一种用于圆锥掘氏梅里霉的培养基和培养方法
【专利摘要】一种快速提高线虫生防真菌-圆锥掘氏梅里霉生物量及缩短产孢周期的培养方法，采用培养皿固体培养基在室温条件下培养圆锥掘氏梅里霉，通过在固体培养基中加入动物的肾脏和/或肝脏，提高了该真菌的生物量，并缩短培养产孢周期。
【专利说明】一种用于圆锥掘氏梅里霉的培养基和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，涉及一种真菌的培养基和培养方法，特别是涉及一 种快速提高线虫生防真菌一一圆锥掘氏梅里霉的生物量及缩短产孢周期的培养基和培养 方法。
【背景技术】
[0002] 植物寄生线虫在许多农业及园艺经济作物造成严重的损失。其中根结线虫或胞囊 线虫等内寄生线虫可以导致农作物产量损失在10% -50%。据统计，由于植物内寄生线虫 造成的全世界作物损失已经达到每年超过1000亿美元。
[0003] 圆维掘氏梅里霉[Drechmeria coniospora ARSEF 6962]是一种非常重要的线虫 内寄生生防真菌，是内寄生型食线虫真菌。
[0004] 圆锥掘氏梅里霉隶属于真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、麦角菌科的掘氏 梅里霉属。国内外文献报道该菌具有生物防治植物寄生线虫潜力的线虫内寄生真菌。被许 多科学家用作研宄真菌与线虫识别机制的好材料。
[0005] 但是，提高圆锥掘氏梅里霉培养的生物量和缩短培养周期是目前需 要研宄的技术问题。文献报道，利用现有的培养基对该真菌菌株进行培养， 如 PDA(potato-dextrose-agar)培养基、CMA(corn-meal-agar)培养基和 SDAY(dextrose-neopeptone-yeast extract-agar)培养基，真菌的产量低（生物量低），且 产孢周期长（约为8-10周）。这严重限制了圆锥掘氏梅里霉大规模生产培养，也影响了其 使用。
[0006] 本发明针对圆锥掘氏梅里霉产量及应用受到培养条件严重限制的前提下，尝试改 善的培养方法，并最终克服了该真菌实验室培养周期长，产量低的缺点。
【发明内容】
[0007] 本发明的最终目的是提供一种圆锥掘氏梅里霉[Drechmeria coniospora ARSEF 6962]的新的培养方法，提高生物量，缩短培养周期，便于其大规模生产。
[0008] 本发明的直接目的是找到培养圆锥掘氏梅里霉的培养皿固体培养基中提高生物 量的新的成分。
[0009] 本发明人通过大量实验研宄工作，首次发现，在培养基中加入动物的肝和/或肾， 能够达到上述发明目的。
[0010] 特别是，发明人对本发明固体培养中重要成分-动物肝脏和肾脏的含量和组成比 例与培养菌株的菌体生长周期进行了以下相关性分析：
[0011] 1)动物肝脏和/或肾脏的合适用量；
[0012] 2)动物肝脏与肾脏的用量比；
[0013] 3)所用肝脏与肾脏的动物种类。
[0014] 从上述实验结果，本发明得到的解决方案是：
[0015] -种圆锥掘氏梅里霉的培养方法，采用培养皿固体培养基在室温条件下培养圆锥 掘氏梅里霉，其特征是所述培养基中含有动物的肝脏和/或肾脏，且所述动物肝脏和肾脏 在培养基中的含量是：每l〇〇mL培养基中，含动物肝脏lg?50g，动物肾脏lg?50g。
[0016] 优选含量范围是：每100mL培养基中，含动物肝脏7g?12g、动物肾脏7g?12g。 动物肝脏与肾脏成分能够有效地提高该真菌生物量，缩短培养产孢周期。
[0017] 所述的培养皿固体培养基中的其它成分是NaCl、琼脂及无菌水。
[0018] 上述配制的培养基为液体，经过121°C灭菌后转变为固体，用于培养圆锥掘氏梅里 霉。
[0019] 在本发明一个实施例中，培养基成分如下：每100mL培养基中，含动物肝脏10g、动 物肾脏10g、NaCl 0. 5g、琼脂1. 5g、加入无菌水定容。
[0020] 所述动物肝脏和肾脏优选新鲜或冷冻保存的组织材料。
[0021] 所述动物是哺乳动物，优选猪、牛、羊的肝和肾。
[0022] 所述培养基的配制方法是：
[0023] 1)称取动物肝脏与动物肾脏，切成小块，用匀浆机将肝脏与肾脏组织打碎；
[0024] 2)在上述所得组织匀浆中加入NaCl和琼脂粉，随后加入蒸馏水定容；
[0025] 3) 121°C 灭菌 15min。
[0026] 用上述培养基对圆锥掘氏梅里霉进行培养的方法是：将保存的圆锥掘氏梅里霉分 生孢子涂布在培养基表面。利用封口膜对培养皿进行密封，保持培养基中水分含量。将涂 有菌株的培养皿放置于培养箱中进行培养。培养温度25±2°C，培养周期为7-8天。
[0027] 本发明的有益效果为
[0028] 经实验证明，本发明首次采用含动物肝脏和/或肾脏制备的固体培养基培养获得 的圆锥掘氏梅里霉，生物量明显提高，产孢周期8-16天，显著缩短。相对于目前文献报道的 采用PDA培养基、CMA培养基对该真菌培养产量低，产孢周期为8-10周相比，具有工艺简单、 设备要求低，且圆锥掘氏梅里霉生物量显著提高，培养周期缩短85%以上（详见实施例）。
[0029] 用本发明培养方法培养出来的圆锥掘氏梅里霉孢子进行线虫侵染实验。检测结果 显示，分生孢子具有的极强的侵染并杀死线虫的效果，能够满足生物防治植物寄生线虫及 相关领域科学研宄的相应要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1是不同肝肾比例培养基中圆锥掘氏梅里霉生长周期分析。图中，纵座标表示 培养基中菌株的生长时间；横座标表不不同肝肾含量和比例的培养基。
[0031] 图2是单独添加肝脏或肾脏制备的培养基对圆锥掘氏梅里霉的促生功能分析。图 中，纵座标表不培养基中菌株的生长时间；横座标表不不同肝肾含量的培养基。
[0032] 图3是不同培养条件下获得的圆锥掘氏梅里霉对秀丽隐杆线虫的侵染能力进行 比对分析。图中，纵座标表示菌株对线虫的侵染效率；横座标表示侵染时间。图中，LK，本发 明固体培养基中培养获得圆锥掘氏梅里霉；SDAY，SDAY固体培养基中培养获得圆锥掘氏梅 里霉；PDA，PDA固体培养基中培养获得圆锥掘氏梅里霉；CMA，CMA固体培养基中培养获得圆 锥掘氏梅里霉。
【具体实施方式】
[0033] 说明
[0034] 1、以下实施例中，各固体培养基的配制方法是：
[0035] 1)称取动物肝脏与动物肾脏，切成小块，用匀浆机将肝脏与肾脏组织打碎；
[0036] 2)在上述所得组织匀浆中加入称取的NaCl和琼脂粉，随后加入蒸馏水定容；
[0037] 3) 121°C 灭菌 15min。
[0038] 2、培养方法为：
[0039] 将涂布有圆锥掘氏梅里霉菌株的培养基培养皿封口，并放置于培养箱中。培养温 度25 °C，定期观察培养皿中菌株生长状态。
[0040] 3、判断圆锥掘氏梅里霉的生长情况的方式为：
[0041] 在光学显微镜下观察，对培养菌株的生长时期进行鉴定。圆锥掘氏梅里霉的生长 周期主要可以分为三个阶段：
[0042] 阶段1 (菌丝体时期），培养基上能够观察到丝状菌丝体形态；
[0043] 阶段2 (产孢子时期），菌丝体上产生分生孢子梗，在孢子梗顶端或旁侧产孢细胞 产生瓶梗，在瓶梗顶端产孢垫上产生圆锥状分生孢子；
[0044] 阶段3 (孢子成熟期），成熟的分生孢子从分生孢子梗上脱落，并在其顶端会长出 微小的芽体。
[0045] 实施例1动物肝脏与肾脏的用量研宄
[0046] 配制动物肝脏与肾脏含量不同的固体培养基（见表1)，对培养基中接种的圆锥掘 氏梅里霉菌株生长周期进行了测定。
[0047] 各培养基中的其它成分是NaCl、及无菌水，在每100mL培养基中，含NaCl 0. 5g，琼 脂1. 5g，其余是无菌水。
[0048] 表 1
[0049]
【权利要求】
1. 一种培养圆锥掘氏梅里霉的方法，其特征是，所使用的每lOOmL培养基中，含动物肝 脏lg?50g和/或动物肾脏lg?50g，所述动物是哺乳动物。
2. 权利要求1所述的方法，每lOOmL培养基中，含动物肝脏7g?12g和/或动物肾脏 7g ?12g〇
3. 权利要求1或2所述的方法，培养方式是：将圆锥掘氏梅里霉分生孢子涂布在培养 基表面；用封口膜将培养皿密封后放置于培养箱中进行培养。
4. 权利要求3所述的方法，培养温度25 ±2 °C，培养周期为7-8天。
5. 动物肝脏和/或动物肾脏在圆锥掘氏梅里霉培养中的应用。
6. -种培养基，其特征是，每lOOmL培养基中，含动物肝脏lg?50g和/或动物肾脏 lg?50g，所述动物是哺乳动物。
7. 权利要求6所述的培养基，由NaCl、琼脂及无菌水以及动物肝脏和/或动物肾脏组 成。
8. 权利要求7所述的培养基，所述动物选自猪、牛或羊。
9. 权利要求8所述的培养基，成分如下：每lOOmL培养基中，含动物肝脏10g、动物肾脏 10g、NaCl 0. 5g、琼脂1. 5g，其余是无菌水。
10. 权利要求7所述的培养基的制备方法，步骤为： 1) 将动物肝脏和/或动物肾脏切成小块，用匀浆机将组织打碎，得组织匀浆； 2) 在所得组织匀浆中加入NaCl和琼脂粉，随后加入蒸馏水定容； 3) 121°C 灭菌 15min。
【文档编号】C12N1/14GK104450538SQ201410691108
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】张维, 周正富, 郭倩楠, 徐玉泉, 陈明, 林敏
申请人:中国农业科学院生物技术研究所