使用改进量的氯和钾在微藻类中产生高水平的dha的制作方法
【专利摘要】本发明公开了通过海洋微生物，包括异养的海洋沟鞭藻类隐甲藻，使用低水平的氯离子产生高度不饱和的脂肪酸的方法。具体地，通过控制钠离子和钾离子水平在低氯培养基中生长海洋微生物增加高度不饱和的脂肪酸产量的方法。本发明也涉及通过海洋生物在低pH水平产生高度不饱和的脂肪酸的方法，并包括产生耐受低pH的菌株的方法。
【专利说明】使用改进量的氯和钾在微藻类中产生高水平的DHA
[0001]本申请是申请日为2004年10月I日、申请号为200810166137.9、题目为“使用改
进量的氯和钾在微藻类中产生高水平的DHA”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明主要涉及通过海洋微生物在培养基中使用改进量的氯和钾离子产生高度不饱和的脂肪酸的方法。更具体地，本发明直接涉及通过培养海洋微藻类(miCToalage)，包括异养的海洋沟鞭藻类，隐甲藻(Crypthecodinium),在发酵罐中在无腐蚀性的条件下产生高水平的二十二碳六烯酸(DHA)的方法，包括在低氯离子和高钾离子环境中培养。本发明也涉及通过海洋微生物在低pH水平产生高度不饱和的脂肪酸，包括DHA的方法。
【背景技术】[0003]已充分证明增加人体内长链omega-3脂肪酸的饮食摄入量的有益效果，所述有益效果包括减少心血管疾病(cardiovascular)和炎性疾病(inflammatorydiseases)(即关节炎(arthritis)和动脉粥样硬化(atherosclerosis))，减少抑郁(depression),增加在妊娠末三个月的怀孕期(gestation)长度，和抑制肿瘤生长。已发现几种异养的海洋微生物产生高水平的这些重要的必需脂肪酸，所述海洋微生物包括隐甲藻属的海洋微生物(Jiang和Chen, Process Biochemistry35 (2000) 1205-1209;Jiang 和 Chen, Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology, (1999)Vol.23, 508-513;Vazhappilly 和 Chen,Journal of the American Oil ChemistsSociety, (1998)Vol.75, N0.3p393-397;Kyle,美国专利 N0.5，407，957 ;美国专利N0.5，397，591 ;美国专利 N0.5，492，938 ;和美国专利 N0.5，711，983)。
[0004]寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)是用于产生DHA(C22:6n_3)的最理想的生物体之一，所述的DHA是最重要的长链omega-3脂肪酸之一。C.cohnii是有利的因为DHA是唯一的通过此生物体以可感知的(appreciable)量产生的多不饱和脂肪酸(PUFA)。其他生物体在它们的脂质中产生两种或更多的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，而且它们的脂质分布(profile)的复杂性可限制它们的油在一些食物和药物应用中的用途(例如由于在油中存在其他不合需要的PUFAs或由于不同的PUFAs的比例落于具体应用的理想范围之外)。在海洋环境中，寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)通常存在于满盐度(fullsalinity)海水中并且，同样地适于在具有高氯浓度的环境中生长。实际上，在已发表的关于C.cohnii的研究中大多数培养物显示生长和DHA生产在盐度大于海水的大约20%中最佳(Jiang和Chen)。相当于20%海水的氯离子浓度为大约3870ppm氯离子或3.87g/l氯离子(Horne1969)。
[0005]Tuttle和Loeblich (1975)开发了 C.cohnii的最佳的生长培养基。所公开的培养基包含342毫摩尔(mM)的氯化钠浓度。在342mM氯化钠溶液中钠离子和氯离子的等效的克每升为7.86g/L钠尚子和12.12g/L的氯尚子。
[0006]BeachMtolz (1973)报道当在NaCl浓度的范围中(0.3%、1.8%和5.0%(分别为1.82g/l、10.9g/l和30.3g/l氯离子))培养C.cohnii时，脂质产量(表示为mg每IO9个细胞)随着NaCl浓度减少而下降。在0.3%NaCl的脂质产量为在5.0%NaCl的脂质产量的大约三分之一。新近，Jiang和Chen (1999)用三种寇氏隐甲藻菌株测定了盐度对于细胞生长和DHA含量的影响，并发现在所有情况下，最佳的细胞生长速率和DHA产量为5g/L至9g/L氯化钠，其分别对应于3.0和5.5g/L氯离子。
[0007]海水的天然氯浓度(19，353ppm或19.35g/l氯离子)(Hornel969, 151页)加速不锈钢发酵罐中的腐蚀。例如，在用于制造发酵罐的两种普通等级的不锈钢中，当氯水平超过300ppm(0.3g/l氯离子)时304-不锈钢是容易腐蚀的,且当氯水平超过1000ppm(lg/Ι氯离子)时316-不锈钢是容易腐蚀的。存在其他等级的对氯腐蚀更有抵抗力的不锈钢，但它们非常昂贵且通常只用于生产非常贵重的化合物的发酵设备。
[0008]虽然可以预测通过降低培养基中的氯浓度可以使不锈钢发酵罐的腐蚀实现最小化，但是实际上这并不是简单的任务。当源自大海的海洋微藻类在培养物中生长时，通常需要一定量的氯离子，优选如氯化钠，以保持生长和脂质产生。
[0009]然而，至今在低氯浓度生长海洋微藻类同时保持omega-3多不饱和的脂肪酸如DHA的产生水平的尝试还不成功。Jiang和Chen (1999)不能证明在NaCl水平小于5g/L，对应于大约3033ppm或3g/L的氯水平时显著的DHA产量。
[0010]2002年6月25日颁布给Barclay的美国专利N0.6，410，281提供了在低氯培养基中在降低氯化钠水平时通过以非氯化物钠盐取代以补偿钠的损失而生长广盐性生物(euryhaline organism)如破囊壶菌属菌种(Thraustochytrium sp.)和 Schizochytriumsp.的方法
[0011]需要能由寇氏隐甲藻产生高产量DHA，同时抑制或防止在商业上最理想的生产容器，不锈钢发酵罐中腐蚀的方法。此方法必须能使所述微生物在含有优选小于300ppm氯的培养基中有效地生长。三百ppm氯代表比由Jiang&Chen(1999)证明的对隐甲藻的菌株的生产反而更好的最低氯水平低10-18倍的水平。
[0012]微生物发酵的另一个理想的特性是在低pH(小于或等于大约pH=5.0)生长细胞以抑制真菌发酵中细菌生长的能力。然而，文献表明隐甲藻在中性PH(大约pH7)生长最佳。Tuttle 和 Loeblich 在 Phycologia Vol.14 (I) 1-8 (1975)中，公开了隐甲藻生长的最适 pH为6.6，而低于pH5.5生长是“非常慢”的。需要在低pH生长隐甲藻同时保持正常生长和DHA产生的菌株(strain)和/或方法。
【发明内容】
[0013]在隐甲藻用的培养基中最小化氯化钠水平的尝试中，其中氯化钠导致腐蚀发酵罐的问题，本发明人令人惊讶地发现可以通过在培养基中控制钠盐和优选钾盐以补偿氯离子的减少(降至300ppm或0.3g/L氯离子)而降低氯化钠水平，同时保持与在大约4.5g/LNaCl (对应于2.73g/l氯离子)所获得的相似的DHA产量。
[0014]本发明人已确定了培养条件，所述培养条件允许隐甲藻在具有显著降低的氯水平(降至大约0.3g/l氯离子)的培养基中生长而当与在正常的“高氯”培养基中的生长进行比较时没有对干重、脂肪含量或DHA含量的不良影响。获得可比较的DHA产量不仅仅是在培养基中用其他钠盐代替氯化钠的问题。实际上，用来自其他钠盐(即硫酸钠)的等量(equivalent amount)的钠代替氯化钠不导致与高氯对照情况可比较的DHA产量,却实际上导致培养物的DHA产量进一步降低。然而本发明人令人惊讶地发现当钾浓度(相对于在
4.5g/l NaCl的海水中或17%的海水中)显著增加时得到最佳的DHA产量。出乎意料，钠量的基本减少和钾浓度的增加在补偿培养基的氯含量减少中是有效的。
[0015]在一个实施方案中，本发明包括在培养基中通过培养甲藻纲(Dinophyceae)的异养的微藻类(heterotrophic microalage)产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法。所述培养基包含浓度小于或等于大约2g/l的氯离子和浓度大于或等于大约0.25g/l的钾离子。在此实施方案中，所述微藻类产生至少大约0.04g DHA每升7天培养物(0.04g DHA per literof7day culture)。7天培养物通常具有大约5xl06个细胞/ml或大约5xl09个细胞/升。因此，在第?天具有大约0.2g/l DHA的培养物含有大约0.04gDHA/109个细胞。在优选的实施方案中，所述微藻类是隐甲藻属的。更优选的微藻类是寇氏隐甲藻。优选地，氯离子的浓度为小于或等于大约lg/Ι，甚至更优选小于或等于大约0.3g/l。优选地，钾离子为大于或等于大约0.4g/l，并甚至更优选等于或大于大约0.8g/l。优选地，钾离子的来源是硫酸钾。在优选的实施方案中，培养基还包含钠离子的来源以使钠离子浓度为大约lg/Ι至大约Sg/I。更优选地，钠离子为大约1.5g/l至大约5g/l。钠离子的优选的来源是硫酸钠。通过此方法产生的生物量(biomass)包含于本发明中。
[0016]在另一个实施方案中，本发明包括在培养基中通过培养甲藻纲的异养的微藻类产生DHA的方法。所述培养基包含浓度小于或等于大约2g/l的氯离子，浓度大于或等于大约
0.25g/l的钾离子和以钠:钾小于或等于大约27:1重量比的比例存在的钠离子。在此实施方案中，所述微藻类产生至少大约0.2g DHA每升7天培养物或0.04g DHA/109个细胞。在优选的实施方案中，所述微藻类是隐甲藻属的。更优选的微藻类是寇氏隐甲藻。优选地，氯离子浓度为小于或等于大约lg/Ι，甚至更优选小于或等于大约0.3g/l。优选地，钾离子为大于或等于大约0.4g/l，和甚至更优选为等于或大于大约0.8g/l。优选地，钾离子的来源是硫酸钾。所述培养基还包含钠离子的来源以使钠离子以小于钾离子重量的27倍(重量)(表示为27:1的钠:钾重量比)的比例存在于培养基中。在优选的实施方案中，钠:钾比例为小于大约15:1。更优选的是大约4:1的钠:钾比例。钠离子的优选的来源是硫酸钠。通过此方法产生的生物量包含于本发明中。
[0017]本发明人也已确定了培养基条件和菌株，所述培养基条件和菌株允许隐甲藻在具有显著降低的PH水平的培养基中生长，同时仍保持商业上可实现的生长速率和脂质，包括DHA的生产。在另一个实施方案中，本发明包括在培养基中通过培养甲藻纲的异养的微藻类产生DHA的方法，其中所述培养基具有低于大约6的pH，而且其中所述微藻类产生至少大约
0.04g DHA/109个细胞。所述培养基可进一步包含浓度小于或等于大约2g/l的氯离子，浓度大于或等于大约0.25g/l的钾离子和以钠:钾小于或等于大约27:1重量比的比例存在的钠离子。在此实施方案中，所述微藻类产生至少大约0.04g DHA/109个细胞。在优选的实施方案中，所述微藻类是隐甲藻属的。更优选的微藻类是寇氏隐甲藻。在优选的实施方案中，PH小于或等于大约pH5.5，更优选小于或等于大约5.0，和甚至更优选小于或等于大约
4.5。在优选的实施方案中，所述培养基还包含小于或等于大约2g/l，优选小于或等于大约lg/Ι，甚至更优选小于或等于大约0.3g/l的氯离子浓度。所述培养基也包含浓度大于或等于大约0.25g/l，大于或等于大约0.4g/l，和甚至更优选大于或等于大约0.8g/l的钾离子。优选地，钾离子的来源是硫酸钾。在优选的实施方案中，所述培养基还包含钠离子的来源以使钠离子浓度为大约lg/Ι至大约8g/l。更优选地,钠离子为大约1.5g/l至大约5g/l。钠离子的优选的来源是硫酸钠。通过此方法产生的生物量包含于本发明中。
[0018]本发明也包括选择甲藻纲的耐受低pH的异养的微藻类的方法，其包括将所述的微藻类在低pH培养基中传代培养(subculture)直到DHA的产量大于或等于大约0.04gDHA/109个细胞。在优选的实施方案中，pH小于或等于大约6，小于或等于大约5，小于或等于大约4.5。通过此方法产生的微藻类和生物量包含于本发明中。
[0019]本发明包含如下内容:
[0020]实施方式1.通过在培养基中培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培养基包含:
[0021](a)浓度小于或等于大约2g/l的氯离子；和
[0022](b)浓度大于或等于大约0.25g/L的钾离子；
[0023]其中所述微藻类产生至少大约0.04g DHA每IO9个细胞。
[0024]实施方式2.实施方式I的方法，其中所述微藻类是隐甲藻属的。
[0025]实施方式3.实施方式I的方法,其中所述微藻类是寇氏隐甲藻菌种的。
[0026]实施方式4.实施方式I的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约1.0g/1。
[0027]实施方式5.实施方式I的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约0.3g/l。
[0028]实施方式6.实施方式I的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.4g/L。
[0029]实施方式7.实施方式I的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.8g/L。
[0030]实施方式8.实施方式I的方法，其中钾离子的来源是硫酸钾。
[0031]实施方式9.实施方式I的方法，其中培养基进一步包括浓度为大约lg/L至大约8g/l的钠离子。
[0032]实施方式10.实施方式9的方法，其中钠离子的浓度为大约1.5g/l至大约5g/L。
[0033]实施方式11.实施方式9的方法，其中钠离子的来源是硫酸钠。
[0034]实施方式12.实施方式9的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L和钠离子的浓度为大约3.2g/L。
[0035]实施方式13.通过实施方式I的方法产生的生物量。
[0036]实施方式14.实施方式I的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.1Og DHA每IO9个细胞。
[0037]实施方式15.实施方式I的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.20g DHA每IO9个细胞。
[0038]实施方式16.实施方式I的方法，还包括从所述微藻类中回收含DHA的脂质。
[0039]实施方式17.通过在培养基中培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培养基包含:
[0040](a)浓度小于或等于大约2g/l的氯离子； [0041](b)浓度大于或等于大约0.25g/L的钾离子；和
[0042](c)钠:钾比例为小于或等于大约27:1重量比的钠离子；
[0043]其中所述微藻类产生至少大约0.04g DHA每IO9个细胞。
[0044]实施方式18.实施方式17的方法,其中所述微藻类是隐甲藻属的。[0045]实施方式19.实施方式17的方法,其中所述微藻类是寇氏隐甲藻菌种的。
[0046]实施方式20.实施方式17的方法，其中钾离子的来源是硫酸钾。
[0047]实施方式21.实施方式17的方法，其中钠离子的来源是硫酸钠。
[0048]实施方式22.实施方式17的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约1.0g/1。
[0049]实施方式23.实施方式17的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约0.3g/l。
[0050]实施方式24.实施方式17的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.4g/L。
[0051]实施方式25.实施方式17的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.8g/L。
[0052]实施方式26.实施方式17的方法，其中钠:钾比例为小于或等于大约15:1重量比。[0053]实施方式27.实施方式17的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L而钠:钾比例为大约4:1重量比。
[0054]实施方式28.通过实施方式17的方法产生的生物量。
[0055]实施方式29.实施方式17的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.1Og DHA每IO9个细胞。
[0056]实施方式30.实施方式17的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.20g DHA每IO9个细胞。
[0057]实施方式31.实施方式17的方法，还包括从所述微藻类中回收含DHA的脂质。
[0058]实施方式32.通过在培养基中培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述培养基具有小于大约6.0的pH，和其中所述微藻类产生至少大约
0.04gDHA每升7天培养物。
[0059]实施方式33.实施方式32的方法，其中所述微藻类是隐甲藻属的。
[0060]实施方式34.实施方式32的方法,其中所述微藻类是寇氏隐甲藻菌种的。
[0061]实施方式35.实施方式32的方法,其中pH小于或等于大约5.5。
[0062]实施方式36.实施方式32的方法，其中pH小于或等于大约5.0。
[0063]实施方式37.实施方式32的方法，其中pH或等于大约4.5。
[0064]实施方式38.实施方式32的方法,其中所述培养基进一步包括:
[0065](a)浓度小于或等于大约2g/l的氯离子；和
[0066](b)浓度大于或等于大约0.25g/L的钾离子。
[0067]实施方式39.实施方式38的方法，其中氯离子的浓度为小于或等于大约1.0g/1。
[0068]实施方式40.实施方式38的方法，其中氯离子的浓度为小于或等于大约0.3g/l。
[0069]实施方式41.实施方式38的方法，其中钾离子的浓度为大于或等于大约0.4g/L。
[0070]实施方式42.实施方式38的方法，其中钾离子的浓度为大于或等于大约0.8g/L。
[0071]实施方式43.实施方式38的方法，其中钾离子的来源是硫酸钾。
[0072]实施方式44.实施方式38的方法，其中培养基进一步包含浓度为大约lg/L至大约8g/l的钠离子。
[0073]实施方式45.实施方式44的方法，其中钠离子的浓度为大约1.5g/l至大约5g/L。
[0074]实施方式46.实施方式44的方法，其中钠离子的来源是硫酸钠。
[0075]实施方式47.实施方式44的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L，钠离子的浓度为大约3.2g/L且pH为大约5.0。[0076]实施方式48.实施方式44的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L，钠离子的浓度为大约3.2g/L且pH为大约4.5。
[0077]实施方式49.通过实施方式32的方法产生的生物量。
[0078]实施方式50.实施方式32的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.1Og DHA每IO9个细胞。
[0079]实施方式51.实施方式32的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.20g DHA每IO9个细胞。
[0080]实施方式52.实施方式32的方法，还包括从所述微藻类中回收含DHA的脂质。
[0081]实施方式53.选择耐受低pH的甲藻纲的异养微藻类的方法，其包括将所述的微藻类在低pH培养基中传代培养直到DHA的产量大于或等于大约0.04g DHA每IO9个细胞。
[0082]实施方式54.实施方式53的方法，其中pH小于或等于大约6。
[0083]实施方式55.实施方式53的方法，其中pH小于或等于大约5。
[0084]实施方式56.实施方式53的方法，其中pH小于或等于大约4.5。
[0085]实施方式57.通过实施方式53的方法产生的生物量。
[0086]通过如下的最佳方式说明、附图和权利要求，本发明的这些和其他目的、特点和优势会变得显而易见。
【专利附图】
【附图说明】
[0087]图1是在ρΗ6.3和3g/l氯离子中(表示为pH6.3SSM)生长的C.cohnii菌株T-HF和适于低pH，在pH5和lg/Ι氯离子中(表示为pH5.0LCSSI)生长C.cohnii菌株T-HF的重复的DHA产量的时间过程图示。
[0088]图2是在ρΗ6.3和3g/l氯离子中(表示为pH6.3SSM)生长的C.cohnii菌株T-HF和适于低pH，在ρΗ4.5和lg/Ι氯离子中(表示为pH5.0LCSSI)生长的C.cohnii菌株T-HF的重复的DHA产量的时间过程图示。
[0089]发明详沭
[0090]本发明解决了前面确定的由于生长甲藻纲的海洋微藻类的高氯化钠水平而引起的发酵罐腐蚀的问题。本发明人发现通过在培养基中使用改进量的氯离子和钾离子发现了培养基组分，所述组分在低氯化钠条件下允许生长商业上可行的水平的甲藻纲的海洋微藻类和产生DHA。更具体地，本发明人已发现由于将氯化钠降低至非-腐蚀的水平而引起的钠的损失可至少部分地通过在培养基中增加钾水平而补偿。 [0091]本发明也解决了前面确定的允许生长甲藻纲的海洋微藻类同时阻碍细菌生长的问题。更具体地，本发明提供培养海洋生物的方法以使它们变为耐受低pH。本发明也提供耐受低PH的上述微生物的菌株。由本发明人提供的耐受低pH的菌株，可在低pH水平生长至细胞稠密(cell densities)并获得DHA产生水平，该DHA产生水平可与在更中性的pH水平生长的菌株获得的DHA产生水平相比较。由于本发明的概念可容易地应用于其他生产生物体和如下详述的其他需要的PUFAs，这只是本发明包含的技术的一个实施例。
[0092]本发明的一个实施方案包括在培养基中通过培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，所述培养基包含如下的组分:浓度小于大约2g/L的氯离子，和浓度大于大约0.25g/L的钾离子，其中所述微藻类产生至少大约0.2g DHA每升7天培养物。所述7天培养物通常具有5xl06个细胞/ml，导致大约0.04g DHA/109个细胞。在优选的实施方案中，所述异养的微藻类产生至少大约0.04g DHA/109个细胞，至少大约0.06gDHA/109个细胞，至少大约0.08g DHA/109个细胞，至少大约0.1Og DHA/109个细胞，至少大约0.12g DHA/109个细胞，至少大约0.14g DHA/109个细胞，至少大约0.16g DHA/109个细胞，至少大约0.18g DHA/109个细胞，至少大约0.20g DHA/109个细胞，至少大约0.22gDHA/109个细胞，至少大约0.24g DHA/109个细胞，至少大约0.26g DHA/109个细胞，至少大约0.28g DHA/109个细胞，或至少大约0.30g DHA/109个细胞。如本文中使用的，培养基中的营养浓度(neutrient concentration)是指在培养步骤一开始培养基中的营养浓度,其包括从所述方法中之前的阶段，如接种物的制备带来的任何营养物。
[0093]适合于本发明的微生物包括异养的微藻类，其包括甲藻纲成员(沟鞭藻类)。此纲的优选的成员是隐甲藻属的成员。隐甲藻属的优选的成员是C.cohnii。寇氏隐甲藻是专性异养生物(obligate heterotroph),其需要减少的碳源用于生长,并含有脂肪酸分布(profile)，其中DHA是唯一以可感知的量存在的多不饱和脂肪酸。可从许多可公开利用的来源，包括通过从自然环境收集而获得合适的生物体。例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)目前列出了 45株可用的寇氏隐甲藻的菌株,其鉴定为 ATCC Nos.30021、30334-30348、30541-30543、30555-30557、30571、30572、30772-30775、30812、40750、50050-50060和50297-50300。如本文中使用的，任何微生物或生物体的任何具体类型，包括野生菌株、突变体或重组类型。
[0094]除去作为本发明主题并在下面更充分讨论的钠、氯和钾浓度之外，本发明的培养基的其他组分可为本【技术领域】已知的促进生长和以商业上可实用的水平生产DHA的任何组分，并包括如在美国专利5，130，242，美国专利N0.5，407，957，美国专利N0.5，397，591 ；美国专利N0.5，492，938 ;和美国专利N0.5，711，983中公开的那些组分，上述所有专利都全部并入本文作为参考。更具体地，可使用碳源，如葡萄糖、各种淀粉、糖蜜、磨碎的玉米(ground corn)等。培养基中也包括可吸收的(assimilable)有机或无机氮的来源。氮源可包括硝酸盐、尿素、铵盐、氨基酸等。也可提供可吸收的磷的来源。所述培养基也可含有微生物生长因子的来源，该生长因子是未指明的或指明的化合物，其增强单细胞微生物的异养的生长，并可包括酵母或其他提取物，土壤提取物等。C.cohnii和相关生物体的生长培养基的具体实例，例如，可见于Jiang和Chen, Process Biochemistry35 (2000) 1205-1209;Jiang 和 Chen, Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,(1999)Vol.23, 508-513;Vazhappilly 和 Chen, Journal of the American Oil ChemistsSociety, (1998) Vol.75, N0.3p393_397。本发明中使用的优选培养基的具体实施例可见于，例如，本文中下面的实施例部分。
[0095]在本发明的培养基的一个方面，氯离子浓度以小于或等于大约2000ppm或大约2克每升培养物，更优选小于或等于大约1.9g/l，更优选小于或等于大约1.8g/l，更优选小于或等于大约1.7g/l，更优选小于或等于大约1.6g/l，更优选小于或等于大约1.5g/l，更优选小于或等于大约1.4g/l，更优选小于或等于大约1.3g/l，更优选小于或等于大约1.2g/l,更优选小于或等于大约1.lg/Ι,更优选小于或等于大约1.0g/Ι,更优选小于或等于大约0.9g/l,更优选小于或等于大约0.8g/l,更优选小于或等于大约0.7g/l,更优选小于或等于大约0.6g/l，更优选小于或等于大约0.5g/l，更优选小于或等于大约0.4g/l，和最优选小于或等于大约0.3g/l的浓度存在。在可替换的实施方案中,最小氯浓度为至少大约0.025g/l，至少大约0.05g/l，或至少大约0.lg/L.培养基的氯离子组分是优选由氯化物盐得到的，其优选的盐为氯化钠。培养基中氯的其他来源包括氯化钾和氯化钙。氯离子的来源可包括培养基中的多于一种的含氯化合物，并可包括用来调节培养基PH的氢氯酸，以及 MnCl2 和 FeCl3。
[0096]在本发明的培养基的另一个方面，钾离子浓度为大于大约0.25g/L。钾离子通常以低水平存在于海水中，为大约0.38g/l海水。本领域已知的用于生长海洋微藻类的培养基严格(closely)遵循海水的组成，具有通常相同或更少的钾离子水平。例如，Tuttle和Loeblich (1975)公开了 9mM KC1，其相当于大约0.35g/l钾离子。在藻类学方法手册(Handbook of Phycological Methods)(Janet R.Stein, Ed., Cambridge UniversityPress, 1973)中，公开了培养基中的钾离子作为氯化钾为9.83mM，其相当于大约0.36g/l钾离子。在一个实施方案中，本发明包括浓度为大于大约0.39g/l的钾离子。本发明人已发现一旦钾离子大于阈值(threshold level)，培养对于钾离子的精确浓度、在钾离子浓度的范围生长良好且产生商业上可行的水平的DHA相对不敏感。优选地，钾离子浓度的下界为至少大约0.2g/l,至少大约0.25g/l,至少大约0.3g/l,至少大约0.35g/l,至少大约0.4g/I，至少大约0.45g/l,至少大约0.5g/l,至少大约0.6g/l和至少大约0.7g/l。优选地,钾离子浓度的上界为至多大约10g/l，至多大约6g/l，至多大约4g/l，至多大约3g/l，至多大约2.8g/l,至多大约2.6g/l,至多大约2.4g/l,至多大约2.2g/l,至多大约2g/l,至多大约1.9g/l,至多大约1.8g/l,至多大约1.7g/l,至多大约1.6g/l,至多大约1.5g/l,和至多大约lg/Ι。钾离子的最优选的浓度为大约0.75g/l、0.8g/l、0.85g/l、0.9g/l和0.95g/l。钾离子的优选范围为大约0.45g/l至大约1.5g/l ;更优选大约0.5g/l至大约1.2g/l ;更优选大约0.6g/l至大约lg/Ι ;甚至更优选大约0.7g/l至大约0.9g/l ;和最优选大约0.8g/l。
[0097]钾离子的来源可来自适合细胞培养并尤其适合甲藻纲的微藻类的任何钾盐。钾离子可源自培养基中的盐的混合物。优选的钾盐包括氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾等。优选的钾离子来源是硫酸钾。
[0098]在本发明的一个方面，从培养物收获的(at harvest) DHA产量大于不在本发明的培养基中生长的培养物中的DHA产量。在一个实施方案中，使用低氯浓度使用本发明的方法的DHA产量为至少0.2克DHA每升7天培养物或0.04g DHA/109个细胞。
[0099]在本发明的另一个方面，所述培养基也会包含除氯化钠之外附加的钠离子来源。本发明人已发现钠离子水平对于本发明不是关键性的。本发明的海洋生物的培养对于钠离子的精确浓度、在钠离子浓度的范围生长良好且产生商业上可行的水平的DHA相对不敏感。许多不同来源的钠离子适合本发明，其包括硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和乙酸钠。附加的钠离子的优选的来源是硫酸钠。在优选的实施方案中，所述培养基包含至少大约lg/Ι钠离子直至大约8g/l钠离子。在该范围的下界，优选的钠离子浓度为至少大约lg/Ι，至少大约
1.5g/l，至少大约2g/l ，和至少大约2.5g/l。优选地，钠离子浓度的上界为至多大约15g/l，至多大约12g/l,至多大约10g/l,至多大约9g/l,至多大约8g/l,至多大约7g/l,至多大约6g/l,至多大约5.5g/l,至多大约5g/l,至多大约4.5g/l,至多大约4g/l。最优选的钠离子浓度为大约2.75g/l、3g/l、3.25g/l、3.5g/l和3.75g/l。钠离子的优选范围是大约1.5g/l直至大约7.5g/l，甚至更优选的是大约2.0g/Ι直至大约6g/l，和甚至更优选的是大于大约2.5g/l直至大约5g/l。在最优选的实施方案中，钠离子为至少大约3g/l至大约3.5g/l。最优选的钠的水平为大约3.25g/l。如前所述，培养对于钠的精确水平相对不敏感，并由此可使用甚至更高的水平。然而，一旦使用大于大约8g/l的钠水平，培养产量开始轻微下降。
[0100]在另一个实施方案中，本发明包括在培养基中通过培养甲藻纲的异养的微藻类产生DHA的方法。所述培养基包含浓度小于或等于大约2g/l的氯离子，浓度大于或等于大约
0.25g/l的钾离子和以钠:钾小于或等于大约27:1重量比的比例存在的钠离子。在此实施方案中，所述微藻类产生至少大约0.2g DHA每升7天培养物或0.04g DHA/109个细胞。在此实施方案中，所述培养基含有钠离子，其与钾离子的比例小于或等于大约27:1重量比。在海水中，钠离子与钾离子的比例为大约27.3:1。换言之，钠离子的量比钾离子的量高大约27.3倍。在本发明中，发明人已发现相对于钠离子增加钾离子增加了培养物中的DHA产量。优选的钠离子与钾离子的比例为小于或等于大约27:1，小于或等于大约25:1，小于或等于大约23:1，小于或等于大约21: 1，小于或等于大约19:1。更优选的是小于或等于大约17:1，小于或等于大约15:1，小于或等于大约13:1，小于或等于大约11:1的比例。甚至更优选的是小于或等于大约9:1，小于或等于大约7:1，或小于或等于大约5:1的比例。优选的比例为大约4:1。
[0101]在另一个实施方案中，本发明包括在培养基中通过培养甲藻纲的异养的微藻类产生DHA的方法，其中所述培养基具有小于大约6的pH，且其中所述微藻类产生至少大约0.2gDHA每升7天培养物或0.04g DHA/109个细胞。在优选的实施方案中，pH为小于或等于大约5.5,和更优选小于或等于大约5。在优选的实施方案中，pH为小于或等于大约4.5。在优选的实施方案中，所述培养基还包含小于或等于大约2g/l，优选小于或等于大约lg/1，甚至更优选小于或等于大约0.3g/l的氯离子浓度。所述培养基也优选包含浓度大于或等于大约0.25g/l，大于或等于大约0.4g/l，和甚至更优选大于或等于大约0.8g/l的钾离子。优选地，钾离子的来源是硫酸钾。在优选的实施方案中，所述培养基还包含钠离子的来源以使钠离子浓度为大约lg/Ι至大约8g/l。更优选地,钠离子为大约1.5g/l至大约5g/l。优选的钠离子的来源是硫酸钠。通过此方法产生的生物量包含于此实施方案中。
[0102]在另一个实施方案中，本发明包括制备甲藻纲的菌种的耐受低pH的菌株的方法和由此产生的菌株。方法包括低PH培养基的制备和理想的甲藻纲菌种的传代培养直到所述培养产生所需量的DHA。可用如下的方式进行传代培养。将理想的甲藻纲菌种的接种物置于低pH培养基中并允许生长限定的时间，优选7天。此时间长度不是关键性的，但应进行选择以使菌株在到达衰老之前具有足够的时间生长。计算培养物的DHA产量。如果小于所需的量，以如下的方式进行附加的传代培养。制备新鲜的低PH培养基并用低pH培养的培养物接种，而且温育合适的时间。计算培养物的DHA产量。如果DHA产量小于所需的量，重复传代培养直到获得所需的DHA产量。优选的用于选择耐受性的pH为大约6或以下，更优选为大约5.5或以下，甚至更优选为大约5或以下，和甚至更优选为4.5或以下。实施此方法的培养基是本领域已知的PH调节至所需水平的任何培养基。其中进行传代培养的优选的培养基是实施例1中描述的培养基。
[0103]本发明也包括通过本发明的方法之一产生的生物量。
[0104]与本发明的生物体和方法相一致的培养条件可通过本领域已知的方法获得，并包括在美国专利5，130，242，美国专利N0.5，407，957，美国专利N0.5，397，591 ;美国专利N0.5，492，938 ;和美国专利N0.5，711，983中公开的方法，而且本领域的那些技术人员可容易地确定最佳条件。简单地，可在任何合适的发酵罐，优选在搅拌爸(stirred tank)发酵罐或气升式(air lift)发酵罐中完成培养，所述的发酵罐给微生物提供氧的来源。应将微生物的搅拌保持在一定水平以使在溶氧浓度足够支持培养物生长和DHA产生的同时，所述搅拌不剪切或以另外的方式损害微生物。优选的溶氧水平为至少10%的空气饱和水平。更优选地，将溶氧水平保持为大约10%至大约50%的空气饱和水平。
[0105]可在任何维持生命的温度进行培养。通常，微生物将在大约15°C至大约34°C的温度范围生长。优选将温度保持在大约20°C至大约28°C。
[0106]可通过本领域的那些技术人员已知的常规手段收获生物体，所述手段诸如离心、絮凝或过滤，并可立即处理或进行干燥用于将来的加工。无论哪一样都可提取脂质。如本文中使用的，术语“脂质”包括磷脂；游离脂肪酸；脂肪酸的酯类；三酰甘油(triacylglycerol) ; 二酰基甘油酯(diacylglyceride);单酰基甘油酯(monoacy I glyceride);溶血憐月旨(Iysophospholipid);肥阜(soap);憐脂(phosphatide)；固醇(sterol)和固醇酷(sterol ester);类胡萝卜素(carotenoids);叶黄素(xanthophyll)(例如,氧合类胡萝卜素(oxycarotenoids));碳氢化合物(hydrocarbons)；和本领域的普通技术人员已知的其他脂质。如技术人员充分理解的，本发明涉及的DHA可为这些不同脂质的形式，并且不限于游离的脂肪酸。依赖于使用的提取技术，可提取脂质的不同形式或组分。可用有效量的溶剂提取脂质。本领域的那些技术人员可确定合适的溶剂。通常用极性溶剂(例如，氯仿/甲醇)提取极性脂质(例如，磷脂)而且通常用非极性溶剂(例如，己烷)提取中性脂质(例如，三酰甘油)。优选的溶剂是纯己烷。己烷与干生物量(dry biomass)的合适的比例为大约4升己烷每千克干生物量。优选将己烷与生物量在搅拌反应容器在大约50°C的温度混合大约2小时。混合后，将生物量过滤并与含油的己烷分离。通过本领域的那些技术人员已知的蒸馏技术从油中移除己烷。常规的含油种子(oilseed)加工设备适于进行过滤、分离和蒸馏。如果具体应用要求或需要，可进行本领域的那些技术人员已知的附加的加工步骤。在如下的参考文献中描述了脂质回收的可替换的方法，所述参考文献整体并入作为参考:PCT Publication W00176715，题目是“Methodfor the Fractionation of Oil and Polar Lipid-Containing Native Raw Materials”；PCT Publication W00176385,题目是“Method For The Fractionation Of Oil and PolarLipid-Containing Native Raw Materials Using Alcohol and Centrifugation” ；PCTPublication W00153512,题目是“Solventless Extraction Process”。
[0107]本发明，虽然是依据具体的生物体和方法公开的，但意欲包括所有这样的方法和菌株，它们可根据在本文中公开的教导得到而且是有用的，所述的教导包括所有替换、修饰和优化，其对于本领域的普通技术人员来说是可利用的手段。为了说明的目的而不是限制本发明的范围提供了如下的实施例和试验结果。
[0108]实施例1
[0109]此实施例描述了含4.5g/l NaCl的标准筛选培养基(Standard ScreeningMedium) (SSM)的制备。为了制备该培养基，第一步包括将如下化合物加入蒸馏水至90%的最终需要的体积，如表1所示。所有化合物可从Sigma Aldrich, St.Louis, MO得到。
[0110]表1.高压灭菌之前培养基的量和终浓度[0111]
【权利要求】
1.通过在培养基中培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培养基包含: (a)浓度小于或等于大约2g/l的氯离子；和 (b)浓度大于或等于大约0.25g/L的钾离子； 其中所述微藻类产生至少大约0.04g DHA每IO9个细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述微藻类是隐甲藻属的。
3.权利要求1的方法，其中所述微藻类是寇氏隐甲藻菌种的。
4.权利要求1的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约1.0g/1。
5.权利要求1的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约0.3g/l。
6.权利要求1的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.4g/L。
7.权利要求1的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.5g/L。
8.权利要求1的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.8g/L。
9.权利要求1的方法，其中钾离子的来源是硫酸钾。
10.权利要求1的方 法，其中培养基进一步包括浓度为大约lg/L至大约8g/l的钠离子。
11.权利要求10的方法，其中钠离子的浓度为大约1.5g/l至大约5g/L。
12.权利要求10的方法，其中钠离子的来源是硫酸钠。
13.权利要求10的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L和钠离子的浓度为大约3.2g/L。
14.通过权利要求1的方法产生的生物量。
15.权利要求1的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.1Og DHA每IO9个细胞。
16.权利要求1的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.20g DHA每IO9个细胞。
17.权利要求1的方法，还包括从所述微藻类中回收含DHA的脂质。
18.权利要求1的方法，其中pH为小于或等于约5.5。
19.权利要求1的方法，其中pH为小于或等于约5.0。
20.权利要求1的方法，其中pH为小于或等于约4.5。
21.通过在培养基中培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培养基包含: (a)浓度小于或等于大约2g/l的氯离子； (b)浓度大于或等于大约0.25g/L的钾离子；和 (c)钠:钾比例为小于或等于大约27:1重量比的钠离子； 其中所述微藻类产生至少大约0.04g DHA每IO9个细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述微藻类是隐甲藻属的。
23.权利要求21的方法，其中所述微藻类是寇氏隐甲藻菌种的。
24.权利要求21的方法，其中钾离子的来源是硫酸钾。
25.权利要求21的方法，其中钠离子的来源是硫酸钠。
26.权利要求21的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约1.0g/1。
27.权利要求21的方法，其中氯离子的浓度小于或等于大约0.3g/l。
28.权利要求21的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.4g/L。
29.权利要求21的方法，其中钾离子的浓度大于或等于大约0.8g/L。
30.权利要求21的方法，其中钠:钾比例为小于或等于大约15:1重量比。
31.权利要求21的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L而钠:钾比例为大约4:1重量比。
32.通过权利要求21的方法产生的生物量。
33.权利要求21的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.1Og DHA每IO9个细胞。
34.权利要求21的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.20g DHA每IO9个细胞。
35.权利要求21的方法，还包括从所述微藻类中回收含DHA的脂质。
36.权利要求21的方法，其中pH为小于或等于约5.5。
37.权利要求21的方法，其中pH为小于或等于约5.0。
38.权利要求21的方法，其中pH为小于或等于约4.5。
39.通过在培养基中培养甲藻纲的异养的微藻类产生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述培养基具有小于大约6.0的pH，和其中所述微藻类产生至少大约0.04g DHA每升7天培养物。
40.权利要求39的方法，其中所述微藻类是隐甲藻属的。
41.权利要求39的方法，其中所述微藻类是寇氏隐甲藻菌种的。
42.权利要求39的方法，其中pH小于或等于大约5.5。
43.权利要求39的方法，其中pH小于或等于大约5.0。
44.权利要求39的方法，其中pH小于或等于大约4.5。
45.权利要求39的方法，其中所述培养基进一步包括: (a)浓度小于或等于大约2g/l的氯离子；和 (b)浓度大于或等于大约0.25g/L的钾离子。
46.权利要求45的方法，其中氯离子的浓度为小于或等于大约1.0g/1。
47.权利要求45的方法，其中氯离子的浓度为小于或等于大约0.3g/l。
48.权利要求45的方法，其中钾离子的浓度为大于或等于大约0.4g/L。
49.权利要求45的方法，其中钾离子的浓度为大于或等于大约0.8g/L。
50.权利要求45的方法，其中钾离子的来源是硫酸钾。
51.权利要求45的方法，其中培养基进一步包含浓度为大约lg/L至大约8g/l的钠离子。
52.权利要求45的方法，其中钠离子的浓度为大约1.5g/l至大约5g/L。
53.权利要求45的方法，其中钠离子的来源是硫酸钠。
54.权利要求45的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L，钠离子的浓度为大约3.2g/L且pH为大约5.0。
55.权利要求45的方法，其中钾离子的浓度为大约0.8g/L，钠离子的浓度为大约3.2g/L且pH为大约4.5。
56.通过权利要求36的方法产生的生物量。
57.权利要求39的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.1Og DHA每IO9个细胞。
58.权利要求39的方法，其中所述微藻类产生至少大约0.20g DHA每IO9个细胞。
59.权利要求39的方法，还包括从所述微藻类中回收含DHA的脂质。
60.选择耐受低pH的甲藻纲的异养微藻类的方法,其包括将所述的微藻类在低pH培养基中传代培养直到DHA的产量大于或等于大约0.04g DHA每IO9个细胞。
61.权利要求60的方法，其中pH小于或等于大约6。
62.权利要求60的方法，其中pH小于或等于大约5。
63.权利要求60的 方法，其中pH小于或等于大约4.5。
【文档编号】C12R1/89GK103834699SQ201410126418
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2004年10月1日 优先权日:2003年10月2日
【发明者】保罗.W.贝伦斯, 约翰.M.汤普森, 柯克.阿普特, 约瑟夫.W.法伊弗第三, 詹姆斯.P.温, 詹姆斯.C.利普迈耶, 贾奥亚德.菲克塔里, 乔恩.汉森 申请人:Dsm Ip资产公司