一种沉香结香菌种的筛选方法
【专利摘要】本发明在于提供一种沉香结香菌种的筛选方法，属于菌种筛选【技术领域】，其特征在于，按流程先后分为：真菌的接种、取样、以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种，采用上述方法对沉香结香真菌进行筛选，能够选出侵染能力强、结香区浸出物含量高、结香品质好的菌种，为真菌介导生物结香促进产香的研究提供一种有效的筛选菌种方法、并在生产中推广使用。
【专利说明】一种沉香结香菌种的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及菌种筛选【技术领域】，尤其涉及一种沉香结香菌种的筛选方法。
【背景技术】
[0002]沉香是瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg含树脂的木材,是我国、印度及其他东南亚国家的传统名贵中药，具有行气止痛、纳气平喘、温中止呕的功效。也常被用来制造高级香水、高级香精等。关于沉香的生产和获取，有多种方法，但遇到的问题基本一致，即白木香结香周期很长，数量很少，品质不一，远不能满足市场需求，人们从未间断对沉香形成机制的探索。国内外许多学者探讨天然沉香的形成与真菌的诱导有密切联系，普遍认为沉香的形成可能是由于树干损伤后被一种或数种真菌侵入寄生，在真菌体内酶的作用下，使木薄壁细胞贮存的淀粉发生一系列变化，形成香脂，经多年沉积而得。科学研究初步发现，某些真菌能够诱导白木香产生沉香，但是，到目前为止，尚无对结香菌种进行有效筛选的方法，并未获得高效诱导活性真菌应用于实际生产中。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的不足，本发明在于提供一种获得高效诱导活性沉香结香真菌菌种的筛选方法。
[0004]为实现上述目的，本发明通过下述技术方案予以实现:
一种沉香结香菌种的筛选方法，其特征在于，按流程先后分为:接种、取样、以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种。
[0005]所述的真菌的接种方法为，首先选取树龄8年以上、胸径> 15cm的白木香树树干，通过钻孔的方式在树干形成直径0.6"?.5cm,深2飞cm的接种孔,纵向间隔6~10cm,打8个孔，绕圆周横向间隔5~8cm，打51个孔，每棵树南北两面孔分设为空白对照及阴性对照；3个月后，将纵向孔道以“Z型”斜向下钻孔打穿方式连接成一通道；然后接种，按纵列接种同种菌种原则，单一菌种与混合菌种分别进行，将菌种置固体培养基中培养15~25天后，连同培养基一起放入接种孔孔洞中，用聚酯纤维薄膜封闭洞口，于0、1、3、6、9、12、18、24个月后，取样观察与重复接种同时进行。
[0006]所述的取样方法为，于0、1、3、6、9、12、18、24个月后，纵向洞孔由下往上逐个撕去洞口外皮，观察洞口周围洞口染色面积，根据染色区域设定挖槽的长与宽，并各自向外扩延加长0.5cm，槽深为洞口到树干中心的距离挖取木块，该方式保证了挖取的木块必然包含结香区、染色区和白木区。
[0007]所述的以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种的方法为，首先记录结香情况，综合24个月所得数据，按中国药典对沉香的含量测定项方法计算结香区浸出物含量，并采用GC-MS法分析所得化合物的差异；然后计算洞口染色面积，综合24个月所得数据获得平均值；最后进行菌种的分离鉴定，每次取样挖取的木块，按结香区、染色区及白木区三部分对木块中菌种再次分离鉴定，计算定殖率，通过菌种定殖率的应用，判断菌种的侵染能力强弱，通过GC-MS分析不同菌种促进结香的化合物，判断菌种引导结香的品质，最终筛选出所需菌种或者菌种的混合比例。
[0008]结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标的测定标准分别为: 结香区浸出物含量一按2010版中国药典沉香【鉴别】项，确定挖取木块结香区已结
香，再根据2010版中国药典沉香【浸出物】项，用乙醇作溶剂，热浸法测定挖取木块结香区的醇溶性浸出物的量，综合24个月所得数据的平均值。
[0009]洞口染色面积一剥开外皮，观察染色区域，洞口染色面积=以洞口中心点至染色区域最宽处为直径所得圆周面积-洞口圆周面积。
[0010]定殖率(Colonization rate, CR)---被真菌侵染的组织块占所培养的组织块总
数的比例。
[0011]本发明的有益效果为:采用上述方法对沉香结香真菌进行筛选，能够选出侵染能力强、结香区浸出物含量高、结香品质好的菌种，为真菌介导生物结香促进产香的研究提供一种有效的筛选菌种方法、并在生产中推广使用。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0013]一种沉香 结香菌种的筛选方法，按流程先后分为:真菌的接种、取样、以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种。
[0014]所述的真菌的接种的具体操作步骤是，选取树龄8年以上的树干胸径> 15cm的白木香树，在打孔之前使用皮尺测量好距离并做上标记，以便精确钻孔位置，使用钻头为
0.6mm规格的冲击钻,在树干上钻出直径0.6cnTl.5cm,深2飞cm的接种孔的钻孔,纵向间隔6~10cm，连续打8个的钻孔(由下至上编号为广8)，根据树干的周长横向间隔5~8cm，打5~8个钻孔(本实施例以8个钻孔为例，编号为Al)，每棵树南北两面孔分设为空白对照(A列)及阴性对照(E列);3个月后，将纵向孔道以“Z型”斜向下钻孔打穿方式连接成一通道；然后将菌种置固体培养基中培养15~25天后，连同培养基一起放置孔洞中，用聚酯纤维薄膜封闭洞口，按纵列接种同种菌种原则，单一菌种(B/C/D/F/G列)与混合菌种(H列)分别进行，于0、1、3、6、9、12、18、24个月后，取样观察与重复接种同时进行。
[0015]所述的取样方法为，于0、1、3、6、9、12、18、24个月后，纵向洞孔由下往上逐个撕去洞口外皮，观察洞口周围洞口染色面积，根据染色区域设定挖槽的长与宽，并各自向外扩延加长0.5cm，槽深为洞口到树干中心的距离挖取木块，即第O个月挖编号为I的洞孔、第一个月后挖编号为2的洞孔，以此类推。
[0016]所述的以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种的方法为，首先记录结香情况，综合24个月所得数据，按中国药典对沉香的含量测定项方法计算结香区浸出物含量，并采用GC-MS法分析所得化合物的差异；然后计算洞口染色面积，综合24个月所得数据获得平均值；最后进行菌种的分离鉴定，每次取样挖取的木块，按结香区、染色区及白木区三部分对木块中菌种再次分离鉴定，计算定殖率。通过增加菌种定殖率的应用，能够更加准确地判断菌种的侵染能力强弱；通过GC-MS分析不同菌种促进结香的化合物，能够更好地判断菌种引导结香的品质。
[0017]上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。`
【权利要求】
1.一种沉香结香菌种的筛选方法，其特征在于，按流程先后分为:接种、取样、以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种。
2.根据权利要求1所述的一种沉香结香菌种的筛选方法，其特征在于:所述的真菌的接种方法为，首先选取树龄8年以上、胸径> 15cm的白木香树树干，通过钻孔的方式在树干形成直径0.6"?.5cm,深2~6cm的接种孔,纵向间隔6~10cm,打8个孔,绕圆周横向间隔5~8cm，打51个孔，每棵树南北两面孔分设为空白对照及阴性对照；3个月后，将纵向孔道以“Z型”斜向下钻孔打穿方式连接成一通道；然后接种，按纵列接种同种菌种原则，单一菌种与混合菌种分别进行，将菌种置固体培养基中培养15~25天后，连同培养基一起放入接种孔孔洞中，用聚酯纤维薄膜封闭洞口，于0、1、3、6、9、12、18、24个月后，取样观察与重复接种同时进行。
3.所述的取样方法为，于0、1、3、6、9、12、18、24个月后，纵向洞孔由下往上逐个撕去洞口外皮，观察洞口周围洞口染色面积，根据染色区域设定挖槽的长与宽，并各自向外扩延加长0.5cm，槽深为洞口到树干中心的距离挖取木块。
4.根据权利要求1所述的一种沉香结香菌种的筛选方法，其特征在于:所述的以结香区浸出物含量、洞口染色面积与菌种定殖率三项指标筛选促进白木香结香的优势菌种的方法为，首先记录结香情况，综合24个月所得数据，按中国药典对沉香的含量测定项方法计算结香区浸出物含量，并采用GC-MS法分析所得化合物的差异；然后计算洞口染色面积，综合24个月所得数据获得平均值；最后进行菌种的分离鉴定，每次取样挖取的木块，按结香区、染色区及白木区三部 分对木块中菌种再次分离鉴定，计算定殖率，通过菌种定殖率的应用，判断菌种的侵染能力强弱，通过GC-MS分析不同菌种促进结香的化合物，判断菌种引导结香的品质，最终筛选出所需菌种或者菌种的混合比例。
【文档编号】C12Q1/04GK103865813SQ201410134972
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】李海燕, 杨洋, 陈丽, 张玉宜, 刘瑞驹 申请人:广东国方医药科技有限公司