病过程的方法对人类健康而言将极具价值。
[0010]概述
[0011]本发明涉及用于监测免疫库和分析免疫系统概况的方法。与先前描述的明确需要特定免疫细胞群(例如，T细胞或B细胞)和对个体细胞和/或源自此类细胞的个体核酸分子的空间分离的方法不同，本发明方法采用异种细胞群及其衍生的异种核酸混合物来进行。
[0012]一方面，本发明提供测定全血样品中免疫球蛋白同种型的方法，所述方法通过如下方式进行:从获自对象的包含多种细胞类型的生物学样品分离多种核酸，并检测所述多种核酸中免疫球蛋白的恒定区特异的序列；由此测定免疫球蛋白同种型。
[0013]所述方法通常涉及如下步骤:从来自对象的包含多种不同细胞类型的生物学样品获得核酸，从所述生物学样品分离核酸，检测免疫球蛋白的一个或多个区域特异的序列，和测定序列的不同水平以产生免疫球蛋白同种型谱。
[0014]具有多种不同细胞类型的生物学样品包括但不限于:血液、血液成分、唾液、痰、尿、精液、阴道液体、脑脊髓液、粪、细胞和组织活检物。在优选实施方式中，所述样品是全血且样品小于100 μ Lo
[0015]分离自此类生物学样品的核酸可以是DNA(例如，cDNA)或RNA。在某些实施方式中，经分离的核酸是总RNA。在某些实施方式中，经分离的核酸是由总RNA生成的cDNA。在一些实施方式中，采用免疫球蛋白的一个或多个区域(例如免疫球蛋白VDJ区和/或Ig恒定区)特异的多种引物扩增cDNA。
[0016]所述检测步骤可采用杂交捕获或测序技术进行。本发明方法中可用的测序技术的示例包括但不限于:合成测序技术，例如大规模平行测序、单分子测序、True单分子测序、焦磷酸测序等。可用于本发明方法的合适的测序平台包括但不限于=True单分子测序(tSMS?)技术，例如螺旋公司(Helicos Inc)提供的HeliScope?测序仪，单分子实时(SMRT?)技术，例如太平洋生物科学公司(Pacific B1sciences)提供的PacB1RSV F系统，大规模平行测序技术，例如牛米纳公司(niumina，Inc.)提供的HiSEQ11^PMiSEQ?系统，氧化铝公司(Alumina, Inc.)提供的Solexa?测序仪，生命技术公司(LifeTechnologies, Inc.)提供的SOLiD?测序系统,和生命技术公司提供的1n Torrent系统。
[0017]在【具体实施方式】中，本发明提供采用测序技术对直接来自外周全血或其成份衍生的核酸的免疫球蛋白同种型测序以分析免疫系统概况的方法。在其它【具体实施方式】中，通过对外周血单核细胞衍生的核酸直接测序获得免疫球蛋白同种型谱。如本文所用，术语“外周全血”指其中诸如血红细胞、血白细胞、血浆或血小板的组分未经去除的血液，而术语“外周血单核细胞”或“PBMC”指具有圆细胞核的血细胞混合物，且包括淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。
[0018]通过本发明的方法产生的免疫系统的谱可用于诊断疾病和病症，和用于诊断疾病和病症的状态。本发明的方法可用于监测疾病和病症，和评估对疾病和病症的治疗。本发明方法可应用的疾病和病症包括自体免疫疾病，包括系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)和强直性脊柱炎。本发明的方法还可应用于诊断、监测和治疗移植物排斥和免疫老化(immune aging)。此外,本发明的用于免疫概况分析的方法可用于诊断、监测和治疗于免疫系统相关的其它疾病，包括癌症和传染病。
[0019]附图简要说明
[0020]图1显示的饼图说明在三个不同测序运行中获得的三个样品(#1、#2和#3)的同种型分布图。
[0021]发明详述
[0022]本文所述的方法和材料应用测序技术用于分析获自对象的生物学样品中的免疫受体基因群和免疫球蛋白同种型分布。免疫受体基因群的测序提供特定和详细的分子表征以及对感兴趣的序列检测的高灵敏度，以协助疾病诊断和监测。
[0023]用于采用微芯片阵列(例如，ImmunArray)免疫库概况分析的方法或测序技术已经描述。
[0024]然而，此类基于序列的方法需要分离特定的免疫细胞(例如，T细胞或B细胞)群，并将此类细胞空间分离成个体细胞和/或源自此类细胞的个体核酸分子以形成克隆(参见，例如US2010/0151471)。相反，本发明提供的用于免疫球蛋白同种型谱分析的方法采用敏感的、高通量的测序技术对来自异种细胞群衍生的异种核酸混合物的免疫球蛋白同种型直接测序。在本发明之前，从未实现对异种细胞群及其衍生的异种核酸混合物的“噪音”或“背景”中的特定免疫球蛋白同种型进行检测和定量。具体而言，可测定很小样品大小(例如一滴血)的同种型。因此，本发明方法与常规方法的不同之处在于，本方法是非侵入性的，并且不需要受过训练的抽血医师从患者抽血。此外，与常规方法不同，本发明方法不需要血液分级分离。本发明方法通常涉及如下步骤:从对象获得外周全血样品，从所述外周全血样品或其分级分离部分(例如，外周血单核细胞)分离RNA，采用靶标特异性引物使所述经分离的RNA逆转录，以产生免疫球蛋白cDNA转录本，采用多重PCR技术扩增免疫球蛋白VDJ至Ig恒定区，对扩增子测序，以及分析序列数据。数据分析包括如下步骤:提取各同种型的Ig恒定区序列，并比较给定样品的全部Ig同种型序列的总数。
[0025]通过对源自外周血的细胞(例如，外周血细胞，或外周血单核细胞)制样来监测健康者和患病者的免疫库能够在免疫球蛋白同种型水平揭示疾病信号。通过比较通过对源自外周血的经扩增cDNA测序显示的各同种型的量，能够检测水平从而区分患病个体和健康个体。
[0026]对象
[0027]本发明方法采用来自对象或个体的生物学样品。对象可以是患者，例如，患有自体免疫疾病、传染病或癌症的患者，或移植受者。对象可以是人或非人哺乳动物。对象可以是任何年龄(例如，胎儿、婴儿、儿童或成人)的男性或女性对象。
[0028]样品
[0029]本发明方法采用的样品可包括，例如，来自对象的体液，包括围绕胎儿的羊水、水状体、胆汁、血液和血浆、耳垢(耳蜡)、考珀液或射精前分泌物、乳糜、食糜、女性喷射物、间质液、淋巴、经液、母乳、黏液(包括鼻涕和痰)、胸膜液、脓、唾液、皮脂(皮油)、精液、血清、汗液、泪液、尿、阴道分泌物、呕吐物、粪、体内液体包括围绕脑的脑脊髓液、围绕骨关节的滑液、胞内液(细胞内的液体)和玻璃状液(眼球内的液体)。
[0030]在一个实施方式中，所述样品是血液样品，例如外周全血样品或其分级分离部分。优选地，所述样品是未经分离分级的全血。
[0031]所述血液样品可以是约0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2、
0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 或 5.0mL。优选地，所述样品是100 μ L或更少。最优选地,所述样品是50 μ L或更少。
[0032]在某些实施方式中，所述样品是脑脊液(CSF)(例如，当对象患有多发性硬化时)、滑液(例如，当对象患有类风湿性关节炎时)，或皮肤(或其它器官)活检物(例如，当对象患有系统性红斑狼疮时)。
[0033]不希望受任何理论限制，免疫球蛋白同种型可由最可能反映病理学的可获得的体液/组织来鉴定，随后从不同体液(例如，血液)监测同种型水平和具体疾病的克隆型信号。
[0034]在疾病停止或发病时均可根据本发明方法分析样品，以协助鉴定与特定疾病相关联的克隆型信号。
[0035]所述样品可由健康护理提供者获得，例如，医师、医师助理、护士、兽医、皮肤学家、风湿病学家、牙医、军医或外科医生。所述样品可由研究技术人员获得。可从对象获得多于一个样品。
[0036]所述样品可以是活检物，例如，皮肤活检物。所述活检物可来自，例如，脑、肝、肺、心、结肠、肾或骨髓。可采用本领域技术人员所用的任何活检技术来从对象分离样品。例如，活检可以是开放式活检，其中采用全身麻醉。活检可以是封闭式活检，其中采取比开放式活检中规模较小的切割。所述活检可以是核心活检或切入式活检，其中移出组织的部分。所述活检可以是切除式活检，其中尝试移出完整损害。所述活检可以是细针吸活检，其中组织或液体样品用针移出。
[0037]所述样品可包括免疫细胞。所述免疫细胞可包括T细胞和/或IB-细胞。T细胞(Τ淋巴细胞)包括，例如，表达T细胞受体的细胞。T细胞包括辅助T细胞(效应物T细胞或Th细胞)、细胞毒T细胞(CTL)、记忆T细胞和调节性T细胞。在一些应用中(例如，用于确定相关T细胞的校准试验)，所述样品可包括单一细胞，或者更一般地包括至少1，000个、至少10，000个、至少100，000个、至少250，000个、至少500，000个、至少750，000个或至少1，000，000个T细胞。
[0038]B细胞包括，例如，血浆B细胞、记忆B细胞、BI细胞、Β2细胞、边缘区B细胞和滤泡B细胞。B细胞能表达免疫球蛋白(抗体、B细胞受体)。在一些应用中(例如，用于确定相关B细胞的校准试验)，所述样品可包括单一细胞，或者更一般地包括至少1，000个、至少10，000个、至少100，000个、至少250，000个、至少500，000个、至少750，000个或至少1,000，000 个 B 细胞。
[0039]所述样品可包含核酸，例如，DNA(例如，染色体DNA或线粒体DNA)或RNA(例如，信使RNA或微小RNA)。所述核酸可以是无细胞DNA或RNA。本发明方法中，来自对象的可分析的RNA或DNA的量包括，例如，在一些应用(例如，校准试验)中，低至单一细胞，且多至I千万个细胞或更多，经转换即为6pg?60 μ g DNA,和约Ipg?10 μ g RNA。
[0040]扩增反应
[0041]可采用聚合酶链式反应(PCR)来扩增细胞收集物中的有关区域。可采用转录介导的扩增(TMA)来从靶核酸产生RNA扩增子。可分开分析(例如，通过测序分析)来自各细胞的核酸，因为各细胞将携带其自身独特的免疫球蛋白同种型信息。
[0042]在一些实施方式中，采用多重PCR从异种核酸扩增免疫球蛋白序列的VDJ至Ig恒定区。
[0043]在一些实施方式中，在多重反应中采用退火至C区的至少一个引物和可退火至一个或多个V区段的一个或多个引物从异种核酸扩增免疫球蛋白序列。在多重反应中，退火至V区段的引物的数目可以是，例如，10?60、20?50、30?50、40?50、20?40、30?40或35?40。所述引物可退火至不同V区段。就IgH基因而言，因为V区段中可能的体细胞突变，可采用退火至各V区段的多重引物，例如，1、2、3、4或5个引物/V区段。在多重反应中，退火至丫区段的引物的数目可包括，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。多重反应中，退火至C区段的引物的数目可以是I?10、2?9、3?8、4?7、3?8或3?6。
[0044]在一些实施方式中，待扩增的区域包括全长克隆序列或克隆序列的子集，包括免疫球蛋白或T细胞受体基因的V-D接合处、D-J接合处，免疫球蛋白或T细胞受体基因的全长可变区、抗原识别区或CDR(例如，互补决定区3(CDR3))。
[0045]在一些实施方式中，采用一级和二级扩增步骤扩增免疫球蛋白序列。不同扩增步骤各自可包括不同引物。所述不同引物可引入免疫基因序列中原始不存在的序列。例如，扩增程序可添加一个或多个标签至经扩增免疫球蛋白序列的5'和/或3'端。所述标签可以是便于经扩增DNA的后续测序的序列。所述标签可以是便于使经扩增序列结合至固体支持物的序列。所述标签可以是便于鉴别经扩增免疫球蛋白序列的条形码或标记物。
[0046]用于扩增的其它方法可在V区内不采用任何引物。或者，可从C区段采用特异性引物，并在另一侧(5')设置通用引物。可在通过不同方法(包括详细描述的链转换方法)的cDNA合成中附加通用引物。类似地，可在通过不同方法(包括连接)制备cDNA之后附加通用引物。
[0047]扩增可用于本发明方法的核酸的其它方法包括，例如，逆转录-PCR、实时PCR、定量实时PCR、数字PCR (dPCR)、数字乳液PCR (dePCR)、克隆PCR、扩增片段长度多态性PCR(AFLP PCR)、等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR(其中采用针对选定链的大幅过量的引物)、集落PCR、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动PCR、反向PCR(IPCR)、原位PCR、长PCR(DNA延伸超过约5千碱基)、多重PCR、巢式PCR(采用多于一个引物对)、单细胞PCR、降落PCR、环介导的等温PCR(LAMP)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其它扩增方案包括:连接酶链式反应、分支DNA扩增、滚环扩增、环-环扩增、SPIA扩增、通过捕获和连接(TACL)扩增的靶标扩增，和RACE扩增。
[0048]可通过采用反转录，运用本领域普通技术人员熟知的技术，将样品中RNA的中信息转变成 cDNA(参见，例如，Sambrook, Fritsch 和 Maniatis, MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(《分子克隆:实验室手册》)，第二版(1989))。可在反转录反应中采用多聚A引物、随机引物和/或基因特异性引物。
[0049]可用于本发明方法中的扩增的聚合酶包括，例如，Taq聚合酶、AccuPrime聚合酶或Pfu。可根据保真度和效率是否优选来选择待用的聚合酶。
[0050]在从基因组扩增DNA之后(或通过反转录RNA扩增cDNA形式的核酸之后)，直接对扩增子测序。
[0051]测序
[0052]本领域技术人员已知的用于对核酸测序的任何技术均可用于本发明方法。DNA测序技术包括:采用经标记的终止子或引物以及平板或毛细管中的凝胶分离的经典双脱氧测序反应(桑格法)、采用可逆终止的经标记核苷酸的合成测序法、焦磷酸测序、454测序、针对经标记寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交、采用针对经标记克隆文库的等位基因特异性杂交随后连接的合成测序法、在聚合步骤过程中对经标记的核苷酸掺入的实时监测，以及SOLiD测序。
[0053]在某些实施方式中，本发明方法中可用的测序技术产生至少100个读数/运行、至少200个读数/运行、至少300个读数/运行、至少400个读数/运行、至少500个读数/运行、至少600个读数/运行、至少700个读数/运行、至少800个读数/运行、至少900个读数/运行、至少1000个读数/运行、至少5，000个读数/运行、至少10，000个读数/运行、至少50，000个读数/运行、至少100，000个读数/运行、至少500，000个读数/运行、至少1，000, 000个读数/运行、至少2，000, 000个读数/运行、至少3，000, 000个读数/运行、至少4，000, 000读数读数/运行、至少5000，000读数/运行、至少6，000, 000读数/运行、至少7，000, 000读数/运行、至少8，000, 000读数/运行、至少9，000, 000个读数/运行或至少10，000, 000读数/运行。
[0054]在一些实施方式中，测序读数/制样B细胞的数目应该是制样B细胞数目的至少2倍、制样B细胞数目的至少3倍、制样B细胞数目的至少5倍、制样B细胞数目的至少6倍、制样B细胞数目的至少7倍、制样B细胞数目的至少8倍、制样B细胞数目的至少9倍，或制样B细胞数目的至少10倍，但不限于5x (更少或更多均可以足够)。如此，例如I百万到I千万个读数/样品，等。测序深度允许使制样的B细胞精确平均化，便于误差校正并确保对于所述文库的测序已经饱和。
[0055]在某些实施方式中，本发明方法中可用的测序技术每次读数可产生约30bp、约40bp、约 50bp、约 60bp、约 70bp、约 80bp、约 90bp、约 10bp、约 I1bp、约 120bp,每次读数约 150bp、约 200bp、约 250bp、约 300bp、约 350bp、约 400bp、约 450bp、约 500bp、约 550bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp或约1，OOObp。例如,本发明方法所用的测序技术每次读数可产生至少 30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 I, 000。
[0056]True单分子测序
[0057]可用于本发明方法的测序技术包括，例如，Helicos True单分子测序(tSMS)(Harris T.D.等.(2008) Science320:106-109)。在 tSMS 技术中，将 DNA 样品切割成约100?200个核苷酸的链，然后向各DNA链的3'端添加多聚A序列。各链通过添加经荧光标记的腺嘌呤核苷酸来标记。然后使所述DNA链杂交至流动室，所述流动槽包含固定在流动室表面的数百万个寡T捕获位点。所述模板的密度可以是约I亿模板/cm2。然后，将所述流动室装载至仪器(例如，HeliScope?测序仪)中，并用激光照射所述流动室表面，揭示各模板的位置。CCD照相机可绘制所述流动室表面的模板位置。然后，切割并洗去所述模板荧光标记物。所述测序反应由引入DNA聚合酶和经荧光标记的核苷酸开始。所述寡T核酸作为引物。所述聚合酶以模板定向的方式将经标记的核苷酸纳入引物。去除所述聚合酶和未纳入的核苷酸。通过对所述流动室表面成像来检测已定向纳入经荧光标记的核苷酸的模板。成像后，切割步骤去除荧光标记物，并用其它经荧光标记的核苷酸重复该过程直至达到所需读数长度。采用各核苷酸添加步骤收集序列信息。
[0058]454 测序
[0059]可用于本发明方法的DNA测序技术的另一个示例是454测序(罗氏(Roche))(Margulies, M 等.2005, Nature, 437, 376-380)。454 测序涉及两个步骤。第一步骤中，将DNA剪切成约300?800碱基对的片段，并使所述片段具有钝端。然后，使寡核苷酸衔接子连接至所述片段末端。所述衔接子起扩增和片段测序用引物的作用。可采用例如衔接子B (Adaptor B，其包含5,-生物素标签)使所述片段连接至DNA捕获珠(例如，链霉亲和素被覆的珠)。使连接至所述珠的片段在油-水乳液液滴中进行PCR扩增。所得结果是各珠上克隆扩张的DNA片段的多重拷贝。在第二步骤中，使所述珠在孔(皮升(pico-liter)级大小)中被捕获。在各DNA片段上平行进行焦磷酸测序。添加一个或多个核苷酸产生光信号，所述光信号由测序仪器内CCD照相机记录。所述信号强度与纳入的核苷酸数目成比例。
[0060]焦磷酸测序利用在添加核苷酸后释放的焦磷酸盐(PPi)。PPi在腺嘌呤5'磷酰硫酸存在下通过ATP硫酸化酶转变成ATP。荧光素酶利用ATP将荧光素转变成氧化萤光素，而该反应产生光，检测并分析所述光。
[0061]基因组测序仪FLX?
[0062]本发明方法中可用的DNA测序技术的另一个示例是基因组测序仪FLX系统(罗氏(Roche)/454)。所述基因组测序FLX系统(例如，GS FLX/FLX+，GS初级)提供多于I百万高质量读数/运行，且读数长度为400个碱基。这些系统是理想上适合于对全基因组和任何大小的转录组进行从头测序，对复合样品的宏基因组表征或重测序研究。
[0063]SOLiD? 测序
[0064]本发明方法中可用的DNA测序技术的另一个示例是SOLiD技术(生命技术公司(Life Technologies, Inc.))。在SOLiD测序中，基因组DNA被剪切成片段，并且使衔接子连接至所述片段的5'和3'端以生成片段文库。或者，可通过如下方式引入内部衔接子:将衔接子连接至所述片段的5'和3'端，使所述片段环化，消化所述环化的片段以产生内部衔接子，并使衔接子连接至所得片段的5'和3'端以产生伴侣配对的文库。接着，在包含珠、引物、模板和PCR组分的微型反应器中制备克隆珠的群。PCR后，使所述模板变性，并且富集所述珠以分离带有延伸的模板的珠。对选定珠上的模板进行3,修饰，该修饰允许结合至载玻片。
[0065]可通过依次使部分随机寡核苷酸与中央确定碱基(或碱基对)杂交和连接来测定序列，所述中央确定碱基(或碱基对)通过特异性荧光团来鉴定。在记录颜色之后，所述连接的寡核苷酸被切割并去除，然后重复该过程。
[0066]1n Torrent? 测序
[0067]本发明方法中可用的DNA测序技术的另一个示例是1nTorrent系统(生命技术公司(Life Technologies, Inc.))。1n Torrent采用高密度的微型机械加工的孔阵列以大规模平行的方式进行该生化过程。各孔含有不同的DNA模板。所述孔下是离子敏感层，且该层下是专有的离子(1n)传感器。如果核苷酸(例如C)添加至DNA模板并且随后纳入DNA链，则氢离子将被释放。所述离子的电荷将改变溶液的pH，这可由专有的离子传感器来检测。测序仪将判定(call)碱基，直接将化学信息变成数字信息。然后，离子个人基因组仪器(1n Personal Genome Machine) (PGM?)测序仪用一个接一个的核苷酸依次注满所述芯片。如果注入所述芯片的下一个核苷酸不匹配，则不会记录电压变化也不会判定碱基。如果在所述DNA链上有两个相同的碱基，则该电压会加倍，并且所述芯片会记录判定的两个相同碱基。由于这是直接检测(即没有扫描、照相机或光照的检测)，因此以秒记录各核苷酸纳入。
[0068]HiSeq? 和 MiSeq? 测序
[0069]本发明方法中可用的测序技术的另一个示例包括来自亿明达公司(IIlumina, Inc.)的 HiSEQ? 系统(例如，HiSEQ2000? 和 HiSEQ100?)和 MiSEQ? 系统。所述HiSEQ?系统基于针对数百万个片段的大规模平行测序，所述测序采用将随机片段化的基因组DNA连接至光学透明的平表面并固相扩增以生成含数百万个簇的高密度测序流动室，其各包含约1，000个模板拷贝/cm2。采用四色DNA合成测序技术对这些模板测序。所述MiSEQ?系统采用TruSeq，亿明达(Illumina)公司的基于可逆终止子的合成测序。SOLEXA?测序
[0070]本发明方法中可用的测序技术的另一个示例是SOLEXA测序(亿明达)。SOLEXA测序是基于固体表面上的DNA扩增，采用折回(f ο I d-back) PCR和锚定引物进行。使基因组DNA片段化，并且向所述片段的5'和3'端添加衔接子。使连接至流动室通道表面的DNA片段进行延伸和桥扩增。所述片段变成双链，并且使所述双链分子变性。多轮固相扩增，然后变性，可在流动室的各通道内产生相同模板的单链DNA分子的约1，000个拷贝的数百万个簇。采用引物、DNA聚合酶和经四种荧光团标记的，可逆终止的核苷酸来进行顺序测序。纳入核苷酸后，采用激光来激发所述荧光团，然后捕获图像，并记录第一个碱基的鉴定信息。将来自各纳入碱基的3'终止子和荧光团去除，并重复所述纳入、检测和鉴定步骤。
[0071]SMRT? 测序
[0072]本发明方法可用的测序技术的另一个示例包括太平洋生物科学公司(PacificB1sciences)的单分子、实时(SMRT?)技术。在SMRT?中，使四种DNA碱基各自连接至四种不同的荧光染料之一。这些染料是磷连接的。单一 DNA聚合酶用单一单链DNA模板分子固定在零模式波导(ZMW)的底部。ZMW是使单核苷酸的纳入能够被观察到的封闭结构，通过针对在所述ZMW内外快速(以微秒计)扩散的荧光核苷酸背景的DNA聚合酶来进行所述观察。需要数毫秒来将核苷酸纳入生长中的链。在该时程中，所述荧光标记物被激发并产生荧光信号，而所述荧光标签被切割掉。检测所述染料的对应荧光指示纳入了哪个碱基。重复所述过程。
[0073]纳米孔测序
[0074]本发明方法中可用的测序技术的另一个示例是纳米孔测序(Soni G V和MellerA.(2007)Clin Chem53:1996-2001)。纳米孔是直径在I纳米级别的小洞。将纳米孔浸入传导液并穿过该液体施加电压导致轻微电流，这归因于通过所述纳米孔的离子传导。流过的电流量对纳米孔的大小敏感。由于DNA分子穿过纳米孔，所述DNA分子上的各核苷酸不同程度地阻塞所述纳米孔。因此，DNA分子穿过纳米孔时通过纳米孔的电流变化代表对DNA测序的读数。
[0075]化学敏感性的场效应晶体管阵列测序本发明方法中可用的测序技术的另一个示例涉及采用化学敏感性的场效应晶体管(chemFET)阵列来对DNA测序(例如，如美国专利申请
【发明者】M·U·赫钦斯, D·赛里格森 申请人:林纳格生物科学股份有限公司