一种低拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用的制作方法

一种低拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种低拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用，所述的低拷贝pTerm系列质粒包括rop基因、rep基因、原核生物转录终止子以及抗生素抗性基因。本发明的一种低拷贝pTerm系列质粒具有拷贝数低、容量大、稳定性高等特点，可用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用。
【专利说明】一种低拷贝pTerm质粒及其构建方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】和基因工程领域，具体涉及一种低拷贝、大容量、高稳定 性的pTerm质粒及其构建方法和应用。

【背景技术】
[0002] 质粒是染色质外的遗传因子，能够进行自主复制，是一种能独立复制的复制子。 质粒是一种双链共价闭合环形DNA分子，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2kb? 300kb之间。
[0003] 质粒虽然不是宿主生存所必需的遗传元件，但是能够给予宿主细胞某些特殊的性 质，例如抗药性等。质粒可以作为载体用于克隆外源基因，广泛应用于基因克隆、测序及基 因合成等领域。人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在已有质粒的基础 上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。
[0004] 所谓复制子，即是一个遗传单位，包括DNA复制起点（ori)及其相关的调控原件。 每个质粒DNA上都含有ori，在质粒中ori是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，只有 ori能被宿主细胞复制及蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状 况主要与ori的序列结构相关。
[0005] 根据质粒复制的特点，质粒被分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒也称低拷贝 数质粒，每个细胞中拷贝数有限，大约一个至十几个；松弛型质粒也称高拷贝数质粒，其拷 贝数较多，可达几百个。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件 有关。尤其是高拷贝数质粒更是因其分子量小、拷贝数高、操作方便、易于大量制备等优点 而成为实验中的首选。
[0006] 松弛型质粒（高拷贝数质粒）通常带有蓝白斑筛选功能（例如puc系列载体），这 个特点给基因克隆带来了极大的方便。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为Iacz'的基 因 ，Iacz '中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子序列；编码α肽链的序列；一个多克隆位 点（MCS)。MCS位于编码α肽链的序列中，是外源DNA的插入位点。设计适用于蓝白斑筛 选的基因工程菌为β -半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组中编码β -半 乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β -半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短 肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。虽然上述缺陷 株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒 lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具 有与完整β_半乳糖苷酶相同的作用，能够使X-gal生成蓝色物质，这种现象即α-互补。 以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS， 使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无 α互 补作用，不产生有活性β -半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型 呈现白色菌落。
[0007] 虽然带有蓝白斑筛选功能的高拷贝数质粒给基因克隆提供了极大的方便，但是其 β -半乳糖苷酶的启动子属于强启动子，能够大量启动外源基因的转绿、翻译，这也导致了 某些结构复杂的基因、转录或翻译产物对宿主有毒性的基因无法克隆。目前通常使用以下 两种方式克隆这类"难度"基因：①选用低拷贝或单拷贝质粒作为克隆载体；②选用可以降 低质粒拷贝数的菌株，例如ΕΡΙ400。尽管这些方法可以成功克隆部分"难度"基因，但是仍 有很多基因无法克隆，究其原因是因为这些载体尽管拷贝数低，但是通常还是带有蓝白斑 筛选功能，仍具有大量启动外源基因的转绿、翻译的强启动子，并且即使质粒中不带有蓝白 斑筛选功能，不具有相应的强启动子，质粒中其它启动子（例如抗生素抗性基因启动子）也 可以启动外源基因的低量转录、翻译，因此，如何克服现有质粒载体存在的上述缺陷，提高 克隆"难度"基因的成功率是很多科研人员需要解决的首要问题。


【发明内容】

[0008] 本发明解决的问题在于提供一种低拷贝、大容量、高稳定性的pTerm系列质粒，并 进一步公开其构建方法及应用。
[0009] 本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
[0010] -种低拷贝pTerm质粒，所述质粒包括rop基因、rep基因、原核生物转录终止子 以及抗生素抗性基因；所述原核生物转录终止子设置于多克隆位点的两端；所述抗生素抗 性基因为Amp基因或Kan基因。
[0011] 优选的，所述Amp基因具有如SEQ ID No. 1所不的序列结构，所述Kan基因具有如 SEQ ID No. 4所示的序列结构。
[0012] 优选的，所述质粒的拷贝数为40-60个。
[0013] 优选的，所述质粒记为pTerm-LA，具有如SEQ ID No. 8所示的序列结构；所述质粒 中，自 5'端第 120bp ?713bp 为 Terminator 基因；869bp ?1729bp 为 Amp 基因；1878bp ? 2506bp为rep基因；3231bp?3455bp为rop基因；其中多克隆位点在427bp?468bp处； 或者
[0014] 所述质粒记为pTerm-LK，具有如SEQ ID No. 8所示的序列结构；所述质粒中，自5' 端第 120bp ?713bp 为 Terminator 基因；869bp ?1684bp 为 Kan 基因；1833bp ?2461bp 为rep基因；3186bp?3410bp为rop基因；其中多克隆位点在427bp?468bp处。
[0015] -种构建低拷贝pTerm质粒的方法，包括以下步骤：
[0016] 步骤一：人工设计并合成所述的rep基因、rop基因、原核生物转录终止子基因、抗 生素抗性基因片段；
[0017] 步骤二：运用多段重组法将所述rep基因、rop基因、原核生物转录终止子基因、抗 生素抗性基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。
[0018] 优选的，所述的多段重组法为Gibson重组方法，反应体系及条件：按1: 1: 1:1的摩 尔比取所述rep基因、rop基因、原核生物转录终止子基因、抗生素抗性基因片段，加入灭菌 去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50°C下反应至得到环形质粒。
[0019] 一种构建低拷贝pTerm系列质粒的方法，包括以下步骤：
[0020] 步骤一：人工合成所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因片段；
[0021] 步骤二：按照权利要求5或6所述方法构建得到含所述抗生素抗性Amp基因或 Kan基因的pTerm质粒，分别以所述含抗生素抗性Amp基因或Kan基因的质粒为模板，设计 F-pTerm-LA/LK、R-pTerm_LA/LK为引物，通过PCR扩增得到rep-rop-原核生物转录终止子 基因片段；
[0022] 步骤三：运用Gibson重组方法，将构建的所述rep-rop-原核生物转录终止子基因 片段与分别与所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段进行组装。
[0023] 优选的，所述步骤二中，所述引物包括：
[0024] F-pTerm-LA/LK :5，-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3，；
[0025] R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatc-3,;
[0026] 优选的，所述的Gibson重组方法反应体系及条件：按1:1的摩尔比取所述 rep-rop-原核生物转录终止子基因片段与所述第二抗生素抗性基因片段，加入灭菌去离子 水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50°C下反应至得到环形质粒。
[0027] 上述低拷贝pTerm质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。
[0028] 优选的，所述pTerm-SC质粒在结构复杂、含有重复序列以及不稳定序列基因的克 隆、筛选和测序中的应用。
[0029] 优选的，所述pTerm-SC质粒在长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组合成中的 应用。
[0030] 本发明利用人工合成的方法，合成一种低拷贝pTerm系列质粒，主要技术手段是 删除众多克隆质粒所具有的蓝白斑筛选基因及相应的强启动子，并且在多克隆位点两端添 加了多个防止外源DNA序列从上游质粒启动子过多转录的原核生物转录终止子，即不依赖 P因子的原核生物转录终止子，因此能够有效遏制外源基因的转录、翻译，从而使该质粒能 够克隆高拷贝、低拷贝载体所不能克隆的基因及对宿主细胞有毒害的基因。
[0031] 本发明的一种低拷贝PTerm系列质粒具有拷贝数低、容量大、稳定性高等特点，可 用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因 组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0033] 图1为pTerm-LA质粒的物理图谱；
[0034] 图2为pTerm-LK质粒的物理图谱；
[0035] 图3为pTerm-LA质粒构建流程模式图；
[0036] 图4为膜蛋白基因重组质粒的酶切验证图，其中1为重组质粒对照；2为重组质粒 用限制性内切酶BamHI+Hind III酶切结果；3为DS5000DNAMarker ;
[0037] 图5为人线粒体部分DNA序列重组质粒的酶切验证图，其中1为重组质粒对照，2 为重组质粒用限制性内切酶BamH I +Mlu I的酶切结果，3为DS5000DNA Marker。

【具体实施方式】
[0038] 实施例1 :质粒pTerm-LA的构建
[0039] 质粒pTerm-LA的构建流程模式图如图3所示，具体方法如下：
[0040] 1.设计并合成Amp基因，序列全长921bp，其中31?891为Amp基因，编码β -内 酰胺酶，对氨苄青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列I ;
[0041] 2.设计并合成rep复制子基因，序列全长971bp，其中序列149?777bp为rep复 制子基因序列，基因序列如序列表中的序列2 ;
[0042] 3.设计并合成rop基因，序列全长927bp，其中序列561?785bp为rop基因序列， 基因序列如序列表中的序列3 ;
[0043] 4.设计并合成Terminator基因，序列全长779bp，其中31?289bp为原核生物转 录终止子，基因序列如序列表中的序列4 ;
[0044] 分别得到以上四个基因片段，由于四个片段之间具有30bp重叠互补区域，因此使 用Gibson Assembly Master Mix(NEB)试剂盒将它们组装起来最终得到环形的质粒，记为 pTerm-LA，其测序序列如SEQ ID No. 8所示。
[0045] Gibson Assembly Master Mix反应体系及条件：四个基因片段各1 μ 1，灭菌去离 子水 6 μ 1，Gibson Assembly Master Mix :10 μ 1，50°C反应 1 小时。
[0046] 取5 μ 1连接产物转化TOPlOF ^大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌 检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒大 小为3478bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：120bp?713bp ;Amp基因： 869bp ?1729bp ;r印基因：1878bp ?2506bp ;rop 基因：3231bp ?3455bp ;其中多克隆位 点在427bp?468bp处。
[0047] 实施例2 :质粒pTerm-LK的构建
[0048] 质粒pTerm-LK的构建方法和质粒pTerm-LA构建类似，具体方法如下：
[0049] L设计并合成Kan基因，序列全长876bp，其中31?846为Kan基因，基因序列如 序列表中的序列5 ;
[0050] 2.设计并合成rep复制子基因，序列全长971bp，其中序列149?777bp为rep复 制子基因序列，基因序列如序列表中的序列2 ;
[0051] 3.设计并合成rop基因，序列全长927bp，其中序列561?785bp为rop基因序列， 基因序列如序列表中的序列3 ;
[0052] 4.设计并合成Terminator基因，序列全长779bp，其中31?289bp为原核生物转 录终止子，基因序列如序列表中的序列4 ;
[0053] 分别得到以上四个基因片段，由于四个片段之间具有30bp重叠互补区域，因此使 用Gibson Assembly Master Mix(NEB)试剂盒将它们组装起来最终得到环形的质粒，记为 pTerm-LK,其测序序列如SEQ ID No. 9所示。
[0054] Gibson Assembly Master Mix反应体系及条件：四个基因片段各1 μ 1，灭菌去离 子水 6 μ 1，Gibson Assembly Master Mix :10 μ 1，50°C反应 1 小时。
[0055] 取5 μ 1连接产物转化TOPlOF ^大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌 检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒大 小为3433bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：120bp?713bp ;Kan基因： 869bp ?1684bp ;rep 基因：1833bp ?2461bp ;rop 基因：3186bp ?3410bp ;其中多克隆位 点在427bp?468bp处。
[0056] 实施例3 :以质粒pTerm-LA为模板构建pTerm-LK质粒
[0057] 在质粒pTerm-LA的基础上通过改变抗生素抗性基因，构建得到具有卡那霉素抗 性的质粒pTerm-LK，具体方法如下：
[0058] 人工设计并合成Kan基因序列，全长876bp，基因序列如序列表中的序列4,其中碱 基31?846为Kan基因编码区。
[0059] 以实施例1中制备得到的pTerm-LA质粒为模板，F-pTerm-LA/LK、R-pTerm-LA/LK 为引物，通过PCR得到片段rep-rop-Terminator ;
[0060] F-pTerm-LA/LK :5，-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3，；
[0061] R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatd'。
[0062] 由于该片段与Kan基因序列两端具有30bp重叠互补区域，因此采用Gibson Assembly Master Mix(NEB)试剂盒将两个片段进行组装。
[0063] Gibson Assembly Master Mix反应体系及条件：两个DNA片段各1 μ 1，灭菌 去离子水8μ1，Gibson Assembly Master Mix :10yl，50°C反应1小时，即得环形质粒 pTerm-LK，其测序序列如SEQ ID No. 9所示。
[0064] 取5μ 1连接产物转化Τ0Ρ10Γ大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌 检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒大 小为3433bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：120bp?713bp ;Kan基因： 869bp ?1684bp ;rep 基因：1833bp ?2461bp ;rop 基因：3186bp ?3410bp ;其中多克隆位 点在427bp?468bp处。
[0065] 实施例4 :以质粒pTerm-LK为模板构建pTerm-LA质粒
[0066] 在质粒pTerm-LK的基础上通过改变抗生素抗性基因，构建得到具有氨苄青霉素 抗性的质粒pTerm-LA，具体方法如下：
[0067] 人工设计并合成Amp基因序列，序列全长921bp，其中31?891为Amp基因，编码 β -内酰胺酶，对氨苄青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列1 ;
[0068] 以实施例2中制备得到的pTerm-LK质粒为模板，F-pTerm-LA/LK、R-pTerm-LA/LK 为引物，通过PCR得到片段rep-rop-Terminator ;
[0069] F-pTerm-LA/LK :5，-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3，；
[0070] R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatd'。
[0071] 由于该片段与Amp基因序列两端具有30bp重叠互补区域，因此采用Gibson Assembly Master Mix(NEB)试剂盒将两个片段进行组装。
[0072] Gibson Assembly Master Mix反应体系及条件：两个DNA片段各1 μ 1，灭菌 去离子水8μ1，Gibson Assembly Master Mix :10yl，50°C反应1小时，即得环形质粒 pTerm-LA,其测序序列如SEQ ID No. 8所示。
[0073] 取5μ 1连接产物转化Τ0Ρ10Γ大肠杆菌感受态细胞，第二天挑选单克隆进行菌 检PCR，并将菌检到的阳性克隆进行测序，测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒大 小为3478bp。质粒中主要元件的位置分别是Terminator基因：120bp?713bp ;Amp基因： 869bp ?1729bp ;r印基因：1878bp ?2506bp ;rop 基因：3231bp ?3455bp ;其中多克隆位 点在427bp?468bp处。
[0074] 实施例5 :质粒pTerm-LA、pTerm-LK稳定性检测
[0075] 分别将实施例1和3制备的质粒pTerm-LA、pTerm-LK转化到大肠杆菌TOPlOFi 感受态细胞中，挑取单克隆菌落在含有相应抗生素 （Amp : 100 μ g/μ 1或Kan :50 μ g/μ 1) 的LB培养基中过夜培养，之后对培养的菌液在含有相应抗生素 （Amp :100 μ g/μ 1或 Kan :50μ g/μ 1)的平板上划线培养，对划线得到的单克隆重新在含有相应抗生素（Amp: 100 μ g/ μ 1或Kan :50 μ g/ μ 1)的平板上再进行一次划线培养，由此得到纯的阳性转化克 隆。
[0076] 将得到的纯的阳性转化克隆接种到不含有抗生素的LB培养基中，37°C培养20代 (约7h)后，从中取100 μ 1接种至新的不含有抗生素的LB培养基中，37°C继续培养20代， 如此重复6次，最后分别得到40代、60代、80代、100代和120代的细菌，取上述各代菌 液100 μ 1，稀释100倍后分别接种至不含有抗生素的LB平板上和含有相应抗生素 （Amp : 100 μ g/μ 1 或 Kan :50 μ g/μ 1)的 LB 平板上，37°C培养过夜。
[0077] 无抗生素条件下质粒的保持率=含有相应抗生素 （Amp :100μ g/μ 1或Kan : 50 μ g/ μ 1)的LB平板上的存活菌落数/不含有抗生素的LB平板上的存活菌落数。
[0078] 在没有选择压力的情况下，连续培养120代，质粒pTerm-LA的保持率为99. 9% ; 质粒pTerm-LK的保持率为100%。以上结果表明合成的pTerm-LA、pTerm-LK质粒具有较 强的稳定性，适用于作为基因工程的克隆载体。
[0079] 实施例6 :质粒pTerm-LA、pTerm-LK拷贝数检测
[0080] 分别转化pTerm-LA、pTerm-LK以及pUC57质粒到大肠杆菌T0P10P感受态细胞 中，分别挑取四个单克隆菌落到含有相应抗生素 （Amp :100 μ g/μ 1或Kan :50 μ g/μ 1)的 411111^培养基中，371：200印111过夜培养12小时，第二天提取质粒，最终将质粒溶解到5(^1 灭菌TE中，测质粒的浓度得到pUC57的浓度分别是：352ng/l·! l、336ng/l·! l、343ng/l·! 1、 337ng/y 1，pTerm-LA 质粒的浓度分别是：30. 8ng/y 1、35· 6ng/y 1、31· lng/μ 1、30· 3ng/ μ 1，pTerm-LK 质粒的浓度分别是：33. 5ng/y 1、29· 2ng/y 1、33· 7ng/y 1、33· lng/μ 1，根 据所测质粒浓度计算pUC57、pTerm-LA以及pTerm-LK的摩尔浓度。
[0081] 腺嘌呤（A)、鸟嘌呤（G)、胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶（T)分子量分别为313. 2、304· 2、 329. 2、289. 2(g/mol)，则：
[0082] pUC57 的分子量=313. 2g/mol X672+304. 2g/mol X691+329. 2g/ mol X 683+289. 2g/molX664 = 837545g/mol ；
[0083] pTerm-LA 的分子量=313. 2g/mol X 845+304. 2g/mol X 924+329. 2g/ mol X 897+289. 2g/molX812 = 1075858g/mol ；
[0084] pTerm-LK 的分子量=313. 2g/mol X 833+304. 2g/mol X 897+329. 2g/ molX855+289. 2g/molX848 = 1060471g/mol ；
[0085] 检测得到质粒pUC57的平均浓度=342ng/ μ l，pTerm_LA的平均浓度=31. 95ng/ μ 1，pTerm-LK 的平均浓度=32. 375ng/y I ;
[0086] 质粒 pUC57 的摩尔浓度=388. 75ng/y l + 837545g/mol = 4. 6415416485E-7mol/ L ；
[0087] 质粒 pTerm-LA 的摩尔浓度=31. 95ng/μ I+ 849570g/mol = 3.7607260143E-8mol/L ；
[0088] 质粒 pTerm-LK 的摩尔浓度=32. 375ng/μ I+ 834214g/mol = 3.8808986663E-8mol/L〇
[0089] 因此，pUC57为高拷贝质粒，每个细胞中质粒的拷贝数为500个?700个，由 此可以计算出质粒pTerm-LA的拷贝数=pTerm-LA的摩尔浓度X (500?700) +pUC57 的摩尔浓度=3· 7607260143E-8 X (500 ?700) +4. 6415416485E-7 = 41 ?57 (个）， pTerm-LK的拷贝数=pTerm-LK的摩尔浓度X (500?700) +pUC57的摩尔浓度= 3· 8808986663E-8 X (500 ?700) +4. 6415416485E-7 = 42 ?59 (个）。
[0090] 故每个细胞中质粒pTerm-LA的拷贝数为41?57个，质粒pTerm-LK的拷贝数为 42?59个，均为低拷贝质粒。
[0091] 实施例7 :利用质粒pTerm-LA构建膜蛋白基因的克隆重组体
[0092] 膜蛋白是生物膜功能的主要承担者，根据蛋白分离的难易及在膜中分布的位置， 膜蛋白基本可分为三大类：外在膜蛋白或称外周膜蛋白、内在膜蛋白或称整合膜蛋白和脂 锚定蛋白。膜蛋白包括糖蛋白，载体蛋白和酶等。膜蛋白的功能是多方面的。有些膜蛋白 可作为"载体"而将物质转运进出细胞。有些膜蛋白是激素或其他化学物质的专一受体，如 甲状腺细胞上有接受来自脑垂体的促甲状腺素的受体。膜表面还有各种酶，使专一的化学 反应能在膜上进行，如内质网膜上的能催化磷脂合成的酶等。细胞的识别功能也决定于膜 表面的蛋白质，这些蛋白常常是表面抗原。表面抗原能和特异的抗体结合，如人细胞表面有 一种蛋白质抗原HLA，是一种变化极多的二聚体，不同的人有不同的HLA分子，器官移植时， 被植入的器官常常被排斥，这就是因为植入细胞的HLA分子不为受体所接受的缘故。
[0093] 本实施例的具体实验过程如下：
[0094] 1.对目标基因序列进行分析和优化
[0095] 优化后的膜蛋白基因序列如序列表中序列6,序列全长2142碱基对。首先将序列 5'、3'端分别添加 BamH I、Hind III酶切位点和保护碱基，然后设计并合成寡核苷酸链，通 过PCR拼接的方法得到膜蛋白基因的全序列。为了测试pTerm-LA载体优越性，将膜蛋白基 因序列、PUC57载体、pCA载体以及pTerm-LA载体用BamH I、Hind III限制性内切酶进行酶 切并割胶回收纯化DNA片段，将酶切后的膜蛋白基因片段和载体使用T4DNA连接酶进行连 接，酶切和连接反应体系如下：
[0096] PCR产物酶切反应体系及反应条件：膜蛋白基因片段：4 μ l(200ng)，IOXBuffer : 2yl，BamH I :1μ1;Η?η(1ΙΙΙ:1μ1，Η20:12μ1。37°C，30min。
[0097] 载体酶切反应体系及反应条件：pTerm-LA (pUC57、pCA、）： L 5 μ I (800ng)， 10XBuffer:2yl，BamH I :1μ1;Η?η(1ΠΙ:1μ1，Η20:14·5μ1。37°C，30min。
[0098] 连接反应体系及反应条件：2XBuffer :10μ 1，DNA片段：2μ l(80ng)， pTerm-LA(pUC57、pCA、）：1 μ I (20ng)，H2O :6 μ 1，T4DNA 连接酶（ThermoScientific，1000U lOOOCEU/μΙ) :lyl;22°C，30min。
[0099] 将连接产物分别转化TOPlOF ^大肠杆菌感受态细胞，第二天分别挑选24个单克 隆进行菌检PCR，结果显示使用pTerm-LA载体的菌检阳性率为100%，而使用pUC57、pCA 载体的菌检阳性率均为0。将使用pTerm-LA载体菌检到的阳性克隆摇菌并抽质粒然后进 行酶切验证，酶切验证图如图4所示，其中1为重组质粒对照；2为重组质粒用限制性内切 酶BamH I、Hind III酶切结果，条带大小和理论值（2172bp、3442bp)相符；3为DS5000DNA Marker,此图说明膜蛋白基因已经成功克隆进pTerm-LA载体，将酶切正确质粒进行测序验 证，测序结果显示序列完全正确。该实验结果表明pTerm-LA载体能够用于克隆pUC57、pC 系列载体（pCA、pCK、pCC)所不能克隆的基因序列。
[0100] 实施例8 :利用质粒pTerm-LK构建人线粒体部分DNA序列
[0101] 人线粒体DNA分子是一个长16569bp的双链闭合环状超螺旋DNA，包括重链和轻 链。人线粒体DNA编码13个电子传递链上的亚基，22个tRNA和2个rRNA，这些基因呈紧 密排列，基因内没有内含子，但人线粒体DNA内有一个非编码区，称为控制区，也叫取代环 (D-Ioop)，含有转录及复制的调控信号。人线粒体DNA上无核苷酸结合蛋白，缺少组蛋白的 保护,并且线粒体内无 DNA损伤修复系统，因此人线粒体DNA易于突变，并且突变容易得到 保存。线粒体DNA突变会产生一系列疾病，到目前为止人们已经发现了数以百计的与疾病 相关的线粒体点突变，缺失和重排。
[0102] 本实施例的具体实验过程如下：
[0103] 对DNA序列进行分析和优化，序列全长2000bp，其序列结构如序列表中序列7,首 先将DNA序列5'、3'端分别添加 BamH I、Mlu I酶切位点和保护碱基，然后设计并合成寡 核苷酸链，通过PCR拼接的方法得到全长序列。为了测试pTerm-LK载体优越性，将目的基 因序列、PUC57载体、pCA载体以及pTerm-LK载体用BamH I、Mlu I限制性内切酶进行酶 切并割胶回收纯化DNA片段，将酶切后的目的基因片段和载体使用T4DNA连接酶进行连接， 酶切和连接反应体系如下：
[0104] PCR产物酶切反应体系及反应条件：目的基因片段：4 μ l(200ng)，IOXBuffer : 2yl，BamH I :1μ1;Μ1ιι I :1μ1，Η20:12μ1。37°C，30min。
[0105] 载体酶切反应体系及反应条件糾61"111-1^(?此57、？04):1.5 4 1(800叩）， 10XBuffer:2yl，BamH I :1μ1;Μ1ιι I :1μ1，Η20:14·5μ1。37°C，30min。
[0106] 连接反应体系及反应条件：2XBuffer :10μ 1，目的基因片段：2μ l(80ng)， pTerm-LK(pUC57、pCA) :1 μ I (20ng)，H2O :6 μ 1，T4DNA 连接酶（Thermo Scientific, 1000U lOOOCEU/μΙ) :lyl;22°C，30min。
[0107] 将连接产物分别转化TOPlOF ^大肠杆菌感受态细胞，第二天分别挑选24个单克 隆进行菌检PCR，结果显示使用pTerm-LK载体的菌检阳性率为100%，而使用pUC57、pCA 载体的菌检阳性率均为0。将使用pTerm-LK载体菌检到的阳性克隆摇菌并抽质粒然后进 行酶切验证，酶切验证图如图5所示，其中1为重组质粒对照；2为重组质粒用限制性内切 酶BamH I、Mlu I酶切结果，条带大小和理论值（2006bp、3409bp)相符；3为DS5000DNA Marker，此图说明目的基因已经成功克隆进pTerm-LK载体，将酶切正确质粒进行测序验 证，测序结果显示序列完全正确。
[0108] 将重组质粒用BamH I和Mlu I酶切并胶回收基因片段，再将胶回收的基因片段 与高拷贝pTerm-HK(BamH I和Mlu I酶切并胶回收，苏州金唯智生物科技有限公司构建） 载体用T4DNA连接酶进行反应，并将反应产物转化公司所有感受态细胞，第二天各挑取24 个单克隆进行菌检PCR，结果显示菌检阳性率为0,推测可能是该基因在高拷贝质粒载体中 不稳定，该实验结果从另一个角度证明pTerm-LK载体能够用于克隆pUC57、pTerm-HK高拷 贝类型载体、PC系列低拷贝载体（苏州金唯智生物科技有限公司专利载体）所不能克隆的 基因序列。
[0109] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明的保护范围之中。
【权利要求】
1?一种低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒包括rop基因、rep基因、原核生物转 录终止子以及抗生素抗性基因；所述原核生物转录终止子设置于多克隆位点的两端；所述 抗生素抗性基因为Amp基因或Kan基因。
2. 根据权利要求1所述的低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述Amp基因具有如SEQ ID No. 1所示的序列结构，所述Kan基因具有如SEQ ID No. 4所示的序列结构。
3. 根据权利要求1或2所述的低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒的拷贝数为 40-60 个。
4. 根据权利要求3所述的低拷贝pTerm质粒，其特征在于，所述质粒记为pTerm-LA，具 有如SEQ ID No. 8所示的序列结构；所述质粒中，自5'端第120bp?713bp为Terminator 基因；869bp ?1729bp 为 Amp 基因；1878bp ?2506bp 为 rep 基因；3231bp ?3455bp 为 rop 基因；其中多克隆位点在427bp?468bp处；或者 所述质粒记为pTerm-LK，具有如SEQ ID No. 9所示的序列结构；所述质粒中，自5'端 第 120bp ?713bp 为 Terminator 基因；869bp ?1684bp 为 Kan 基因；1833bp ?2461bp 为 rep基因；3186bp?3410bp为rop基因；其中多克隆位点在427bp?468bp处。
5. -种根据权利要求1-4任一所述的低拷贝pTerm质粒的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 步骤一：人工设计并合成所述的rep基因、rop基因、原核生物转录终止子以及抗生素 抗性基因片段； 步骤二：运用多段重组法将所述的rep基因、rop基因、原核生物转录终止子以及抗生 素抗性基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。
6. 根据权利要求5所述的低拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的多段重组 法为Gibson重组方法,反应体系及条件：按1:1:1:1的摩尔比取所述rep基因、rop基因、原 核生物转录终止子以及抗生素抗性基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，50°C下反应至得到环形质粒。
7. -种构建权利要求1-4任一所述的低拷贝pTerm系列质粒的方法，其特征在于，包括 以下步骤： 步骤一：人工合成所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因片段； 步骤二：按照权利要求5或6所述方法构建得到含所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因 的pTerm质粒，分别以所述含抗生素抗性Amp基因或Kan基因的质粒为模板，F-pTerm-LA/ LK、R-pTerm-LA/LK为引物，通过PCR扩增得到rop-r印-原核生物转录终止子基因片段； 步骤三：运用Gibson重组方法，将构建的所述r印-rop-原核生物转录终止子基因片段 分别与所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段进行组装。
8. 根据权利要求7所述的低拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述步骤二中， 所述引物包括： F-pTerm-LA/LK ：5, -ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3,； R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatc_3,〇
9. 根据权利要求7或8所述的低拷贝pTerm质粒的构建方法，其特征在于，所述的 Gibson重组方法反应体系及条件：按1:1的摩尔比取所述rep-rop-原核生物转录终止子 基因片段与所述第二抗生素抗性基因片段，加入灭菌去离子水，再加入Gibson Assembly Master Mix试剂，5(TC下反应至得到环形质粒。
10.权利要求1-4任一所述低拷贝pTenn质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。
【文档编号】C12N15/65GK104404069SQ201410670147
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】薛高旭, 冯爱华, 孙中平, 廖国娟 申请人:苏州金唯智生物科技有限公司