一种发酵碳化烟叶颗粒及其制备方法和应用与流程

本发明属于卷烟材料
技术领域：
，具体涉及一种发酵碳化烟叶颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
：卷烟香气是卷烟品质的核心内容，但伴随着低焦化卷烟的发展，卷烟抽吸口感降低，香气不足等已成为烟草发展的凸显问题。如何攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术，已经成为提高卷烟生产竞争力的核心所在。卷烟烟丝中添加烟用香精香料，已是一种常规的、必需的增补香气的技术手段，但其提升卷烟品质的空间已相对有限，故从卷烟非燃烧段出发，寻找相关的新型材料来改善、提升卷烟的香气，降低卷烟烟气刺激性已成为新的发展趋势。其中，在卷烟滤棒中添加一些具有多孔性和特殊香气的颗粒材料，以改善或提升卷烟产品的品质，是一种比较新颖、有效的研究方向。但由于在制备方法及原料选择和组配方面还存在一些问题，使得现有的颗粒材料添加剂优势未能充分发挥出来。比如活性炭、微粉硅胶等吸附性材料制成的颗粒虽然在吸附烟气有害物质上有显著优势，但同时也会造成香味成分的大量吸附，使得卷烟抽吸品质显著降低。而通过制粒法得到的植物颗粒材料，虽然能向卷烟烟气中引入与卷烟香气相协调的香味物质，但往往会因为粘合剂的添加，造成植物材料本身孔洞被包埋，减少了有害物质的吸附位点，降低了降焦减害作用。另外，针对原料的选择及处理，现有技术所公布的各种植物材料与卷烟香气的协调性尚需提升，烟草香气还不够丰富，故继续寻找与烟草本香相协调的植物原料，也是需要继续研究的方向。利用微生物发酵及酶制剂处理可以增加传统提取香料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性，进而生产出香气丰富、高品质的卷烟，满足消费者对卷烟品质的要求。利用微生物对自身具有气味的植物原料进行发酵，还能赋予植物以区别于原有气味的独特香味。植物碳化，可通过高温使植物在短时间内脱水，保留植物内部空隙，增加植物对烟气有害物质吸附的同时，既保留植物原材料部分香味特性，又赋予植物原材料以特殊的焦香味。目前，并没有利用微生物发酵技术联用碳化技术用于卷烟嘴棒颗粒制备的相关研究。针对上述缺点，如何选择恰当的植物原材料并进行改性，以弥补现有工艺技术造成的不足，在降低卷烟烟气刺激性的同时，提高颗粒材料在增加卷烟烟气协调性和生津感方面等的作用，成为需要进一步解决的技术问题。技术实现要素：本发明针对现有植物颗粒对烟气有害物质吸附效果不明显，不能直接对卷烟赋香，或与卷烟香气协调性不佳等缺点，提供一种发酵碳化烟叶颗粒及其制备方法和应用，其通过利用烟草土壤戴氏菌l4-6发酵及碳化工艺对植物原料进行改性，提供一种既能增强卷烟减害降焦效果，降低卷烟烟气刺激性，又能增强卷烟赋香效果和提升卷烟抽吸品质。*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。本发明第一方面涉及一种烟草土壤戴氏菌l4-6，其是从云南昆明烟草种植基地烟草土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16srdna分析，鉴定结果表明其属于烟草土壤戴氏菌，微生物学分类命名为烟草土壤戴氏菌dyellatabacisolil4-6，已于2018年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：cgmcc)保藏，保藏编号为cgmcc1.16273，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。本发明分离得到的烟草土壤戴氏菌l4-6菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在r2a琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈黄色。明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶、吐温20，40，60和80水解呈阳性，淀粉水解、纤维素水解，酪蛋白水解呈阴性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、乳糖、甘露糖、甘油、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(q-8)。本发明所分离得到的烟草土壤戴氏菌l4-6的16srdna基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(genbank)，序列检索号：mf370623。本发明第二方面涉及一种发酵碳化烟叶颗粒，其通过包括以下步骤的方法制备：(1)烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂的制备；(2)利用烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂对烟叶进行发酵，得到发酵烟叶；(3)将发酵烟叶进行碳化处理，得到发酵碳化烟叶；(4)将发酵碳化烟叶粉末置于流化床上干燥，喷洒粘合剂，粘结粉末形成颗粒，继续干燥即得发酵碳化烟叶颗粒。上述发酵碳化烟叶颗粒，步骤(1)具体包括：将烟草土壤戴氏菌l4-6液体菌种按10％的接种量接种到发酵培养基中，28℃摇瓶培养3～7天，得到培养液；每1000ml培养液离心分离，用无菌水洗涤沉淀，最后用20ml无菌水震荡均匀，稀释10倍即得菌剂。上述发酵碳化烟叶颗粒，步骤(2)具体包括：称取预先平衡水分至11％～14％的烟叶，每100g烟叶喷施烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂20ml，将处理好的烟叶置于22℃，60％的恒温恒湿箱中发酵24～72h，得到发酵烟叶。上述发酵碳化烟叶颗粒，步骤(3)具体包括：将发酵烟叶放入炭化炉中，对其进行封闭式加热碳化处理，具体操作步骤为将炉温逐渐升至80℃，待发酵烟叶干燥后迅速升温至120～300℃，并保持1～6h，得到发酵碳化烟叶。上述发酵碳化烟叶颗粒，步骤(4)具体包括如下步骤：1)、检测发酵碳化烟叶的含水率，将含水率控制至8～12％，粉碎成粒径为100～160目的粉末；2)、按照重量份称取90～99份烟叶粉末、1～10份蔗糖或甘露醇粉末，混合均匀，备用；3)、按照重量份称取明胶5～10份、聚乙烯吡咯烷酮0～5份、羧甲基淀粉钠0～2份，用蒸馏水配制成浓度为5～12％的粘合剂溶液；4)、称取步骤2)中的混合粉末300～1000g置于流化床中造粒，造粒过程中喷洒粘合剂溶液，即得发酵碳化烟叶颗粒。上述发酵碳化烟叶颗粒，步骤4)具体包括如下步骤：(a)将混合粉末在流化气压0.12～0.2bar、气流温度50～60℃条件下干燥5～15min；(b)在流化气压0.12～0.25bar、气流温度60～80℃，喷雾压力0.08～0.15bar、喷液速率8～12g/min的条件下，采用顶喷方式施加步骤3)所配制的粘合剂溶液，粘合剂溶液用量为发酵碳化烟叶粉末干物料重量的20％～50％；(c)粘合剂施加完毕后，重复步骤(a)，得到发酵碳化烟叶颗粒。上述发酵碳化烟叶颗粒，步骤(c)得到的发酵碳化烟叶颗粒的水分含量为8～10％，粒径为20～60目，其形状为表面粗糙的类圆形颗粒。本发明第三方面涉及一种卷烟嘴棒，其包含本发明第二方面制备的发酵碳化烟叶颗粒。上述的卷烟嘴棒，每毫米卷烟嘴棒中添加1～2mg发酵碳化烟叶颗粒。本发明具有以下有益效果：(1)本发明通过将烟叶利用烟草土壤戴氏菌l4-6对其发酵，应用于卷烟嘴棒后，在卷烟抽吸过程中，能使烟气刺激性减轻，卷烟烟香丰富性增加，同时具有增加烟气甜润感的功效；(2)本发明通过将发酵后的烟叶进行碳化处理，高温使烟叶细胞在短时间内失水并定型，增加烟叶内部吸附比表面积，显著提高发酵碳化烟叶颗粒对卷烟烟气的过滤效率，能够选择性吸附卷烟烟气有害物质，同时赋予发酵碳化烟叶颗粒以特殊的焦香味；(3)本发明未对植物颗粒生产工艺进行调整，仅通过对原材料的改性，实现提高增香及降焦双重功效，原料易得，成本低廉，便于实现工业化生产，有很好的商业应用价值。附图说明图1为本发明烟草土壤戴氏菌l4-6在r2a培养基上的电镜照片；图2为本发明烟草土壤戴氏菌l4-6及部分相关菌株依据16srdna基因序列构建的系统发育树。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例11.烟草土壤戴氏菌l4-6的分离、培养与鉴定1.1烟草土壤戴氏菌l4-6的分离从云南昆明烟草种植基地取烟草土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g土样，加入90ml无菌水，30℃、180rpm摇床震荡30min；用无菌水将浓度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，将5个浓度的菌液分别取0.2ml涂布于lb平板培养基上，每个浓度的菌液设置3个平行试验，30℃下培养48h，从每份土样的平板上挑取不同单菌落，在lb平板培养基上纯化后按菌液体积20％加入甘油、置于-80℃冰箱保存备用。将分离得到的微生物分别接种于lb液体培养基中，30℃、160rpm摇床振荡培养，培养至菌液浓度为od＝2.0，作为种子液备用。将每一个待测菌株的种子液按1％接种在筛选培养基中，于30℃、160rpm摇床振荡培养3-5天，每天观察发酵液外观和香气变化情况，筛选得一株能够产生香气的微生物，编号l4-6。1.2烟草土壤戴氏菌l4-6的鉴定对分离纯化的菌株l4-6进行形态学、生理生化性质和16srdna分析，鉴定结果表明属于烟草土壤戴氏菌，其微生物学分类命名为烟草土壤戴氏菌dyellatabacisolil4-6。烟草土壤戴氏菌l4-6在r2a培养基上的电镜照片如附图1所示。烟草土壤戴氏菌l4-6在大多数培养基上生长良好，在r2a琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈黄色。明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶、吐温20，40，60和80水解呈阳性，淀粉水解、纤维素水解，酪蛋白水解呈阴性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、乳糖、甘露糖、甘油、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(q-8)。烟草土壤戴氏菌l4-6的生理生化特征如表1所示：表1烟草土壤戴氏菌l4-6的生理生化特征实验生长反应实验生长反应明胶液化+++++吐温20,40,60,和80+++++淀粉水解--纤维素上生长--纤维素水解--碱性磷酸酶++++酪蛋白水解--缬氨酸芳胺酶++++注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性烟草土壤戴氏菌l4-6的碳氮利用情况如表2所示：表2烟草土壤戴氏菌l4-6的碳氮源利用情况碳源利用结果碳源或氮源利用结果糊精+n-乙酰-d-葡糖胺+麦芽糖+甘露醇+海藻糖+果糖+纤维二糖+半乳糖+蔗糖-鼠李糖-棉子糖-丙氨酸-蜜二糖+组氨酸+注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性烟草土壤戴氏菌l4-6的16srdna部分序列如附图说明所示，该序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比较分析，并从数据库获得相关种属的16srdna基因序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的烟草土壤戴氏菌l4-6与菌株(dyellasolijs12-10t)亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的烟草土壤戴氏菌l4-6是一个新物种，命名为dyellatabacisoli。烟草土壤戴氏菌l4-6在genbank数据库的16srdna基因核苷酸序列登录号为mf370623，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc1.16273。烟草土壤戴氏菌l4-6及相关种属的16srdna基因序列构建的系统发育树如附图2所示。实施例21.烟草土壤戴氏菌l4-6的培养(1)试管斜面培养采用斜面保藏培养基，培养基为r2a琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000ml，ph7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种烟草土壤戴氏菌l4-6菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；(2)种子培养采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β-丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到1000ml，ph7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，28℃摇瓶培养36h，获得液体菌种；(3)烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂制备将步骤(2)制得的液体菌种按10％接种量转接到发酵培养基中，28℃摇瓶培养6天，所得培养液以3500r/min离心10min，用无菌水洗涤沉淀，沉淀用20ml无菌水震荡均匀，稀释10倍即为烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂。发酵培养基配方为：大豆粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水定容到1000ml，ph7.2，121℃灭菌25分钟，既得培养基。2.烟叶发酵称取预先平衡水分至13％的烟叶1200g，喷施烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂240ml，将处理好的烟叶放入22℃，60％的恒温恒湿箱发酵48h，得到发酵烟叶。3.发酵烟叶的碳化将发酵烟叶放入炭化炉中，将炉温逐渐升温至约80℃，保持30min，待发酵烟叶干燥后，迅速升温至160℃，并保持2h，检视碳化程度合格后，关闭热源，取出发酵碳化烟叶样品备用。4.发酵碳化烟叶颗粒的制备取发酵碳化烟叶，检测其含水率，补足含水率至10％，粉碎成粒径为120目的粉末；将950g所制烟叶发酵碳化粉末、50g蔗糖粉末，混合均匀，置于midiglatt流化床中造粒，在流化床的流化气压为0.15bar、气流温度为60℃条件下干燥10min；然后按重量份称取明胶5份、聚乙烯吡咯烷酮2份、羧甲基淀粉钠1份，用蒸馏水配制成浓度为8％的粘合剂溶液，在流化气压为0.2bar、气流温度为80℃、喷雾压力为0.15bar、喷液速率为10g/min的条件下，采用顶喷方式施加300g粘合剂溶液；粘合剂施加完毕后，在流化气压为0.15bar、气流温度为60℃条件下干燥5分钟，得到水分含量为8％、表面粗糙、粒径为60目的发酵碳化烟叶颗粒。实施例31.烟草土壤戴氏菌l4-6的培养方法同实施例2。2.烟叶发酵称取预先平衡水分至12％的烟叶600g，喷施烟草土壤戴氏菌l4-6菌剂120ml，将处理好的烟叶放入22℃，60％的恒温恒湿箱发酵72h。3.发酵烟叶的碳化将发酵烟叶放入炭化炉中，将炉温逐渐升温至80℃，保持30min，待烟叶发酵样干燥后，迅速升温至130℃，并保持3h，检视碳化程度合格后，关闭热源，取出发酵碳化烟叶样品备用。4.发酵碳化烟叶颗粒的制备取发酵碳化烟叶，检测其含水率，补足含水率至8％，粉碎成粒径为140目的粉末；将470g所制烟叶发酵碳化粉末、30g甘露醇粉末，混合均匀，置于midiglatt流化床中造粒，在流化床流化气压为0.18bar、气流温度为60℃条件下干燥5min；然后按重量份称取明胶6份、聚乙烯吡咯烷酮2份、羧甲基淀粉钠2份，用蒸馏水配制成浓度为10％的粘合剂溶液；在流化气压为0.2bar、气流温度为70℃、喷雾压力为0.15bar、喷液速率为12g/分钟的条件下，采用顶喷方式施加200g粘合剂溶液；粘合剂施加完后，在流化气压为0.18bar、气流温度为60℃条件下干燥10分钟，制备得到水分含量为10％、表面粗糙、粒径为40目的发酵碳化烟叶颗粒。实施例4为考察烟草土壤戴氏菌l4-6用于发酵烟叶的独特性，实施例4与实施例3的区别在于，以烟草土壤戴氏菌l4-6的亲缘菌种dyellasolijs12-10(购自韩国农业微生物菌种保藏中心(kacc))代替烟草土壤戴氏菌l4-6对烟叶进行发酵，其余操作步骤同实施例3，得到利用dyellasolijs12-10发酵而得的水分含量为10％、表面粗糙、粒径为40目的发酵碳化烟叶颗粒。实施例5将实施例2制备的发酵碳化烟叶颗粒应用在卷烟复合滤棒中，每毫米卷烟滤棒添加1.5mg发酵碳化烟叶颗粒，制备成实验烟支，以不添加上述颗粒的烟支为对照组进行感官评吸和烟气有害成分检测。感官评价结果表明：与对照组相比，添加发酵碳化烟叶颗粒的烟支烟气喉部辛辣刺激感明显减轻，烟香丰富性增加，烟气甜润感明显；烟气有害成分检测表明：实验烟支烟气中，苯酚降低率为24.3％，说明该发酵碳化烟叶颗粒能够显著降低卷烟烟气中的苯酚含量。实施例6将实施例3制备的发酵碳化烟叶颗粒应用在卷烟复合滤棒中，每毫米卷烟滤棒添加1mg发酵碳化烟叶颗粒，制备成实验烟支，以不添加上述颗粒的烟支为对照组进行感官评吸和烟气有害成分检测。感官评价结果表明：与对照组相比，添加发酵碳化烟叶颗粒的烟支烟气刺激性及苦辣味明显降低，自然烟草香气更加丰富，烟气甜润感明显；烟气有害成分检测表明：实验烟支烟气中，苯酚降低率为22.5％，说明该发酵碳化烟叶颗粒能够显著降低卷烟烟气中的苯酚含量。实施例7将实施例4中，以dyellasolijs12-10发酵烟叶，经进一步处理制备而得的发酵碳化烟叶颗粒应用在卷烟复合滤棒中，每毫米卷烟滤棒添加1mg发酵碳化烟叶颗粒，制备成实验烟支；以实施例6中的实验烟支为对照组进行感官评吸和烟气有害成分检测。感官评价结果表明：与对照组相比，以dyellasolijs12-10发酵烟叶制备而得的实验烟支，其烟支烟气刺激性及苦辣味无明显降低，烟气甜润感不足。烟气有害成分检测表明：实验烟支烟气中，苯酚降低率为16.9％，与实施例6中数据进行比较发现，实验烟支有害成分降低率不如对照组卷烟。由此可见，虽是亲缘菌种，但菌种dyellasolijs12-10用于烟叶发酵，并不能取得与烟草土壤戴氏菌l4-6类似的效果。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。附序列表：烟草土壤戴氏菌l4-6的16srdna部分序列如下：序列表<110>云南中烟工业有限责任公司李源栋高莉杨洪明何靓焦俊苏勇夏建军<120>一种发酵碳化烟叶颗粒及其制备方法和应用<130>rib180325<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1508<212>dna<213>烟草土壤戴氏菌(dyellatabacisolil4-6)<400>1agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaagtcgaac60ggcagcacagcagtagcaatactgtgggtggcgagtggcggacgggtgagtaatgcatcg120ggacctacctagacgtgggggataacgtagggaaacttacgctaataccgcatacgtcct180acgggagaaagcgggggatcttcggacctcgcgcggttagacggaccgatgttcgattag240ctagttggtagggtaatggcctaccaaggcgacgatcgatagctggtctgagaggatgat300cagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatat360tggacaatgggcgcaagcctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggtt420gtaaagcacttttatcaggagcgaaatgccattggctaatacccggtggagctgacggta480cctgaggaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaa540gcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggttcgttaggtccgtcgtga600aatccccgggctcaacctgggaatggcgatggatactggcgagctagagtgtgatagagg660atggtggaattcccggtgtagcggtgaaatgcgtagagatcgggaggaacatcagtggcg720aaggcggccatctggatcaacactgacgctgaggcacgaaagcgtggggagcaaacagga780ttagataccctggtagtccacgcccccaaacgatgcgaactggatgttggtctcaactcg840gagatcagtgtcgaaagctaacgcgttaagttcgccgcctggggagtacggtcgcaagac900tgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcga960tgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtctggaatcctgcagagatgcgggag1020tgccttcgggaatcagaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatg1080ttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtccttagttgccagcacgtaatggtgg1140gaactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatc1200atggcccttacggccagggctacacacgtactacaatggtcggtacagagggttgcaata1260ccgcgaggtggagccaatcccagaaagccgatcccagtccggatcgtagtctgcaactcg1320actacgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagctatgccgcggtgaatacgttc1380ccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgagttgctccagaagccgttag1440tctaaccgcaagggggacgacgaccacggagtggttcatgactggggtgaagtcgtaaca1500aggtaacc1508当前第1页12