一种耐酸铝的细菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐酸铝的细菌菌株，该菌株属于β变形杆菌亚门(β-proteobacteria)伯克氏菌属(Burkholderia?sp.)，命名为Burkholderia?sp.SB1，并于2013年9月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC?No.8396；其有益效果是，该菌株表现出比较强的耐酸铝性能，对铝有较强的吸附作用，可为进一步利用该菌株对被铝污染的土壤的改良提供了良好的微生物材料。
【专利说明】一种耐酸铝的细菌菌株
【技术领域】:
[0001]本发明涉及微生物领域的细菌，具体地说是一种耐酸铝的细菌菌株。
【背景技术】:
[0002]铝是生物正常生长的非必需元素，在微酸性和中性土壤中，铝主要以三价氧化态和稳定的矿物质形式存在，表现出极低的生物有效性。但是，随着土壤pH的降低，铝可逐渐解离，以离子态释放到土壤溶液中，成为有活性的单体形式(monomeric Al)，对土壤生物存在非常大的毒害作用。近年来，随着酸性沉降和化学肥料的大量使用，酸性红壤中活性铝浓度呈持续升高趋势，已严重影响到农作物的生长。这种污染现状，已引起了学术界广泛的关注。
[0003]如何降低土壤中铝的毒害，提高农作物的产量、减少其对其他环境的危害，一直是红壤区域综合治理与生态恢复技术研究中的一个重要课题。传统上，人们常用石灰和肥料等对土壤进行改良，旨在为作物生长创造适宜的土壤条件。施用石灰和肥料虽能减轻或防治表土的酸铝所产生的作物生长障碍问题，但对于深底层土壤施用石灰或肥料既有困难也不经济，而且这些措施需要投入大量的人力、物力和财力，且不能一劳永逸，难以取得良好的经济效益和生态效益。
[0004]近年来，随着 一些耐铝微生物的发现，将驯化时间短、铝离子吸附快、环境适应性强的微生物用于红壤铝毒的改良已日益受到人们的关注。
【发明内容】
:
[0005]本发明要解决的技术问题是，寻找分离出一种耐酸铝的微生物细菌菌株。
[0006]本发明的技术解决方案是，在红壤土中分离出一种耐酸铝的细菌菌株，该菌株属于β变形杆菌亚门(β-proteobacteria)伯克氏菌属(Burkholderia sp.),命名为Burkholderia sp.SBl,并于2013年9月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为:CGMCC N0.8396。
[0007]该菌株的生物学特性为:革兰氏阴性，最适宜在pH值为5.0，温度为37°C环境下生长；有较强的耐酸性；具有对氨苄青霉素、四环素以及硫链霉素的联合抗性。该菌在生长初期，高浓度铝会影响细菌的生长，但在其生长中后期表现出很强的耐铝能力，明显表现出对铝的吸附特性。
[0008]本发明所涉及的耐酸铝的细菌菌株是通过以下方法分离筛选得到的:
[0009](I)在江西省吉安市境内采集的新鲜红壤土样本，在样本内取5g鲜土加入IOmL无菌水配成土壤溶液；取ImL 土壤溶液于99mL灭菌GM液体培养基中，并在培养基中添加50 μ L lmol/L无菌AlCl3.6H20溶液、放置温度37°C，振动频率为260rpm/min振荡培养箱中培养15h。
[0010](2)取步骤⑴中获得的菌液lmL，加到装有灭菌的99mL液体GM培养基的250mL锥形瓶中，培养基中外加IOOuL lmol/L AlCl3.6H20溶液，放置温度为37°C，振动频率为260r/min振荡培养箱中培养15h。
[0011](3)取步骤⑵中获得的菌液5份，每份各lmL，分别加到装有灭菌的99ml液体GM培养基的250mL锥形瓶中，每份培养基中外加铝浓度分别为2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/LU0mmol/L AlCl3.6H20溶液，并依次编号为1_5号样本，放置温度37°C，振动频率为260rpm/min振荡培养箱中培养15h。
[0012](4)对步骤(3)中的获得的5份富集菌液，各取出ImL建立5份菌液样本，并分别对这5份菌液进行梯度稀释，稀释梯度依次为原液、10_1、10_2、10_3、10_4;并相应编号为1-5号样本，对稀释后的5份菌液，各取0.1mL所得的稀释液分别涂布于含有与步骤(3)相对应的铝浓度的GM固体培养基平板上，在温度为37°C环境下培养2d。结果在涂布在GM固体培养基平板上的3-5号样本没有发现 单菌落，而在1-2号样本中分离筛选出本发明Burkholderia sp.SBl0
[0013](5)用已灭菌的移液枪头从2号样本中挑取8个较大而且独立的菌落，分别划线于8个含铝浓度为4mmol/L AlCl3.6Η20的平板上，在温度37°C环境下培养2d。将纯化后的单菌于含4mmol/L Al3+浓度培养基中扩大培养。获得菌液部分保种于_80°C冰箱内，部分保存于4°C冰箱内用于后续实验。
[0014]本发明具有以下优点:该菌株表现出比较强的耐酸铝性能，对铝有较强的吸附作用，可为进一步利用该菌株对被铝污染的土壤的改良提供了良好的微生物材料。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1为本发明一种耐酸铝的细菌菌株利用16SrDNA同源序列和邻接法(Neighbor-Joining)构建的系统发育树图；
[0016]图2为本发明一种耐酸铝的细菌菌株在不同铝处理浓度细菌SBl生长的影响曲线对比图；
[0017]图3为本发明一种耐酸铝的细菌菌株pH对菌株SBl生长的影响柱状对比图；
[0018]图4为本发明一种耐酸铝的细菌菌株细菌的抗药性分析对比图；
[0019]图5为本发明一种耐酸铝的细菌菌株不同温度对细菌生长的影响对比分析图；
[0020]图6为本发明一种耐酸铝的细菌菌株菌株SBl对铝的吸附柱状对比图。
【具体实施方式】:
[0021]下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此。
[0022]实施例一菌株SBl的分离:
[0023](I)于江西省吉安市境内采集新鲜红壤土样本，该土壤样本的基本理化性质为pH:4.46,包含有 OM/:17.8g/kg \ AN/:127.5mg/kg S AP/:4.05mg/kg \ AK/:48.5mg/kg SEC/0.15dS/m 1, Monomeric Al:42.6 μ mol/L。在样本内取 5g 鲜土加入 IOmL 无菌水配成土壤溶液；取ImL 土壤溶液于99mL灭菌GM液体培养基中。随后在培养基中添加50 μ L lmol/L无菌AlCl3.6H20溶液、置37°C、振动频率为260rpm/min振荡培养箱中培养15h。
[0024]上述GM培养基为:葡萄糖10g，蛋白胨0.5g，酵母提取物0.2g，硫酸镁(MgSO4.7H20) 0.2g，定容至 1000mL, ρΗ5.0 的溶液瓶内。
[0025](2)取步骤⑴中获得的菌液lmL，加到装有灭菌的99ml液体GM培养基的250mL锥形瓶中，培养基中外加lOOuLlmol/L AlCl3.6H20溶液，置入温度为37°C，振动频率为260rpm/min振荡培养箱中培养15h。
[0026](3)取步骤⑵中获得的菌液5份，每份各lmL，分别加到装有灭菌的99ml液体GM培养基的250mL维形瓶中，每份培养基中分别外加2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、IOmmoI/L AlCl3.6H20的铝浓度液，并依次编号为1_5号样本，置入温度为37°C，振动频率为260r/min的振荡培养箱中培养15h。
[0027](4)对步骤(3)中获得的5份富集菌液，各取出ImL建立5份菌液样本，并相应编号为1-5号，对这1-5号的5份菌液样本分别进行梯度稀释，稀释梯度依次为原液、10'10_2、10_3、10_4 ;对稀释后的5份菌液各取0.1mL分别涂布于含有与步骤(3)中相应铝浓度2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L AlCl3.6H20 的 GM 固体培养基平板上，在 37°C温度环境下培养2d。结果在3-5号菌液内没有发现单菌落，而在1-2号菌液内发现有单菌落。
[0028]上述GM固体培养基为在GM液体培养基内加入1.5%琼脂粉而成。
[0029](5)用已灭菌的移液枪头从步骤⑷中的2号菌液，即铝浓度为4mmol/L的GM固体培养基平板上挑取8个较大而且独立的菌落，分别划线于8个含4mmol/L AlCl3.6H20的平板上，在37°C温度环境下培养2d。将纯化后的单菌于含4mmol/LAl3+浓度培养基中扩大培养。获得菌液部分保种于-80°C冰箱，部分用于后续实验。
[0030]实施例二菌 株SBl的培养及分子鉴定:
[0031](I)运用巢式PCR(nested-PCR)对8株菌的16S rDNAs进行扩增。方法如下:
[0032]第一轮反应(体积25 μ L)含I μ L(大约lng)DNA为模板,0.5 μ L引物(10 μ Μ),2 μ L 的 dNTP 混合物(2.5mM)试剂，1.5 μ L MgCl2 (25mM) ,2.5μ LlOX PCR 反应缓冲液和0.2 μ LTaq DNA聚合酶(5U/μ L，Takara公司)。第一轮反应的引物为:27f(5' -AGAGT TTGATCCTGG CTCAG-3')和 1492r (5' -TACCT TGTTA CGAC TT-3' )。PCR 反应程序为:94°C预变性 5min，94°C 30s，55°C 40s，72°C lmin，共 10 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。第二轮反应以第一轮反应的PCR产物为模板，引物为:63f (5' -CAGGC CTAAC ACATG CAAGT CS')和1389r(5/ -ACGGG CGGTG TGTAC AAG-3 ^ )。在这一轮反应中，设置30个循环，反应条件同第一轮反应。PCR结束后，产物用含I %溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳、检测(大约1300bp长度的片段为目标片段)。
[0033](2)将巢式PCR产物分别用限制性内切核酸酶HhaI和RsaI消化(37°C，Ih)。酶切DNA片段用2 %的琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色和凝胶成像系统成像后，所得DNA带型图谱在GIS凝胶分析软件辅助下进行人工比较分析。以基因片段多态图谱为基础进行聚类，聚合到一起的具有相同图谱的克隆视为相同的基因型。每一个基因型作为一个分类操作单位(0TU, Operational Taxonomic Unit)或称为唯一基因型。
[0034](3)将16S rDNA PCR产物用I %的琼脂糖凝胶电泳分离并用琼脂糖凝胶分离纯化试剂盒进行纯化。通过TA克隆技术将纯化后的16S rDNA片段转化到E.coli DH5 α中，氨苄青霉素及蓝白斑筛选挑取阳性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。测序结果与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行比对分析，获得最相近菌株的16SrDNA序列。通过MEGA 5.0软件，用Neighbor-joining构建系统发育进化树。见附图1。
[0035](4) RDP聚类分析表明菌株SBl属于β变形杆菌亚门(β-proteobacteria)伯克氏菌属(Burkholderia sp.),相似性为 99%。菌株命名为 Burkholderia sp.SBl。[0036]实施例三菌株SBl在不同铝胁迫浓度下的生长实验:
[0037]取保存于_80°C冰箱中的菌液30 μ L分别接种于铝处理浓度为:0、l、2、3、4mmol/LAlCl3.6H20的3mL新鲜GM培养基的试管中，的试管中，并将试管置入温度37°C、振动频率为260r/min振荡培养箱中培养15h。且每个铝处理浓度设置12组重复，对每组试管菌液每隔2小时分别取样(以不接菌的培养基为对照)，测定其0D600值，绘制SBl菌株的生长曲线。结果显示:在细菌生长的初期铝的加入会影响细菌的生长，浓度越高细菌进入指数生长期的时间会延长。在细菌生长后期，铝浓度对细菌种群数量的影响不大。低浓度的反而表现出一定的促进作用。可见，铝对菌株SBl生长的影响主要发生在其生长初期。见附图2。
[0038]实施例四菌株SBl耐酸性实验:
[0039]取保存于4 °C冰箱中的菌液30yL分别接种于不同pH值且均含2mmol/LAlCl3.6H20的3mL新鲜LB培养基的试管中(ρΗ4.2)，于37°C、260r/min振荡培养14h。pH值设为:2.2,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,4.0,4.2。14小时后取样，测定其0D600值。结果表明:pH每降低一个单位，细菌生长会受到显著影响，pH3.2是SBl在铝含量为2mmol/L培养液中的极限pH。此外，我们以不加铝为对照，发现SBl在无铝的培养液中的生长情况更好。可见，SBl具有很强的耐酸性，当铝不存在的情况下细菌能在pH2.2的培养液中生长。然而，铝的存在会增加酸对细菌生长的毒害作用。见附图3。
[0040]实施例五菌株SBl的抗药性实验:
[0041]取保存于4°C冰 箱中的菌液30 μ L接种于含2mmol/LAlC13.6H20的3mL新鲜LB培养基的试管中(PH4.2)。设5个实验组；以不加铝和加铝不加抗生素为二个对照组，共7组。往5个实验组分别加入相同浓度不同的抗生素(氨苄青霉素Amp、盐酸四环素Tm、硫链霉素Str、氯霉素Cm)及抗生素组合(氨苄青霉素Amp、盐酸四环素Tm、硫链霉素Str)，于37°C、260r/min振荡培养14h。14小时后取样0，测定其0D600值。结果表明(表2) =SBl表现出对Amp、Str和Tm三者的联合抗性。在铝存在时，这种抗性效应依然存在。由此可以推测SBl应该携带有Amp、Str和Tm抗性基因。此外，SBl还表出对Cm的敏感性。见附图4。
[0042]实施例六菌株SBl的温敏感性实验:
[0043]取30 μ L保存于4°C冰箱中的菌液接种含2mmol/L AlCl3.6H20的3mL新鲜LB培养基的试管中(PH4.2)。共设4个不同温度(25°C、37°C、45°C、55°C )的实验组，各实验组分别以不添加抗生素为对照，共8组。于相同转速(260r/min)振荡培养14h，14小时后取样，测定其0D_值。结果表明(表1):细菌最适的生长温度应该为37°C。高温显著抑制细菌的生长，细菌在45°C条件下培养以表现出显著的抑制作用，当温度上升至55°C时，细菌的生长几乎完全停止。而且，从实验结果还可以看出高温对细菌生长的抑制作用与抗生素的存在无直接关系。此外，适当的低温条件对菌体生长的影响不大。实验表明，细菌在25°C和37°C条件下培养，细菌的生长几乎没有影响。具体见附图表5。
[0044]实施例七菌株SBl的铝吸附能力实验:
[0045]取保存于4°C冰箱中的菌液5份，每份为1.5mL，分别接种于铝处理浓度分别为:0、
l、2、3、4mmol/L A1C13.6H20的150mL新鲜LB培养基的500mL锥形瓶中，每个浓度设置3组重复，置入温度为37°C、振动频率为260r/min振荡培养14h。14小时后分别收集滤液和菌体(于105°C烘干)备用。[0046]将收集的滤液及烘干称重后的菌体用于铝含量的测定。铝含量的测定方法采用ICP-MS法(ELAN9000，美国Perkin-Elmer公司)，样品处理参考史芳亮等(2008)的进行。铝工作标准溶液的配制，根据样品中铝含量配制工作标准溶液，用去离子水稀释，配制成系列工作标准溶液。内标溶液稀释，用1%硝酸将内标溶液稀释至1.0yg*mL-l，测定时在线加入与工作标准溶液或供试品溶液混合进入ICP-MS，测定时选择Li (6)为内标元素。仪器参数设定为功率:1.35kW，载气流速:1.18L.min-1，采样深度:7mm，分析模式:全定量。 [0047]铝吸附量的计算方法:用上清液中测定的铝离子浓度，除以菌体的干重，即得总吸附量ql (mg/g),方法如下:ql = (c0_cl) V/W*1000。c0和cl别为吸附实验初始招离子浓度和取样时间点时铝离子的浓度(mg/L)…为培养液的体积(mL);胃为取样时间点时菌体的干重(g)。
[0048]从附图6可以看出，随着铝处理浓度的升高，菌株SBl对铝的吸附量增多，铝的吸附值从0.03增加到1.68mg/Kg,溶液中的招含量有下降的趋势。说明本发明Burkholderiasp.SBl对铝具有一定的吸附作用。然而，在高浓度下，细菌对铝的吸附很快达到饱和。见附图6。
【权利要求】
1.一种耐酸招的细菌菌株，该菌株属于β变形杆菌亚门(β-proteobacteria)伯克氏菌属(Burkholderia sp.),命名为Burkholderia sp.SBl,并于2013年9月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为=CGMCC N0.8396。
【文档编号】C12R1/22GK104017745SQ201310751019
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】贺根和, 林俊岳, 吴吉春, 张友海 申请人:井冈山大学