一种芒、粒长及每穗粒数的调控基因及其应用的制作方法

一种芒、粒长及每穗粒数的调控基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种芒、粒长及每穗粒数的调控基因及其应用。首次揭示通过在禾谷类作物中定向调控An-1基因表达水平，可显著调节作物的产量、芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结构等重要的性状，进而达到改良禾谷类作物、增加产量等目的。
【专利说明】-种芒、粒长及每穗粒数的调控基因及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种芒、粒长及每穗粒 数的调控基因及其应用。

【背景技术】
[0002] 随着全球耕地面积的逐年减少，农作物的产量难以维持人类的发展。虽然粮食作 物的亩产在增加，但总产量难以维持增势。根据联合国粮农组织发布的报告，全球面临较大 的粮食危机。一些主要粮食作物的品种改良显得极为迫切。
[0003] 水稻是全世界一半以上人口的主要粮食作物。亚洲栽培稻（Oryza sativa L.)主 要分为籼稻（Oryza sativa L. ssp. Indica)和粳稻（Oryza sativa L. ssp. Japonica)两个 亚种。就其起源，研究显示亚洲栽培稻可能是由普通野生稻（Oryza rufipogon GrifT.)经 过驯化而来的。在人工选择的作用下，与野生稻相比，栽培稻的性状发生了明显的变化，这 些变化使得栽培稻更加适合早期的农业种植，为人类提供了可靠的食物来源。如落粒性的 降低，直立生长，枝梗数目和小穗数目的增加，种子附属物芒的退化消失，甚至种子壳色和 果皮颜色都发生了变化。因此人工驯化基因的克隆，不仅让本发明人逐步了解人工选择的 机制和栽培稻性状的起源，也为新一代分子育种提供性状改良的分子调控信息。
[0004] 人工驯化基因一般是通过图位克隆技术完成的，即通过野生祖先种和栽培种杂 交，利用杂交后代对数量性状（Quantitative Irait Locus, QTL)进行遗传作图分析，同 时制备高世代回交材料将QTL位点分离为孟德尔遗传的单因子，再进行精细定位和基因克 隆。目前水稻中已有多个与驯化相关的基因被克隆，比如控制落粒的基因 qSHl、SH4,控制 分蘖角度的基因 PR0G1，控制红色米皮的基因 Rc，控制黑色颖壳的基因 Bh4、控制粒宽的基 因 qSW5和控制糯质的基因 Wx。对驯化基因的研究显示性状变化的分子机制十分复杂。有 些基因的自然突变直接破坏基因功能从而使表型发生变化，如PR〇Gl、Bh4、Rc。有些基因则 是通过蛋白质修饰或者调控变化来改变表型，如qSHl在5'调控区的一个SNP变化导致离 层的缺失，SH4在编码区的一个SNP变化引起单氨基酸替换使落粒性降低。栽培稻分为粳 稻和籼稻加大了水稻驯化的复杂性，最近的研究表明SH4、PR0G1、qSW5、Bh4的等位变异在 粳稻和籼稻中固定下来，Rc和Wx只在粳稻群体中固定。
[0005] 野生稻的种子普遍具有长芒，芒在种子传播和防止鸟兽食用起着重要的作用；但 是具芒的种子不易收获和储存，芒在人工选择中逐渐退化丧失，致使大部分栽培稻无芒。很 多禾谷类作物种子都有芒，如大麦、小麦、燕麦、黑麦和水稻等，芒是这些植物穗部的一个重 要组成部分。在小麦中，芒是重要的光合器官之一，其同化产物直接运往所着生的小穗，特 别是在灌浆后期对籽粒充实起重要的作用，从农业生产上看，小麦的有芒品系普遍具有较 高的产量，芒在小麦中的增产作用使其在漫长的作物驯化过程中被保留下来。与小麦相比， 水稻的芒在从野生稻驯化到栽培稻的过程中慢慢退化，因而现在的大部分栽培稻是无芒或 短芒品种。
[0006] 长期的QTL研究显示野生稻的芒是由多基因控制的，且易受到环境因素影响，控 制芒的QTL分布在多条染色体上，但目前尚未见相关基因克隆和功能研究的详细报道。


【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供一种芒、粒长及每穗粒数的调控基因及其应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种调控禾谷类作物农艺性状和/或产量性状的方 法，所述方法包括：调节禾谷类作物中An-I基因的表达。
[0009] 在一个优选例中，所述的禾谷类作物是禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物是 水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦；和/或
[0010] 所述的农艺性状包括：芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结构（如枝梗数）。
[0011] 在另一优选例中，所述的An-ι基因编码：
[0012] (a)如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽（An-Ι多肽）；
[0013] (b)将SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较 佳地1-10 ;更佳地1-5个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽功能 的由（a)衍生的多肽；或
[0014] (c)与（a)限定的多肽序列有80%(较佳地90% ;更佳地95% ;更佳地98%)以上同 源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽。
[0015] 在另一优选例中，所述的An-I基因具有SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3所示的核苷 酸序列或其简并的序列。
[0016] 在另一优选例中，所述调控禾谷类作物农艺性状和/或产量性状的方法包括：降 低禾谷类作物中An-I的表达；从而：增加产量；降低粒长；增加每穗种子颗粒数；增加每穗 枝梗数；缩短种子的芒长；和/或减少种子的有芒率。
[0017] 在另一优选例中，所述降低禾谷类作物中An-I基因的表达包括：
[0018] 将下调An-I基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入禾谷类作物中；较佳 地，所述的下调剂是特异性干扰An-I基因转录的干扰分子。
[0019] 在另一优选例中，所述的干扰分子是以An-I基因或其转录本为抑制或沉默靶标 的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA,或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰 RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3 (较佳 地，针对SEQ ID N0:1或3序列的3'UTR的一部分（SEQ ID N0:5))作为沉默靶标的dsRNA 或构建物。
[0020] 在另一优选例中，所述的干扰分子是构建物，含有式（I)所示的结构：
[0021] Seq正向-X-Seq反向 式⑴，
[0022] 式⑴中，SeqttS SEQ ID N0:5所示的多核苷酸，Seq反向为与Seqtt互补的多核 苷酸；
[0023] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向 不互补。
[0024] 在另一优选例中，所述降低禾谷类作物中An-I基因的表达的方法包括：
[0025] (i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：
[0026] (a)含有反方向启动的An-I基因或基因片段（反义分子）的载体；
[0027] (b)含有可在植物体内形成特异性干扰An-I基因表达（或转录）的成分的干扰分 子（如式⑴构建物）的载体；
[0028] (ii)将植物的组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物 组织或器官。
[0029] 较佳地，所述降低禾谷类作物中An-I基因的表达的方法还包括：
[0030] (iii)选择出转入了所述载体的植物组织或器官；和
[0031] (iv)将步骤（iii)中的植物组织或器官再生成植物。
[0032] 在另一优选例中，所述调控禾谷类作物农艺性状和/或产量性状的方法包括：提 高禾谷类作物中An-I基因的表达，从而：增加种子的粒长；减少每穗种子颗粒数；减少每穗 枝梗数；增加种子的芒长；和/或增加种子的有芒率。
[0033] 在另一优选例中，所述提高禾谷类作物中An-I基因的表达包括：将An-I基因转入 禾谷类作物，获得转化的禾谷类作物。
[0034] 在另一优选例中，所述提高禾谷类作物中An-I基因表达的方法包括：
[0035] (SI)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有An-I基因；
[0036] (S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤（SI)中的农杆菌接触，从而使所述的多 核苷酸转入植物组织、器官或种子。
[0037] 较佳地，所述提高禾谷类作物中An-I基因表达的方法还包括：
[0038] (S3)选择出转入了所述的An-I基因的植物组织、器官或种子；和
[0039] (S4)将步骤（S3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。
[0040] 在本发明的另一方面，提供一种An-I基因的用途，用于调控禾谷类作物农艺性状 或产量性状；所述的农艺性状包括：芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结构（如枝梗 数）。
[0041] 在本发明的另一方面，提供一种An-I基因的用途，用于作为鉴定禾谷类作物农艺 性状或产量性状的分子标记；所述的农艺性状包括：芒性状、种子形态或饱满度性状、种子 数量性状、穗型结构（如枝梗数）。
[0042] 在本发明的另一方面，提供一种降低An-I基因表达的物质，所述物质含有式（I) 所示的结构：
[0043] Seq正向-X-Seq反向 式⑴，
[0044] 式⑴中，SeqttS SEQ ID N0:5所示的多核苷酸，Seq反向为与Seqtt互补的多核 苷酸；和
[0045] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向 不互补。
[0046] 在本发明的另一方面，提供一种降低An-I基因表达的物质的用途，用于调控植物 农艺性状或产量性状；包括：增加产量；降低粒长；增加每穗种子颗粒数；增加每穗枝梗数； 缩短种子的芒长；和/或减少种子的有芒率。
[0047] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

【专利附图】

【附图说明】
[0048] 图UAn-I的克隆及功能验证。
[0049] (A)SL4/GLA4/CSSL-Z3 的穗型比较（Bar = 10mm)。
[0050] (B)SL4/GLA4/CSSL-Z3 的芒长比较（Bar = 10mm)。
[0051] (C)SL4中第4号染色体芒QTL定位，An-I位于M6298和M6285之间，An-2位于 Ml 108 和 Ml 160 之间。
[0052] (D)An-I精细定位，最后定在FM3和FM6之间约70Kb的区域，对应于两个日本晴 BAC和一个W1943的BAC。FM1-9代表精细定位的分子标记，箭头显示基因方向。
[0053] (E)在FM3和FM6之间W1943和日本晴序列比较及基因注释比较。黑色代表基因 组片段，灰色代表共线性区域，红色代表转座子或重复序列，绿色代表正向预测基因，蓝色 代表反向预测基因。
[0054] (F)An-I基因结构和用于功能分析的质粒。pCPL代表An-I互补质粒，pOX代表 An-I过表达质粒，pRNAi代表An-I-RNAi质粒。
[0055] 图2、An-I转录激活活性和核定位。
[0056] ㈧酵母激活系统中An-I蛋白转录激活活性。
[0057] (B)An-I-GFP 定位在核中。
[0058] (C)对照35S-GFP定位在核中和细胞膜上。
[0059] 图3、栽培稻和野生稻中三种典型的单倍型
[0060] ⑷粳稻中主要单倍型an-1 (Tn+)。
[0061] (B)籼稻中主要单倍型an-1 (G-)。
[0062] (C)野生稻中主要单倍型An-1。
[0063] 图4、芒长比较。
[0064] (A) GLA4和NIL-An-I的一次枝梗顶粒照片。
[0065] (B)日本晴、互补CPL和过表达OX的一次枝梗顶粒照片。
[0066] (C) Kasalath和RNAi-6的一次枝梗顶粒照片。
[0067] (D) GLA4和NIL-An-I的一次枝梗顶粒芒长比较。
[0068] (E)日本晴、互补CPL和过表达OX的一次枝梗顶粒芒长比较。
[0069] (F) Kasalath和RNAi的一次枝梗顶粒芒长比较（Bar = 10mm)。
[0070] 图5、粒长比较。
[0071] (A) GLA4 和 NIL-An-I 的 10 粒种子照片。
[0072] (B)日本晴、互补CPL和过表达OX的10粒种子照片。
[0073] (C)Kasalath、RNAi-2 和 RNAi-610 粒种子照片。
[0074] (D) GLA4 和 NIL-An-I 粒长比较。
[0075] (E)日本晴、互补CPL和过表达OX粒长比较。
[0076] (F) Kasalath 和 RNAi 粒长比较（Bar = 10mm)。
[0077] 图6、每穗粒数比较和单株产量比较。
[0078] (A) GLA4 和 NIL-An-I 的整穗照片。
[0079] (B) Kasalath、RNAi-2 和 RNAi-6 的整穗照片。
[0080] (C) GLA4和NIL-An-I的每穗粒数比较。
[0081] (D)Kasalath和RNAi的每穗粒数比较。
[0082] (E)日本晴、互补CPL和过表达OX的整穗照片。
[0083] (F)日本晴、互补CPL和过表达OX的每穗粒数比较。
[0084] (G)日本晴、互补CPL-I和CPL-2单株产量比较。
[0085] 图7、An-I表达水平比较。
[0086] (A) An-I表达水平在GLA4和NIL-An-I之间的比较。
[0087] (B)An-I表达水平在日本晴、互补CPL-I和CPL-2之间的比较。
[0088] (C)An-I表达水平在Kasalath4和RNAi株系之间的比较。
[0089] (D) LOG表达水平在日本晴、互补CPL-I和CPL-2之间的比较。
[0090] 图8、芒的发育及An-I和Histone H4的表达模式。
[0091] (A1-A5)在不同发育时期GLA4小穗的电镜扫描照片，箭头所指外莩顶端。
[0092] (B1-B5)在不同发育时期NIL-An-I小穗的电镜扫描照片，箭头所指芒原基。
[0093] (C1-C5)An-I在GLA4小穗不同发育时期的时空表达模式，箭头所指外莩顶端。
[0094] (D1-D5) An-I在NIL-An-I小穗不同发育时期的时空表达模式，箭头所指芒原基。 [0095] (El)在SpSl期，GL4小穗组织切片染色的照片，箭头所指外莩顶端。
[0096] (E2-E5)Histone H4在GLA4小穗发育中的时空表达模式，箭头所指外莩顶端。
[0097] (Fl)在SpSl期，NIL-An-I小穗组织切片染色的照片，箭头所指芒原基。
[0098] (F2-F5)Histone H4在NIL-An-I小穗发育中的时空表达模式，箭头所指芒原基 (Bars=IOO μ m) Sp81 :Sp8 晚期。
[0099] 图9、种子表面娃质化细胞比较分析和Histone Hs的表达分析。
[0100] (A)完整种子的扫描电镜照片，箭头1代表种子表面放大的区域，箭头2代表沿水 平长轴对种子表面娃质化细胞计数区间。Bars=lmm。
[0101] (B)Kasalath种子表面放大的区域。
[0102] (C) RNAi-6种子表面放大的区域Bars=IOO μ m。
[0103] (D)Kasalath和RNAi种子表面硅质化细胞计数比较。
[0104] (E) Kasalath 和 RNAi 小于 4cm 幼穗中 Histone Hl 表达比较。
[0105] (F)日本晴种子表面放大的区域。
[0106] (G) CPL-1种子表面放大的区域Bars=IOO μ m。
[0107] (H)日本晴和CPL-I种子表面硅质化细胞计数比较。
[0108] (I)日本晴和CPL-1小于4cm幼穗中Histone Hl表达比较。
[0109] 图10、芒的发育及An-I和Histone H4的表达模式（Bars=IOO μ m)。
[0110] (A-D)An-I在NIL-An-I花序发育不同时期的时空表达模式。
[0111] (E-H)An-I在GLA4花序发育不同时期的时空表达模式。
[0112] (I-L)An-I在CPL-I花序发育不同时期的时空表达模式。
[0113] (M-P)OSHl在NIL-An-I花序发育不同时期的时空表达模式。
[0114] 图1UW1943中An-I 1978bp全长cDNA序列，其编码262氨基酸，下划线部分是保 守的bHLH结构域。
[0115] 图12、GLA4中an-Ι基因的1979bp全长cDNA编码263氨基酸，下划线部分是保守 的bHLH结构域。第一个代表在GLA4中插入的丙氨酸，第二个0代表的因一个碱基替 换造成的丙氨酸代替甘氨酸。

【具体实施方式】
[0116] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示通过在禾谷类植物（作物）中定向调 控An-I基因表达水平，可显著调节植物的产量、芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结 构等重要的性状，进而达到改良禾谷类作物、增加产量等目的。
[0117] 如本文所用，所述的"禾谷类作物"可以是禾本科植物或有芒植物（作物）。较佳 地，所述的禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。有芒植物是指种子壳上存在针状物 植物。
[0118] 如本文所用，An-I基因编码的多肽命名为"An-Ι"。在本发明中，术语"An-Ι"指具 有An-I活性的SEQ ID N0:2或4序列的多肽。该术语还包括具有与An-I相同功能的、SEQ ID N0:2或4序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个）氨基酸的缺 失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为20个以 内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相 似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加 一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括An-I的活性片段和活性 衍生物。
[0119] 任何一种An-I的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，An-I的生物活 性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的An-I的全部或部分功能。通常情况 下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长An-I的活性。在更优选的条件下，所述活性 片段能够保持全长An-I的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
[0120] 多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体。
[0121] 任何与所述的An-I同源性高（比如与SEQ ID N0:2或4所示的序列的同源性为 70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%， 98%或99%)的、且具有An-I相同功能的多肽也包括在本发明内。
[0122] 本发明还涉及编码本发明An-I或其保守性变异多肽、衍生物的多核苷酸序列。所 述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的 DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码 区序列可以与SEQ ID NO: 1或SEQID NO: 3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如 本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQ ID N0:2或4的蛋白质，但与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。"编码多肽的多核苷酸"可 以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷 酸。
[0123] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%， 更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸 可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指：（1)在较低离子强度和较高温度下的 杂交和洗脱，如〇. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C ;或（2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺， 0. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上， 更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID N0:2或4 所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0124] 应理解，虽然本发明的An-I基因优选获自水稻，但是获自其它植物的与水稻An-I 基因高度同源（如具有70%以上，如80%，85%、90%、95%、甚至98%序列相同性）的其它基因也 在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
[0125] 本发明的An-I核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合 成的方法获得。
[0126] 本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或An-I编码序列 经基因工程产生的宿主细胞。
[0127] 所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会 使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于 启动子以增强基因的转录。
[0128] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
[0129] 用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用 农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植 物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。
[0130] 本发明提供了所述的An-I基因的用途，用于调控植物农艺性状或产量性状；或用 于筛选对于调控植物农艺性状或产量性状有用的物质（即：所述物质通过调节An-I基因的 表达来调节植物农艺性状或产量性状）。作为一种优选方式，所述的An-I基因可用于：增 加种子的粒长；减少每穗种子颗粒数；减少每穗枝梗数；增加种子的芒长；和/或增加种子 的有芒率。
[0131] 本发明还涉及An-I上调剂或下调剂及其用途。由于An-I的上调剂或下调剂可调 节An-I的表达和/或活性等，因此，所述的上调剂或下调剂也可通过对An-I的影响来调控 植物农艺性状或产量性状，从而达到改良植物的目的。
[0132] 任何可提高An-I的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或 促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调控植物农艺性状或产量性状 的物质。
[0133] 任何可降低An-I的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、或降 低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为An-I的下调剂、拮抗剂或抑制剂，如干扰所 述An-I基因表达的干扰分子（如可形成microRNA的干扰分子）。所述的下调剂、拮抗剂或 抑制剂可用于调控植物农艺性状或产量性状。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达 的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。
[0134] 本发明还涉及一种调控植物农艺性状或产量性状的方法，该方法包括调节所述植 物中An-I基因的表达。
[0135] 一方面，本发明提供了另一种调控植物（如作物）农艺性状或产量性状的方法，所 述的方法包括：降低所述植物中An-I基因的表达（包括使An-I基因不表达或低表达）；从 而增加产量；降低粒长；增加每穗种子颗粒数；增加每穗枝梗数；缩短种子的芒长；和/或 减少种子的有芒率。
[0136] 另一方面，本发明提供了一种调控植物（如作物）农艺性状或产量性状的方法，所 述的方法包括：使所述植物过量表达An-I基因，从而：增加种子的粒长；减少每穗种子颗粒 数；减少每穗枝梗数；增加种子的芒长；和/或增加种子的有芒率。
[0137] 在得知了所述的An-I基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调 节所述的An-I基因的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带An-I基因的表达单 位（比如表达载体或病毒等）递送到靶点上，并使之表达活性的An-1。
[0138] 此外，可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低An-I基因的表达或使之缺失 表达，比如将携带反义An-I基因的表达单位（比如表达载体或病毒等）递送到靶点上，使 得细胞或植物组织不表达或降低表达An-I。
[0139] 作为本发明的一种实施方式，将An-I基因通过常规的方法克隆到适当的载体中， 将所述的带有外源基因的重组载体导入到植物组织或器官中，使所述的植物表达An-I基 因。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达An-I基因的植物。
[0140] 优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
[0141] (1)将外源的An-I基因转入植物器官或组织，获得转化入所述基因的植物组织、 器官或种子；和
[0142] (2)将步骤（1)获得的转入了外源An-I基因的植物组织、器官或种子再生成植物 植株。
[0143] 作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
[0144] (si)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有An-I基因；
[0145] (s2)将植物组织、器官或种子与步骤（si)中的农杆菌接触，使An-I基因转入植 物，并整合到植物细胞的染色体上；
[0146] (S3)选择出转入An-I基因的植物组织、器官或种子；以及
[0147] (s4)将步骤（S3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。
[0148] 其它增加 An-I基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强 启动子驱动从而增强An-I基因或其同源基因的表达。或者通过增强子（如水稻waxy基因 第一内含子、Actin基因第一内含子等）来增强该An-I基因的表达。适用于本发明方法的 强启动子包括但不限于：35S启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
[0149] 优选的，提供了一种降低植物中An-I基因表达的方法，所述的方法包括：
[0150] (1)将干扰An-I基因表达的干扰分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所 述干扰分子的植物组织、器官或种子；和
[0151] (2)将步骤（1)获得的转入了所述干扰分子的植物组织、器官或种子再生成植物。
[0152] 作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
[0153] (i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：
[0154] (a)含有反方向启动的An-I基因或基因片段（反义分子）的载体；
[0155] (b)含有可在植物体内形成特异性干扰An-I基因表达（或转录）的成分的干扰分 子的载体；
[0156] (ii)将植物的组织或器官或种子与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转 入植物组织或器官或种子。
[0157] 较佳地，所述方法还包括：
[0158] (iii)选择出转入了所述载体的植物组织或器官或种子；和
[0159] (iv)将步骤（iii)中的植物组织或器官或种子再生成植物。
[0160] 其它抑制An-I基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。
[0161] 本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了 An-I基 因或其同源基因的转基因植物；或者An-I表达量（包括低表达或不表达）降低的植物等。
[0162] 可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
[0163] 此外，本发明还涉及利用An-I基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发 明还涉及利用An-I基因作为一种分子标记，通过检测植物中An-I基因表达情况，鉴定植物 的芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结构。还可利用An-I基因相关的植物相关性状特 性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。
[0164] 在本发明的具体实施例中，利用图位克隆的方法克隆了控制水稻芒发育的An-I 基因，利用遗传转化对该基因进行了验证。对An-I基因的近等基因型系（NIL-An-I)，An-l 互补（CPL)和过表达（OX)的转基因株系表型考察，发现An-I引起长芒表型并使粒子变长， 同时降低了每穗粒数。而RNAi的转基因植株则引起相反的表型。进一步的实验显示，An-I 的表达上调降低了单株产量；An-I的表达下调则增加了单株产量。在具有野生稻An-I基 因的近等基因型系中，扫描电镜显示当小穗发育的SP6期，外莩顶端因为细胞持续分裂延 伸形成芒原基，芒原基中细胞进一步分裂导致芒原基继续延伸。An-I基因的原位杂交显示， An-I在小穗发育的SP6期，在外莩原基顶端开始强烈表达，其表达一直持续到SP8期晚期， 这种特异的表达引起芒原基的起始和延伸。An-I基因的上调表达引起细胞持续分裂，调控 组蛋白Hl和H4的表达上调，也引起粒子的变长。An-I基因也在幼穗中表达，其表达的上调 会引起一个重要的细胞分裂素调控基因 LOG的下调表达，从而引起每穗粒数的减少。比较 野生稻An-I和栽培稻an-Ι序列发现，主要差异存在于启动子区域。本发明人还发现An-I 落在水稻受到强烈驯化选择区域（domestication sweeps)，显示该基因在人工驯化中成为 一个主要的选择对象，究其根本原因可能在于An-I引起芒发育的同时降低了水稻的产量。 因此栽培稻中被固定的基因型an-Ι导致无芒性状并同时提高产量，满足了农业生产的需 要。
[0165] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0166] I、材料和方法
[0167] 1、实验材料
[0168] 实验中用于An-I定位和功能研究的水稻材料有：无芒的籼稻广陆矮4号 (Guangluai4, GLA4)，有芒的单染色体替换系SL4、有芒的单片段替换系CSSL-Z3和有芒的 近等基因系NIL-An-I。
[0169] SL4由日本植物基因组中心提供，是以GLA4遗传背景，第4号染色体被普通野生 稻（Oryza rufipogon)W1943所替代的单染色体替换系，在野生稻W1943与籼稻GLA4回交 BC4F2群体中由分子标记筛选得到。
[0170] CSSL-Z3是SL4与籼稻GLA4回交BC5F3由分子标记筛选得到的单片段替换系，在 分子标记IN6298-IN6265之间是W1943片段，覆盖主效芒长位点An-I。
[0171] NIL-An-I是由CSSL-ZSXGy^BC1F3群体中筛选得到GLA4背景，包含An-I位点的 近等基因系。
[0172] 野生稻W1943获自日本国立遗传研究所。
[0173] Kasalath获自日本国立遗传研究所。
[0174] 日本晴获自日本农业资源研究所。
[0175] 2、An-I精细定位群体的构建
[0176] 本发明人利用GLA和CSSL-Z3杂交构建了 1个精细定位群体，杂交F1代表型与 CSSL-Z3相同，自交得到F2包含10500个体的大群体，表型分离为有芒和无芒，对其进行鉴 定基因型，得到的重组子移栽到田间，考察表型。
[0177] 3、野生稻BAC的筛选和制备
[0178] 应用普通野生稻W1943的BAC文库，保存在80块384孔板中。通过PCR扩增，可 以逐步筛选在两个不同分子标记中均有扩增的单个BAC。利用QIAGEN公司的BAC提取试剂 盒进行BAC DNA制备。
[0179] 4、野生稻BAC测序和基因注释
[0180] 采用shotgun法对所挑选的野生稻BAC进行测序，用GENESCAN的软件进行基因注 释。
[0181] 5、An_l转基因载体构建
[0182] (I)An-I的互补质粒（pCPL)构建
[0183] 筛选并提取包含An-I基因的野生稻W1943BAC，利用BamHI酶切回收IOkb长度片 段包含An-I基因上游6kb到下游0. 5kb的基因组序列，连接到载体pCAMBIA1301载体上， 构建An-I-CPL质粒，S卩pCPL。
[0184] (2) An-I的过表达质粒（pOX)构建
[0185] 所用的过表达载体是以PCAMBIA1300为骨架，利用玉米Ubquitin启动子作为启 动子，以NOS终止子为终止子，且在终止子前添加了一段90bp左右的HAtag序列，cDNA插 入可与之构成融合蛋白。该片段序列如SEQ ID N0:20(其中1-1980位为玉米UBI启动 子，2105-2360位为NOS终止子，2000-2104为HAtag序列），插入pCAMBIA1300多克隆位点 HindIII/EcoRI 位点。
[0186] 将野生稻W1943An-10RF连接到PNCGR的UBI启动子之后，分别构建An-1-pOX载 体，即pOX。
[0187] 其中，以野生稻W1943cDNA为模板，扩增W1943An-10RF，其上游引物为AGGCGCGCCT GGCAGGCTGTCCCGTGTCT(SEQ ID N0:6);下游引物GGGGTACCGCT GGCTCGGCCTTCATGTG(SEQ ID NO:7)〇
[0188] (3) An-I 的 RNA 干扰质粒（pRNAi)构建
[0189] 使用的RNA干扰载体是pTCK303 (获自北京植物研究所）。将An-I基因的282bp cDNA序列（3'UTR的一部分）双向连接到pTCK303载体上，构建An-I-RNAi载体，S卩pRNAi。
[0190] 282bp cDNA 序列如下（SEQ ID N0:5):
[0191] GGTTTTCCAAGGCTTAACTTTTTCCAGATGCAGTGTCATATTGTTTAGGCAAAGAACTTGTTTTGATGT TGTG ATGCTTGTAGGACAGAGGAGTATATGTGTAGTATGTCTGGAAATGGCAAGGCAGGGGAGCTGTGTGACCTT TGTGTGTGCTGGTTGCATGCCCTAACTGTAGAAAAAAAAAAGAGGAGGATTGTGCTAGTGATGTTAGTAGT GGTAG TGGCTTTGTAGGATTTGGCATGCATGGGGATGTATGTACTATGTATGTAGAGATTGGAGAGG
[0192] 该282bp cDNA序列正向连接入载体的BamHI/Kpnl位点，反向连接入载体的SpeI/ SacI位点。
[0193] (4) An-I 的 promoter GUS 载体构建
[0194] 所用的 promoter ⑶S 载体是 pCAMBIA1300GN:⑶S。选取 An-IATG 上游 2kb 或 6kb 片段，通过SmaI和XbaI定向克隆到pCAMBIA1300GN载体（获自上海植物生理生态所林鸿 宣实验室）的⑶S基因前面，构建An-Ι::⑶S载体。
[0195] 其中，以野生稻W1943基因组为模板，扩增An-IATG上游2kb或6kb片段引物分别 为：
[0196] 扩增 An-IATG 上游 6KB 片段的上游引物：TTTTGCTTACGCGTTTGTTG TGTTG(SEQ ID N0:8);下游引物 TCCCCCGGGGTGGTTGACCGTTATATAAG A AA(SEQ ID N0:9)。
[0197] 扩增 An-IATG 上游 6KB 片段的上游引物：ACGCGTCGACCAGTTGAAG AAAAAGGATCCAG(SEQ ID N0:10);下游引物TCCCCCGGGGTGGTTG ACCGTTA TATAAGAAA(SEQ ID N0:11)。
[0198] 6、农杆菌介导的水稻遗传转化
[0199] 水稻转基因采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法，所采用的农杆菌菌株为 EHA105。pCPL和pOX用于转化日本晴，pRNAi用于转化Kasalath。
[0200] 7、穗部性状考察和粒型扫描
[0201] (1)亲本及转基因植株的芒种长考察
[0202] 芒长性状的考察：在单株种子成熟后，取其主穗测量所有一次枝梗顶粒芒长取其 平均值代表整穗的芒长，每个株系取20个个体，记录亲本的芒长范围。
[0203] 有芒率的考察：在种子成熟后，取单株的主穗，统计总粒数和有芒的粒数，有芒粒 数除以总粒数，即为有芒率。每个株系取20个个体，计算平均值。
[0204] (2)穗部性状考察
[0205] 在水稻籽粒灌浆后期、穗子还未变黄的时候取一个单株上不同分蘖的三个穗子进 行穗部性状考察。主要考察的性状包括：穗长、一次枝梗长度、一次枝梗数、二次枝梗数、总 粒数、未灌浆瘪粒数、有芒粒数和顶粒芒长。不同材料取20单株，每株3个主分蘖上的穗子， 计算各性状的平均值。
[0206] (3)粒型扫描
[0207] 种子的饱满度会影响粒长、粒宽，在种子完全成熟后，单株收种用于粒型考察。每 个单株随机取100粒左右的种子，去芒后使用MICROTEK ScanMaker i800扫描仪进行粒型 扫描。得到的扫描图像使用"种子大米外观品质检测软件"计算每个种子的长度和宽度，计 算平均值。
[0208] 8、扫描电镜观察
[0209] (1)扫描电镜观察幼穗。
[0210] ⑵扫描电镜观察种子表皮。
[0211] 9、实时定量PCR
[0212] 新鲜植物组织或者_8(TC冻存的组织用Trizol Reagent提取。总RNA样品中的 DNA经过DNA 酶消化后，用 Invitrogen 的 SuperScript?II Reverse Transcriptase 进行反 转录为cDNA第一链，进一步为实时定量PCR的模版。定量PCR采用Takara公司的SYBR:'_'3 Premix Ex TaqTM试剂盒，在Applied Biosystems7500real time PCR仪上进行。根据基因 序列设计特异基因引物，选择水稻基因 eEF-Ια (GenBank accession no. AK061464)作为内 参。
[0213] KKAn-I的亚细胞定位
[0214] (I)An-I的GFP融合蛋白构建
[0215] 使用的GFP融合蛋白载体是PA7-GFP载体（获自上海交通大学杨洪全实验室）。 使用加酶切接头的PCR正反向引物（正向CCGCTCGAGATGAACCCCACCACCG(SEQ ID N0:12); 反向 GGACTAGTACTGGCTCGGCCT TCATGTGGTT(SEQ ID N0:13))扩增 An-IcDNA片段，双酶切连 接到PA7载体的GFP蛋白编码序列前面，构建GFP融合蛋白载体。
[0216] (2)基因枪电击转化洋葱表皮细胞及GFP信号观察。
[0217] 11、An-I酵母单杂交验证转录激活活性
[0218] (I)An-I酵母单杂交诱饵载体的构建
[0219] 使用Clontech公司的酵母单杂交系统验证An-I的转录激活活性，用pGBKT7载体 (Clontech)构建酵母单杂交诱馆载体。
[0220] 根据An-I的cDNA序列设计引物，分别扩增An-I全长ORF序列、An-I的N-端蛋白 (N端第1-82位）编码序列和C-端蛋白（C端第82-263位）编码序列，在保证不移码的情 况下连接到载体PGBKT7上，接到GAL4binding domain后面，构建成酵母单杂交诱馆载体。
[0221] 扩增 An-I 全长 ORF 序列正向引物 CCGGAATTCATGAACCCCACCACCG(SEQ ID N0:14); 反向引物 CGGGATCCTTATGGC TCGGCCTTCATGTGGT(SEQ ID N0:15)。
[0222] 扩增An-I的N-端蛋白（N端第1-82位）编码序列正向引物 CCGGAATTCATGAACCCCACCACCG(SEQ ID N0:16);反向引物 CGGGATCCTCACGCCCTC ACATGGATGTAGTCTTT(SEQ ID N0:17)。
[0223] 扩增An-I的C-端蛋白（C端第82-263位）编码序列正向引物 CCGGAATTCAGGCGGGGGCAAGCCA(SEQ ID N0:18);反向引物 CGGGATCCTCACATGGCT CGGCCTTCATGTGGTT(SEQ ID N0:19)。
[0224] 12、石蜡切片及原位杂交
[0225] 用于组织学观察和原位杂交的材料用4%多聚甲醛固定，系列乙醇脱水，二甲苯透 明并包埋在石蜡中。原位杂交的探针用罗氏公司的地高辛标记试剂盒进行标记。标记好的 原位正义反义探针在8-um的石蜡切片上进行杂交。
[0226] II、实施例
[0227] 实施例1、野生稻第4号染色体芒长QTL定位和芒长基因 An-I的精细定位及验证
[0228] GLA4是栽培稻籼稻品种，全部粒子无芒。SL4具有长芒，几乎全部粒子有芒。 CSSL-Z3具有稳定较长芒，大部分籽粒有芒，有芒率超过80%。NIL-An-I具有稳定较长芒，大 部分籽粒有芒，有芒率超过60% (图IA和1B)。
[0229] 本发明人利用SL4XGLA4F2群体，共255个个体，在野生稻第4号染色体上定位了 两个芒长QTL位点，分别命名为An-I和An-2 (图1C)。An-I和An-2都是野生稻W1943基 因型对芒为正效应，促进芒的生长。An-I初定位在分子标记M6298和M6285之间，对于芒长 的贡献率为52. 5% ;An-2初定位在分子标记Ml 108和Ml 160之间，对于芒长的贡献率为12%。
[0230] CSSL-Z3是SL4与GLA4回交的BC5F3群体中，经过分子标记检测得到的染色体单 片段替换系。CSSL-Z3是在分子标记M6298-M6265之间为W1943基因型，其余背景为GLA4 的单片段替换系。本发明人利用包含An-I位点的CSSL-Z3和GLA4构建的定位群体，对芒 长基因 An-I进行精细定位。CSSL-Z3与GLA4杂交F1代的表型与CSSL-Z3相同，具长芒，说 明An-I为显性基因，自交匕代的表型出现长芒和无芒分离，分离比符合3:1，说明An-I为 单基因控制。本发明人利用CSSL-Z3XGLA4F 2精细定位群体（包含10500个体），使用分 子标记FM1-9鉴定基因型，最终将An-I定位到分子标记FM3和FM6之间，根据日本晴基因 组序列（IRGSP V4. 0)计算物理距离为70kb (图1D)。本发明人利用FM3和FM6筛选野生 稻W9143BAC库，得到相应于该区域的0RW1943Ba0047B01，并进行了测序和基因注释。由于 日本晴与GLA4在该区域具有很高的同源性，没有其它基因插入。因此本发明人直接比较了 FM3和FM6区域内日本晴和W1943之间序列，发现在这一区域存在很多插入和缺失片段（图 1E)，这种互相的插入和缺失造成GLA4与W1943在这一区域进一步重组较为困难，因此无法 进一步缩小定位范围。
[0231] 比较FM3和FM6区间内W1943与日本晴基因的预测情况，筛选得到2个候选基因， 一个是与细胞分裂、分化相关的bHLH基因（0s04g0350700)，另外一个是与线粒体功能相关 的RFl基因（0s04g0350133)。本发明人对这两个候选基因分别构建了互补质粒转化日本 晴。包含RFl基因区及其上游启动子区的IOkb互补质粒转化日本晴得到的转基因植株没 有长芒，不能进行功能互补，因此排除了 RFl作为候选基因的可能性。
[0232] 选取候选野生稻W1943基因 bHLH的上游6kb启动子区加上整个基因区，约IOkb 的互补片段连接到PCAMBIA1301构建pCPL质粒（图1F)。同时构建了过表达质粒，以野生 稻W1943的cDNA为模板，将0. 8kb的ORF连接到PNCGR载体的玉米UBI启动子后面构建过 pOX质粒（图1F)。将pCPL和pOX质粒分别转化日本晴，Ttl代80%CPL转基因植株和90%0X 转基因植株表现出明显的长芒表型，有芒率超过50%。
[0233] 同时构建An-I的RNA干扰质粒，以野生稻W1943的cDNA为模板扩增282bp片段 并将其正反向连接到PTCK303载体上（图1F)。pRNAi质粒转化有芒的籼稻品种Kasalath， Ttl代50%RNAi植株出现芒变短变少。
[0234] 上述结果证明，0s04g0350700的确是An-I基因，具有控制芒发育的功能。
[0235] 实施例2、野生稻与栽培稻An-I等位基因序列比较及共同变异的筛选
[0236] 结构域分析结果显示，An-I是一个含有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH)保守结构域的 基因。本发明人利用5'RACE和3'RACE技术扩增了 An-I的全长cDNA序列。在W1943中， 该基因全长cDNA序列为1978bp(F0681395)(SEQ ID N0:1)，编码262氨基酸的蛋白（SEQ ID N0:2)。在GLA4中该基因全长cDNA为 1979bp(F0681475)(SEQIDN0:3)，编码 263 氨基酸 的蛋白（SEQ ID N0:4)。两者差异在于，GLA4中在Ist外显子有一个CCG的插入导致多了一 个丙氨酸，在2 nd外显子中存在一个SNP将甘氨酸变为丙氨酸，两处差异均在bHLH保守结构 域外面。最后在3' UTR区存在2个碱基的缺失和1个碱基替换（图11和图12)。
[0237] 本发明人利用酵母单杂交系统验证了 An-I蛋白具有转录激活活性（图2A)。通过 激光共聚焦显微镜观测An-I-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内的核定位（图2B和2C)。因 此证明了 An-I基因编码是一个具有转录激活活性的bHLH蛋白。
[0238] 本发明人对W1943、GLA4和日本晴的An-I基因序列比较。测序结果显示日本晴和 GLA4之间，除了启动子区有两个SNP外，其余序列完全一致。而W1943和GLA4比较显示， 在基因区的差异与上述cDNA差异一致；在启动子区则差异较大，包括一些插入缺失和多个 SNP，包括日本晴和GLA4中在An-I转录起始位点上游40bp左右有一个4. 4kb的转座子插 入。
[0239] 本发明人测定了 43个栽培稻品种（22个籼稻，21个粳稻）和27个野生稻品系的 An-I基因（包括4. 5kb启动子区域和3. 5kb基因区）以比较其序列差异。通过序列比较， 发现栽培稻和野生稻之间存在共同变异，包括12个SNP，4个Ibp的缺失插入，和1个4. 4kb 的转座子缺失插入。根据这些共同变异，本发明人把栽培稻和野生稻分为两个单倍型即栽 培稻的an-Ι型和野生稻的An-I型（图3)。进一步根据转座子的有无和2 nd外显子Ibp缺 失插入的有无，可将栽培稻的单倍型进一步分为两个亚型，an-l(Tn+)和an-l(G-)(图3A 和3B)。大多数的无芒粳稻具有日本晴和GLA4的an-l(Tn+)单倍型（图3A)，而大多数的 无芒籼稻具有an-1 (G-)单倍型（图3B)。
[0240] 在大多数的无芒籼稻中，例如HP228,2nd外显子Ibp的缺失导致该基因编码框移位 (framshift)，产生一个新的终止位点，导致该基因编码一个97氨基酸的截短蛋白，并导致 该基因在籼稻中功能丧失。
[0241] 但是在野生稻中，An-I基因存在较大的变异。其中约30%的品系具有籼稻 an-1 (G-)单倍型，其它品系基因型均包括上述W1943单倍型中的共同变异，可能这些共同 变异直接影响了野生稻和栽培稻的芒表型差异（表4)。
[0242] 实施例3、An-I促进芒的发育
[0243] 为了研究An-I的功能，本发明人筛选了一个近等基因系，NIL-An-1。NIL-An-I 是从CSSL-ZSXGy^BC1F3群体中筛选得到，以GLA4为背景，包含野生稻120K片段（包括 An-I位点在内）。自交得到的An-I近等基因系，其芒长为14. 68±2. 45mm，而有芒率为 52. 81±12· 8% (图 4A 和 4D)。
[0244] 考虑到转基因植株中的拷贝数对表型的影响，本发明人利用潮霉素抗性筛选法 鉴定出单拷贝插入T 2代纯合植株进行表型分析和其它分析，其中包括互补的CPL-1、2， RNAi-l、2、5、6株系。而过表达OX则选择Ttl代表OX-I和0X-5株型进行分析。
[0245] 在转基因互补株系中，CPL-I和CPL-2的芒长分别是3L 84±6. 36mm和 31. 90±6. 98mm，而有芒率分别为54. 48± 14. 41%和53. 21 ±15. 14%。在过表达株系中，OX-I 和0X-5芒长分别是33. 82±5. 81mm和34. 04±6· 99mm，而有芒率分别为63. 41±14· 19%和 65. 74 ± 16. 82%。其对照日本晴（Nipponbare)基本无芒（图4B和4E)。
[0246] 对于 RNAi 株系，与 Kasalath(芒长 23. 30±3. 05mm，有芒率 56. 32±4. 11%)相 t匕，芒长下降，其长度到从〇.82±l. 29mm到9. 14± 1.87mm，而有芒率也同时下降分别为从 4. 25 ±3. 44% 到 23. 84 ±9. 49% (图 4C 和 4F)。
[0247] 因此An-I不仅控制了芒长而且控制了有芒率。
[0248] 实施例4、An-I促进水稻粒子变长
[0249] 本发明人在穗部性状考察的过程中，发现与GLA4相比，NIL-An-I除了芒长发生变 化之外，还出现了粒型、穗粒数等性状的变化。每穗粒数、粒型大小都是与水稻产量密切相 关的重要农艺性状，因此本发明人进行了详细考察。
[0250] 种子的饱满度会影响粒型，在种子完全成熟后，每个材料单株收种，去掉灌浆不饱 满的种子后，随机取100粒左右的种子去芒后放到扫描仪上进行粒型扫描，得到的扫描图 像使用专用软件计算每粒种子的长度和宽度。
[0251] 首先对GLA4和NIL-An-I的粒长进行统计比较，发现NIL-An-I粒子比GLA4粒子 长3. 19% (图5A和OT)。CPLl和CPL2的粒子分别比日本晴长13. 90%和11. 97% ;而OX-I和 0X-5的粒子分别比日本晴长19. 99%和16. 74% (图5B和5E)。RNAi的粒子却比Kasalath 短一些，RNAi不同株系粒子分别比Kasalath粒子短3. 30%-9. 60% (图5C和5F)。
[0252] 实施例5、An-I调控每穗粒数和单株产量
[0253] 除了影响芒长和粒长，An-I基因还影响每穗粒数。在NIL-An-I中每穗粒数比GLA4 少10. 58%左右（图6A和6C)。
[0254] 本发明人考察An-I-RNAi的每穗粒数，发现与Kasalath相比，RNAi植株的每穗粒 数增加 13. 60%-38· 4% (图 6B 和 6D)。
[0255] 互补和过表达转基因植株的情况与NIL-An-I相似。日本晴通常产生9. 67± 1.57 一次枝梗，19. 76±3. 95二次枝梗和111. 56±19. 29每穗粒子。在CPL和OX转基因植株中， 一次枝梗和二次枝梗数目均减少，CPL和OX转基因植株中一次枝梗数一般为7-8个，二次枝 梗数平均值也在7-8左右。CPL-I和CPL-2每穗粒数分别为63. 61 ±9. 17和68. 47± 12. 19， 与日本晴相比分别下降42. 08%和38. 62%。而OX-I和0X-5每穗粒数分别为51. 79±9. 57 和55. 82 ±14. 34,与日本晴相比分别下降54. 58%和49. 96% (图6E和6F)。本发明人同时 发现与日本晴相比，CPL和OX的转基因植株未灌浆瘪粒增加。
[0256] 本发明人进一步对CPL和日本晴的单株产量进行了比较分析。结果显示，与日本 晴相比，CPL-I和CPL-2单株产量分别下降34. 83%和30. 80% (图6G)。
[0257] 这些表型数据都证明，An-I除了控制水稻芒的生长之外，还影响水稻的穗粒数和 粒长。野生稻W1943的An-I基因使一次枝梗数和二次枝梗数明显减少，从而减少穗粒数及 单株产量。
[0258] 实施例6、NIL-An-I和转基因植株中An-I表达水平变化
[0259] 本发明人取穗长小于4cm的幼穗提取总RNA，反转录为cDNA第一链，以此为模板 进行定量PCR分析。分析结果显示，An-I基因在NIL-An-I的表达水平是GLA4的二倍左右 (图7A)。与日本晴相比，在转基因互补CPL-I和CPL-2植株中An-I基因的表达水平上调 了 40-45倍（图7B)。考虑到CPL-I和CPL-2都只包含一个拷贝的外源转基因，因此表达量 上调主要是外源基因在这个遗传背景中的缘故。而在RNAi植株中，与对照kasalath相比， An-I基因表达下调，下调程度与表型程度一致（图7C)。表达水平变化与表型结合起来显 示，An-I基因表达水平与芒长和粒长正相关，而与每穗粒数则呈现负相关。
[0260] 以前的研究显示，LOG和Gnla这两个基因直接影响细胞分裂素的浓度并控制水稻 的穗粒数。LOG基因编码一个酶，催化无活性的细胞分裂素变成有活性的细胞分裂素；而 GnIa编码细胞分裂素氧化酶2 (0sCKX2)，降解细胞分裂素。由于CPL植株中每穗粒数下降严 重，本发明人检测了 CPL和日本晴中的LOG和0sCKX2的表达水平。发现在小于Icm的幼穗 中，CPL-I和CPL-2中LOG基因的表达水平下降到只有日本晴中的一半（图7D);而0sCKX2 表达在CPL和日本晴之间则没有明显变化。
[0261] 实施例7、An-I基因引导细胞分裂和芒的发育
[0262] 水稻的花由四轮组成：最外一轮包括外稃和内稃，第二轮由两个浆片组成，第三轮 由六个雄蕊组成，最内轮是雌蕊。根据Ikeda等对水稻小穗发育时期的划分，小穗发育分为 8个时期：Spl期护颖原基形成；Sp2期护颖原基形成；Sp3期外稃原基形成；Sp4期内稃原基 形成；Sp5期楽片原基形成；Sp6期雄蕊原基形成；Sp7期心皮原基形成；Sp8期胚珠和花粉 形成。穗长4cm之后进入花器官成熟期，即InS期。
[0263] 扫描电镜观察显示，Sp4期内稃原基形成（图8A1和8B1)，直到Sp6期雄蕊原基 形成，GLA4和NIL-An-I的小穗原基在形态上基本没有差异（图8A2和8B2)。当心皮原基 起始的Sp7期出现变化，NIL-An-I的外稃顶端向往延伸形成芒原基（图8B3)，而GLA4中 的外稃顶端没有明显伸长（图8A3)。到SpS早期，内外稃开始闭合、胚珠原基形成的时候， 可以看到GLA4的外稃顶端仍然没有伸长，形成一个圆形的结构（图8A4)而NIL-An-I的芒 原基继续伸长（图8B4)。在大于4cm的穗中，开始进入小花器官成熟期，即SpS晚期，此时 NIL-An-I的芒已经很长（图8B5)，GLA4的外稃尖端终止为稃尖（图8A5)。
[0264] 为了探究An-I在芒发育中的功能，本发明人采用RNA原位杂交技术来检测An-I 在小穗不同发育时期的表达情况。在小穗发育中，An-I在护颖和副护颖原基、内外稃原基 (图8C1和8D1)、雄蕊原基（图8C2和8D2)及随后的心皮原基（图8C3和8D3)都有表达。 An-I在小穗发育早期，GLA4和NIL-An-I中的表达没有太大差异。差异从Sp6期开始，An-I 的表达在NIL-An-I的外稃顶端开始加强（图8D2)，随后在芒原基强烈表达（图8D3)，这种 强烈表达持续到SP8早期（图8D4)，接着在Sp8后期逐渐减弱（图8D5)。在GLA4中An-I 的表达一直较弱且比较均匀（图8C2-C3)，但是在外稃顶端却没有表达（图8C4)，在SpS后 期，An-I的表达在内外稃中几乎消失，主要在花药和心皮处有较明显的信号（图8C5)。
[0265] 组织切片观察比较显示，在Sp8晚期的小穗中，NIL-An-I芒原基细胞数目是GLA4 小穗稃尖细胞数目的三倍多（图8E1和8F1)，因此可以认为芒的发育与细胞分裂直接相关。
[0266] Histone Hl和H4在细胞周期Gl期-S期表达，它们的表达通常被用作细胞分裂的 标记物。Histone H4的原位杂交分析表明，在Sp6期之前,Histone H4在GLA4和NIL-An-I 的所有花器官原基内均有表达，没有明显差异（图8E2和8F2)。在Sp7期，NIL-An-I外稃 原基顶端开始向外突出，Histone H4在内外稃、雄蕊原基和芒原基上都有很高的表达；而 GLA4中在小穗外稃原基的表达量比NIL-An-I中低（图8E3和8F3)。在Sp8早期，Histone H4在GLA4小穗的雄蕊原基中表达较强，内外稃原基的表达开始减弱；而在NIL-An-I小花 的雄蕊、内外稃和芒原基上仍有很强的表达（图8E4和8F4)。在Sp8后期，Histone H4在 在GLA4和NIL-An-I内外稃中表达量都很低，基本上只在雄蕊和心皮中还有表达（图8E5 和 8F5)。
[0267] 以上结果说明，在NIL-An-I中，An-I在外稃尖端特异表达，引起外稃尖端细胞持 续分裂，细胞数目增多，进一步引导芒原基的起始和延伸。因此An-I的高表达是芒原基中 细胞持续分裂的基础。而栽培稻GLA4中，an-Ι的基因型将An-I的表达从外稃尖端排除， 从而导致外稃尖端细胞失去分裂能力，产生无芒表型。
[0268] 实施例8、An-I调控细胞分裂从而影响粒子长度
[0269] 水稻种子由颖壳包裹，分为内稃和外稃，颖壳的大小是影响粒型的一个重要因素。 硅质化细胞组成颖壳的表皮，呈方格状有尖锐突起，具有坚硬的表皮毛，在种子表明规则排 布，起到保护支持作用。
[0270] 与粒型相关的基因通常会通过调控颖壳的细胞数量或者细胞大小来影响种子的 大小，比如qSW5基因功能的缺失使表层硅质化细胞的数量增加，PGL2基因过表达使颖壳细 胞长度增加，造成粒型变长。本发明人进一步研究An-I是否通过控制颖壳细胞的数量变化 来影响粒长的。本发明人取An-I转基因植株和其转化亲本的成熟种子，包括CPL-I和日本 晴，RNAi-6和Kasalath，使用扫描电镜的方法观察种子表面，考察统计硅质化细胞数目变 化。统计种子外稃靠近内外稃分界线第10-11行硅质化细胞数目，因在其靠近稃尖处，外稃 上的一条维管束在其终点形成一个容易识别的突起，统一选取这个突起作为统计界限（图 9A)。
[0271] 首先，比较了 RNAi-6和Kasalath种子表皮硅质化细胞，发现细胞的大小没有明显 变化（图9B和9C)。而细胞计数的结果显示在RNAi-6种子表皮细胞数目比Kasalath减少 9. 68%(图9D)。定量PCR显示，与Ksalath相比，RNAi-6小于4cm幼穗中Histone Hl的表 达水平下降50%左右（图9E)。
[0272] 接着，比较了 CPL-I和日本晴种子表皮硅质化细胞，发现它们的细胞大小同样没 有明显变化（图9F和9G)。细胞计数的结果显示CPL-I种子表皮细胞数目比日本晴增加 14. 16%(图9H)。定量PCR显示，与日本晴相比，CPL-I小于4cm幼穗中Histone Hl的表达 量上调2倍还多（图91)。原位杂交显示在Sp8晚期的小穗中，Histone H4仍在CPL-I持 续表达（图9K)而在日本晴中几乎没有表达（图9J)。
[0273] 所以，当An-I上调表达时（在CPL-I植株中）由于细胞分裂持续进行引起种子外 稃硅质化细胞数目显著变多，导致粒子变长。而当An-I下调表达时（在RNAi植株中）细 胞分裂减少引起种子外稃硅质化细胞数目明显减少，导致种子变短。
[0274] 实施例9、An-I在花序中的表达与每穗粒数的关系
[0275] Ikeda等人将水稻花序发育分为9个时期。在花序发育的早期，An-I在GLA4、 NIL-An-I和CPL-I中的表达模式没有明显区别。在In-I期萼片原基形成，顶端分生组织转 变为花序轴分生组织。An-I在GLA4和NIL-An-I的花序轴分生组织表层微弱表达（图IOA 和10E);而在CPL-I中，An-I不仅表达量上升而且其表达由表层扩展到髓部及原维管束组 织中（图101)。在In2-In3期，An-I开始在GLA4和NIL-An-I的一次枝梗原基中表达，表 达量中等（图IOB和10F)而在CPL-I中则强烈表达（图10J)。在In5期当二次枝梗起始 时，An-I在GLA4、NIL-An-1和CPL-I的二次枝梗原基中表达（图10CU0G和10H)。从In-6 期小穗原基开始起始，An-I的表达转移到GLA4、NIL-An-1和CPL-I的小穗原基中表达（图 10D、IOH和10L)。在所有发育时期，An-I的表达在NIL-An-I中比GLA4略高，而在CPL-I表 达最强烈，原位表达结果与实时定量PCR结果非常吻合。
[0276] 本发明人进一步比较OSHl和An-I基因在NIL-An-I的表达模式。在Inl-In5期， OSHl基因强烈地表达在花序轴分生组织、一次枝梗原基和二次枝梗原基中（图10M-100)， 而An-I基因也在这些组织中微弱表达。它们的表达差异出现在In6期，OSHl只表达在小 穗分生组织中而An-I则开始在花器官原基中表达（图IOD和10P)。尽管两个基因在花序 发育早期有共同的表达模式，但是NIL-An-I的穗部表型和转基因植株表型说明，An-I在维 持分生组织属性方面的作用与OSHl相反。
[0277] 综上所述，An-I的表达模式和表达量的同时变化引起了 NIL-An-I和转基因植株 中穗部表型的变化。
[0278] 总结
[0279] 本发明人克隆了野生稻An-1，该基因具有多效性，同时控制水稻芒发育、粒长和每 穗粒数。当该基因引入无芒栽培稻会导致长芒表型并增加粒长，但同时引起每穗粒数减少 和单株产量下降。An-I的表达量和表达模式对这些表型的出现非常重要。An-I基因上调 表达会维持细胞分裂，增加细胞数目，从而诱导芒的发育和粒长增加，因此An-I是个细胞 周期调控因子。An-I基因在花序轴分生组织、一次枝梗和二次枝梗原基中上调表达，会同 时下调细胞分裂素调控因子LOG的表达，从而导致每穗粒数的减少和单株产量的下降。因 此An-I是一个重要的人工选择基因，受到强烈的选择压力。而在栽培稻中两种单倍型，粳 稻an-l(Tn+)降低了其表达水平并改变了表达模式，籼稻an-l(G-)丧失了基因功能，这样 的变化导致芒的丧失和每穗粒数的增加，从而导致产量的增加，达到驯化的目的。
[0280] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一种调控禾谷类作物农艺性状和/或产量性状的方法，其特征在于，所述方法包括： 调节禾谷类作物中An-ι基因的表达。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的禾谷类作物是禾本科植物；较佳地， 所述的禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦；和/或 所述的农艺性状包括：芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结构。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的An-Ι基因编码： (a) 如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4氨基酸序列的多肽； (b) 将SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的，且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽；或 (c) 与（a)限定的多肽序列有80%以上同源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多 肽。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：降低禾谷类作物中An-Ι的 表达；从而： 增加产量； 降低粒长； 增加每穗种子颗粒数； 增加每穗枝梗数； 缩短种子的芒长；和/或 减少种子的有芒率。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述降低禾谷类作物中An-Ι基因的表达包 括： 将下调An-Ι基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入禾谷类作物中；较佳地，所 述的下调剂是特异性干扰An-Ι基因转录的干扰分子。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的干扰分子是以An-Ι基因或其转录本 为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、 反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3作为沉默靶标的dsRNA或构建物。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：提高禾谷类作物中An-1基 因的表达，从而： 增加种子的粒长； 减少每穗种子颗粒数； 减少每穗枝梗数； 增加种子的芒长；和/或 增加种子的有芒率。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：将An-Ι基因转入禾谷类作物，获得转 化的禾谷类作物。
9. 一种An-Ι基因的用途，用于调控禾谷类作物农艺性状或产量性状；所述的农艺性状 包括：芒性状、种子形态、种子数量性状、穗型结构。
10. -种An-Ι基因的用途，用于作为鉴定禾谷类作物农艺性状或产量性状的分子标 记；所述的农艺性状包括：芒性状、种子形态或饱满度性状、种子数量性状、穗型结构。
11. 一种降低An-ι基因表达的物质，其特征在于，所述物质含有式（I)所示的结构： Seq正向_x_Seq反向 式（I)， 式（I)中，Seq^^jSSEQ ID N0:5所示的多核苷酸，Seq^^为与互补的多核苷酸； 和 X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seq &@不互 补。
12. -种降低An-Ι基因表达的物质的用途，用于调控植物农艺性状或产量性状；包 括： 增加产量； 降低粒长； 增加每穗种子颗粒数； 增加每穗枝梗数； 缩短种子的芒长；和/或 减少种子的有芒率。
【文档编号】C12N15/82GK104278051SQ201310287408
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月9日 优先权日:2013年7月9日
【发明者】韩斌, 刘惠, 罗江虹, 周桃英, 顾本国, 朱静洁, 上官颖颖 申请人:中国科学院上海生命科学研究院