狄乔治氏综合症的相关新基因及其蛋白的制作方法

专利名称：狄乔治氏综合症的相关新基因及其蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及采用酵母双杂交系统和EST-PCR-RACE克隆技术寻找小儿先天性心脏病的相关基因以及在狄乔治氏综合症(DGS-DiGeorge syndrome)的诊断和治疗中的应用。
先天性心脏病(CHD-congenital heart disease)是所有人类生育缺陷中最常见的疾病。每年约有3万多新生儿患有CHD病，它是出生后第一年引起死亡的最主要原因。狄乔治氏综合症是先天性心脏病的典型代表之一。在新生儿其发病率是四千分之一[Pediatric Research 48:717-724,2000]。该综合症主要表现在耳朵畸形、腭裂、副甲状腺发育不足、胸腺-T细胞缺损、间断性主动脉弓、溢出径畸形以及胸腺发育不全。绝大多数(90％)狄乔治氏综合症患者具有染色体22q11.2区域的缺失，其长度达3百万碱基对(3-Mb)[Current protocols in molecular biology1996；J Endocrinology 1998,139:4870-4880；Am J Hum Genet,61:620-629,1997]。也有部分病人存在约2百万碱基对(2-Mb)的缺失，但缺失的部位与常见缺失部位仅有部分区域相同，如图1所示。另有报道称，染色体17p13位点的缺失也能引起类似DGS症状[Am.J.Med.Genet.31:1-4,1988]虽然，狄乔治氏综合症已经研究了三十多年，并且证明染色体22q11.2和17p13缺失与该疾病有关，可是到目前为止没有任何单一基因被证明能引起该综合症。某些基因，例如HIRA和UFDIL存在于22q11.2部位，并且是在DGS患者受到影响的组织中得到表达[Circ Res 84:127-135,1999,Science 283:1158-1161]。然而，鼠单缺失HIRA或UFDIL显然属于正常情况[Nature 401:379-383,1999]。由于大部分病人被检测到的缺失达几百万碱基对，越来越多的证据表明，这一综合症可能是由多基因联合控制的[Pediatric Research 48:717-724,2000]。
本发明阐明了三个与DGS相关的基因FKSG1、FKSG3和FKSG4的克隆、表达产物的鉴定和制备。其目的是提供三种新的多核苷酸序列，提供三种新的蛋白以及利用重组技术生产所述新蛋白的方法，同时还提供这些新基因和蛋白在诊断和治疗狄乔治氏综合症中的应用。
本发明的内容与技术方案如下1 DGS相关基因FKSG1的克隆为了鉴别存在于DGS病人经常缺失的22q11.2区域内的新基因，本发明采用了一种特殊的cDNA克隆方法[Life Sciences63(17):1555-1562,1998]。该方法综合采用了cDNA选择、EST(expressed sequence tag)定位、基因组DNA序列分析、PCR反应以及克隆末端延展(RACE-Rapid amplification of cDNA ends)等技术。本发明根据所涉及的几个要素的组合从NCBI的EST数据库进行检索，结果表明存在217个阳性克隆片段，用来自每一个阳性克隆的cDNA片段与NCBI的GenBank中所报道的已知基因进行比较，进一步分析比较结果，发现有一个EST克隆(AA312178)含有328个碱基对，该序列与任何已知的序列均不相同，但存在于基因组序列片段(AC000089)。如图1所示，AC000089存在于DGS病人常缺失区域。AA312178在AC000089片段中存在于3个不同的部位。AA312178中的头96个碱基与AC000089片段中37192-37094部位的碱基完全相同；AC312178中的97-259碱基与AC000089片段中28946-28783部位的碱基一样；而AA312178中的最后部位260-328与AC000089中23255-23228区域的碱基相吻合。这些结果表明，EST AA312178克隆含有1个未知新基因的部分片段，用AA312178的核苷酸序列进一步查询EST数据库发现，AI870670克隆与AA312178部分相重叠。
继而合成了两个引物引物A5’-TCGGTCTCTGGACGCTGCGCGGCG-3’来自AA312178(SEQ IDNO.1)引物B5’-CGTCTTGGAGGGCATCTCCAGAAT-3’来自AI870670(SEQ IDNO.2)以人体心脏cDNA文库(pGAD10作为文库载体，购自Clontech公司)为模板，采用(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)进行PCR反应。PCR条件为93℃2分钟，随之以93℃30秒、62℃30秒和72℃1分钟进行30个循环，最后72℃延伸4分钟，琼脂糖电泳显示获得了一个0.6kb的PCR产物，进一步用RACE方法，首先合成引物C、D、E、F。引物C5’-ACTACAATGGATGATGTATATAACT-3’(SEQ ID NO.3)来自
pGAD10第761-785核苷酸(基因库查询编号U13188)，引物D5’-GACCTCGGCGATCCCGGGATT-3’(SEQ ID NO.4)来自0.6kb PCR产物第45-65核苷酸，引物E5’-TTCGATGATGAAGATACCCCA-3’(SEQ ID NO.5)来自文库载体pGAD10第791-811核苷酸，引物F5’-GAGTTCATGAGTCCCACGCACC-3’(SEQ ID NO.6)来自0.6kb PCR产物第21-42核苷酸，用引物C和D以人体心脏cDNA文库作为模板，通过PCR方法扩增5’末端产物，然后用该产物作为模板，用引物E和F再次扩增，获得了一个1507bp的cDNA片段(SEQ ID NO.7)(图2a)。该cDNA编码含有327个氨基酸的蛋白(SEQ IDNO.8)(图2b)。在编码蛋白质起始位点前177bp处有一个终止序列(TAA)，进一步证明了这一蛋白起始位点的准确性。在cDNA的3’-末端有一个(AATAAA)序列，表明了该cDNA的完整性。所得到的cDNA序列已在NCBI基因库注册(编号AY007378,2000年8月25日送入，2000年9月14日公布)。本发明命名这一新基因为FKSG1(丰科盛公司一号基因)(图3)。2000年11月2日NCBI给予FKSG1新编号NM021169(NM-常用于确认新基因的首创者)；2001年2月10日NCBI染色体注释项目组给予FKSG1编号XM009843(XM-用以确认在染色体图定位的新基因)，继而给予FKSG1编号NT100519(NT-用以表示组成人类染色体图的基因序列)，同时确认FKSG1存在于第22条染色体22q11并在HIRA和ARVCF基因之间(图4)。该区域在90％DGS病人中表现为缺失。FKSG1存在于两条基因组序列(AC000076和AC000089)中，并且由7个不同的外显子(exon)所组成(图5)。该基因主要表达于人体心脏组织，也在肝脏、肌肉以及肾组织中存在(图6)。同源性序列比较表明，FKSG1与人体G蛋白中的β亚基结构具有21％的相同性和47％的相似性(图7)。2 FKSG1在大肠杆菌中的表达本发明首先合成了含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物。引物G5’-ATCCGGATCCGCATGACGGCCCCCTGC-3’(SEQ ID NO.9)，引物H5’-TGCTGAATTCTCATGCGCGTGGGTAGAG-3’(SEQ ID NO.10)，用引物G和H，以及克隆的FKSG1 cDNA作为模板，通过PCR方法扩增了含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的FKSG1 PCR产物，克隆的PCR片段经酶切后，连接到pGEX-5X载体上，连接后的重组质粒pGEX-5X/FKSG1转入到大肠杆菌BL21细胞，含pGEX-5X/FKSG1的阳性转化子在补加氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的LB液体培养基中过夜培养。过夜培养物以1∶100稀释后，接种到大体积培养基中，培养细胞至光密度600nm(OD600)为0.5-0.8，随后加入IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)至终浓度为1mM。通过使lacⅠ阻遏物失活，IPTG诱导启动子导致基因表达水平提高，继续培养细胞3小时，随后离心(6000×g20分钟)，收集细胞，用液氮处理，然后用超声裂解包含体，离心除去不溶物，于上清液中加入50％谷胱甘肽-琼脂糖珠，4℃反应1小时，离心收集琼脂糖珠，用PBS缓冲液洗脱多次之后，从琼脂糖珠中回收谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白GST-FKSG1。用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为65kDa(图8)。因为GST的分子量约为28kDa，所以FKSG1的分子量推测为37kDa，从FKSG1序列(SEQ ID NO.8)进行推测，其理论值约为35.5kDa，因而表明大肠杆菌中表达的FKSGl与理论推测值基本一致。3 FKSG1在真核细胞(Hela细胞株)中的表达为了检测FKSG1在真核细胞内的表达，本发明合成了一条含18个氨基酸的多肽PQFVLRGTQSPVHALHFC(SEQ ID NO.11)，其序列与FKSG1中的第12-28氨基酸完全相同。用纯化的多肽来免疫家兔，从而获得抗FKSG1的抗体，所产生的抗体可特异性地与合成的多肽以及细菌中分离得到的GST-FKSG1重组蛋白相结合。
本发明构建了在真核细胞表达FKSG1的载体，首先合成了二个引物用于PCR反应，使用的5’寡核苷酸引物序列为引物I5’-TTGAGAATTCATGACGGCCCCCTGCCCGCCG(SEQ ID NO.12)该引物含有EcoRⅠ酶切位点，在该酶切位点之后是包含起始密码子的FKSG1编码序列的21个核苷酸，3’端引物序列为引物J5’-CGATCTCGAGTCAGTCGCGTGGGTAGAGTGA(SEQ ID NO.13)该引物含有XhoⅠ限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和FKSG1的部分编码序列。用这二个引物通过PCR反应，从人体心脏cDNA中获得编码FKSG1的cDNA。这一cDNA片段插入到真核表达载体pcDNA3的EcoRⅠ-XhoⅠ位点。测序验证，FKSG1的cDNA片段已正确地插入pcDNA3载体。用Lipofectamine的试剂将pcDNA3/FKSG1转染到Hela细胞中，培养16小时之后，收集细胞，用PBS洗脱，然后用液氮处理5分钟，加入3％SDS裂解液，在12％聚丙酰胺凝胶中电泳分离，电转移至硝酸纤维膜，用TBS-T溶液(20ml 1M Tris HCl pH7.5；26.7ml 5M NaCl；1ml Tween20；1L dH2O)浸洗，用20ml封闭液(2.5g脱脂奶粉；50ml TBS-T)封闭1小时，然后用抗FKSG1抗体处理1小时(室温)，经洗脱液(6g脱脂奶粉；600ml TBS-T)洗脱后，加入二抗体(抗兔HRP)处理1小时，洗膜3次之后，加入ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech公司产品)显色(图9)。FKSG1的分子量约为37kDa。
为了进一步定位FKSG1，将FKSG1/pcDNA3重组质粒转染到Hela细胞之后，含有细胞的薄片用PBS缓冲液洗脱、干燥1小时后，用含有4％paraformadehyde的PBS液固定30分钟，经PBS-T淋洗1次后，用抗FKSG1抗体检测蛋白(图10)。结果表明，FKSG1既存在于细胞质内，也存在于细胞核中。4 DGS相关基因FKSG3的克隆为了进一步了解FKSG1的作用机理，本发明采用了酵母双杂交系统来寻找与FKSG1相互作用的蛋白。酵母双杂交系统是一种以酵母的遗传学分析为基础，研究蛋白质与蛋白质相互作用的实验体系。该体系是根据下述原理建立的酵母中半乳糖代谢通常是被GAL4和GAL80调节蛋白所控制，GAL4蛋白与其相关的上游激活序列(UAS)结合，即能激活参与半乳糖代谢的一系列基因的转录。在经详细设计构建的酵母双杂交系统中，酵母转录因子的DNA结合功能区(BD)和转录激活功能区(AD)在物理上和功能上均分别处于相对独立的结构域中，单独与BD结合的蛋白BD-X或与AD结合的AD-Y都不能启动下游报告基因的转录，但BD-X与AD-Y相互作用可以重新形成有功能的转录因子，从而激活含有BD结合位点的启动子下游报告基因(lacZ)的表达，表现为β-半乳糖苷酶的活性。如果在表达性基因文库中存在AD-Y，则用BD-X可直接从该文库中筛选与之相互作用的AD-Y基因序列。
本发明用FKSG1作为酵母双杂交系统中的诱饵蛋白，从人胎儿心脏cDNA文库(美国Clontech公司产品)筛选与之相互作用的蛋白。含有EcoRⅠ位点(N-末端)和XhoⅠ位点(C-末端)的FKSG1编码片段插入到酵母双杂交载体pGBT9相应位点，所构建的载体用来转化酵母菌，利用科隆技术公司的酵母双杂交系统-2在缺乏组氨酸、亮氨酸及色氨酸的SD培养基上，筛选约4×106酵母Y190转化子，共得到34个阳性克隆，将阳性克隆转移到滤纸上，在液氮罐中速冻、解冻，使细胞透化。将含有酵母细胞的滤纸浸泡在Z缓冲液(60mMNa2HPO4、40mMNaH2PO4、10mMKCl、10mM MgSO4、50mMβ-巯基乙醇和0.33mg/mlX-gal)中，然后将滤纸在30-37℃温育2-24小时，有6个克隆呈蓝色表型，表明其中β-半乳糖苷酶基因表达为阳性。提取阳性克隆中的DNA，经酶切分析表明，其中有一个克隆重组质粒含有615bp插入片段(图11)。DNA测序以及氨基酸序列分析显示，该片段含有114个氨基酸以及3′-末端未编码区。用所获得的氨基酸序列检索NCBⅠ基因库，结果表明，克隆得到的DNA片段座落在第22条染色体22q11.2(图1)，分布在四个exon(NCBⅠ基因库，AP000553)(图12)。
所分离得到与AD区域相连接的cDNA缺失了N末端的头5个氨基酸。完整的cDNA编码一种含有119个氨基酸的蛋白(NCBⅠ基因库，AF060862)。根据基因组序列信息，本发明设计了2个特定的引物引物K5’-CAGCTGTGTGGACAGTGCCAC-3’(SEQ ID NO.14)引物L5’-TTTAAGTCATCAGTTGGTTAA-3’(SEQ ID NO.15)用这两个引物，从人体胎儿心脏cDNA文库中通过PCR方法，成功地克隆出一段完整的cDNA序列(SEQ ID NO.16)(图13a)，现己送交NCBⅠ基因库(2000年9月12目，登录号AF305069，将于2001年10月1日公开)。该cDNA编码的蛋白质能与FKSG1发生相互作用，该蛋白质被命名为FKSG3(SEQ ID NO.17)(图13b)。FKSG3距FKSG1约1.5百万碱基对。FKSG1和FKSG3都处于大多数DGS病人所缺失的部位。特别值得注意的是，FKSG3存在于常见缺失片段(约3Mb)与少见缺失片段(约2Mb)相交界的区域(见图1)。5 DGS相关基因FKSG4的克隆在研究与FKSG3结构相似的蛋白质过程中，本发明注意到有一段94kb长的基因组序列来自第17条人体染色体(NCBⅠ基因库登录号AC005667)，在该片段中含有与FKSG3几乎完全相同的氨基酸序列。利用这一基因组序列进一步检索所公布的染色体定位数据，结果表明，该94kb片段位于染色体17p13位点上。同一相似蛋白家族的一个成员(FKSG3)位于22q11.2，而另一成员(94kb中的基因组序列)位于17p13，这一发现对文献报道的有些DGS患者在第22条染色体上有缺损，而另一些忠者在第17条染色体上有异常的现象，从基因水平提供了解释。
根据FKSG3及AC005667提供的17p13基因组序列信息，本发明设计了二个引物引物M5’-CATCACCAGTGTGTGGAGCCT-3’(SEQ ID NO.18)引物N5’-TTGTTTTCAGCCAAAAACTAG-3’(SEQ ID NO.19)用引物M和N通过PCR方法，从人体胎儿心脏cDNA文库中克隆了一段755bp的cDNA序列(SEQ ID NO.20)(图14a)。该片段编码一个含有119个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO.21)(图14b)，本发明将其命名为FKSG4(2000年9月12日递交NCBⅠ基因库，登录号AF305195，将于2001年10月公布)。6 FKSG3和FKSG4在真核细胞内的表达和定位为了观察FKSG3和FKSG4这一家族成员在细胞内的表达情况以及功能分析，本发明首先将HA标签肽(MYPYDVPDYA)基因与编码FKSG3和FKSG4的基因相连，然后构建到真核表达载体(pcDNA3)中，从而能够通过检测HA标签肽来观察FKSG3和FKSG4在体内的表达。Hela细胞培养是在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s培养基平皿中进行。当细胞生长分布至50-80％平皿时，将5μg质粒DNA(pcDNA3/HA-FKSG3或pcDNA3/HA-FKSG4)加入500μl无抗生素和无血清的Dulbecco’s培养基，加入30μl Lipofectamine试剂(美国生命技术公司)室温保持20-40分钟，再用培养基(含10％胎牛血清，1％抗生素)稀释5倍，将DNA/脂质体直接加在所培养的Hela细胞上，继续培养16小时，收集细胞，加入裂解缓冲液(德国宝灵曼公司产品)，在10-15％聚丙酰胺凝胶中电泳分离，电转移至硝酸纤维膜，用20ml封闭液[30％BSA 1ml加TBS(Tris-HCL1M pH7.5 50ml；5MNaCL 30ml；H2O 920ml)19ml]封闭1小时，加20μg HA抗体(Santa Crus Biotech公司)，保温1-2小时，用TBST缓冲液(0.5MNaCL,20mMTris pH8.0,0.01％Tween20)洗涤3-5次，再加羊抗鼠二抗辣根过氧化物酶温育1-2小时，洗膜3次，加ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech公司产品)显色(图15)。FKSG3和FKSG4具有相同大小的蛋白产物。从理论上判断FKSG3和FKSG4的分子量约为15kDa。本发明所观察到的产物与理论判断值基本一致。FKSG3在细胞中比FKSG4有更强的表达。
为了进一步将FKSG3和FKSG4在细胞中定位，本发明用pcDNA3/HA-FKSG3或pcDNA/HA-FKSG4转染Hela细胞，16小时培养之后，用PBS缓冲液洗涤，然后干燥1小时，再用含有4％paraformaldehyde的PBS固定30分钟。固定细胞之后，用PBS洗涤5次，用10％羊血清+PBST封闭30分钟，再用PBST淋洗一次，用抗HA羊克隆抗体检测蛋白，结果显示，FKSG3和FKSG4既存在于细胞质内，也存在于细胞核中(图16)。7 FKSG3和FKSG4在大肠杆菌中的表达为使FKSG3和FKSG4在细菌中表达并能分离纯化重组蛋白，本发明采用GST融合蛋白表达载体pGEX-5X-1，首先合成了含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的4个引物，引物O5’-GCGGGGATCCAGATGGTGAAAATGACAAAG-3’含有BamHⅠ酶切位点(SEQ ID NO.22)；引物P5’-CCAGGAATTCTTACTCCCAGCCATTGTCTTT-3’含有EcoRⅠ酶切位点(SEQ ID NO.23)；引物Q5’-TCAGGGATCCCAATGGTGAAGATGACAAGATCG-3’含有BamHⅠ酶切位点(SEQ ID NO.24)；引物R5’-TGCTGAATTCTCAGTCCCAGCCATTGTC-3’含有EcoRⅠ酶切位点(SEQ ID NO.25)。
用克隆的FKSG3 cDNA作为模板，用引物O和引物P，扩增了含BamHⅠ-EcoRⅠ酶切位点的FKSG3产物。用克隆的FKSG4 cDNA作为模板，用引物Q和引物R，扩增了含BamHⅠ-EcoRⅠ酶切位点的FKSG4产物。克隆的PCR片段经酶切后，连接到pGEX-5X-1载体上，组成pGEX-5X-1/FKSG3和pGEX-5X-1/FKSG4重组质粒。
分别将pGEX-5X-1/FKSG3和pGEX-5X-1/FKSG4转化至大肠杆菌BL21细胞，在含有Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养，然后稀释1∶100接种到大体积培养基中(500ml)，培养细胞至光密度600nm(OD600)为0.5-0.8，再加入IPTG至终浓度为1mM,3小时后离心(6000×g 20分钟)收集细胞，经液氮处理后用超声裂解包涵体，离心除去不溶物，于上清中加入50％谷胱甘肽-琼脂糖珠，4℃处理60分钟，离心收集琼脂糖株，经PBS缓冲液洗涤多次后，从琼脂糖珠中回收GST融合蛋白GST-FKSG3和GST-FKSG4，在12％的SDS-PAGE胶中电泳，结果显示，GST蛋白分子量为～28kDa(第2行)，而GST-FKSG3(第3行)和GST-FKSG4(第4行)的分子量相同约为42kDa(图17)，表明FKSG3和FKSG4的分子量约为14kDa，与理论推测值(13.5kDa)相一致。8 FKSG1与FKSG3和FKSG4相互作用的证实为证实FKSG1与FKSG3和FKSG4蛋白之间的相互作用，本发明将FKSG1编码基因进行体外翻译表达，并通过放射性同位素标记蛋白产物，检测与FKSG3和FKSG4的结合情况。为此将含有FKSG1的pcDNA重组载体作为模板，用T7RNA聚合酶在TNT T7偶联兔网状细胞裂解液(Promega公司)中进行体外翻译表达，用35S蛋氨酸标己FKSG1产物，所获得的35S标记的FKSG1产物与含GST-FKSG3或GST-FKSG4或GST的Glutathione SepharoseTM4B相混合，在含150mMNaCl,1MmDTT,10mMTris-HCl,pH8.0溶液中温育(30℃)60分钟，离心后用缓冲液洗脱数次，能与GSF-FKSG3或GSF-FKSG4相结合的35S-FKSG1将留在Glutathione Sepharose上而不被洗脱，不能与GST相结合的35S-FKSG1将被洗脱。当最终产物经煮沸后用12％SDS-PAGE胶进行电泳，放射自显影得到图18结果。这些数据表明，35S-FKSG1能与GST-FKSG3或GST-KSG4结合，但不能与GST结合。
本发明的有益效果在于1．利用本发明设计的引物通过PCR方法可以制备FKSG1、FKSG3和FKSG4基因亦可通过含本发明的基因载体转入宿主细胞，经对宿主细胞的大量培养增殖和提取、纯化DNA获得；同时亦可采用人工合成的方法得到有关核苷酸序列，经适当处理后，可实施其对基因缺失的DGS患者的基因治疗或辅以其它方式的基因治疗。
2．本发明提供的DGS相关基因产物可以在原核细胞及真核细胞中表达和制备，利用本发明所提供的含有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.20所述核苷酸序列或其突变体重组质粒，转入宿主细胞，在适合的培养条件和基因表达操作步骤中，分离、纯化蛋白质，使之形成DGS的治疗药物或其组合药物。
3．本发明还包含可用作探针的核苷酸序列，如编码SEQ ID NO.11所述氨基酸序列的核苷酸序列，该探针可用于检测样品中是否存在编码FKSG1的基因序列，以此来诊断DGS病。
4．本发明还以FKSG1部分片段免疫家兔为例，阐述了抗FKSG1特异性抗体的制备。采用同样的方法，也可制备抗FKSG3和FKSG4的抗体。本发明涉及的抗体也可采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。本发明的抗体可以用多肽合成仪合成，也可通过原核细胞或真核细胞得到基因产物免疫动物来制备，所获得的抗体可以用来制备DGS病的诊断试剂。


图1 狄乔治氏综合症患者染色体22q11.2区域缺失示意图其中，标示了本发明FKSG1和FKSG3基因的所在部位及相对应的基因组序列片段图2 FKSG1基因的核苷酸序列及氨基酸序列其中2a-FKSG1基因的核苷酸序列2b-FKSG1基因的氨基酸序列图3 美国生物技术信息中心(NCBI)基因库收录的FKSG1基因信息图4 FKSG1基因被NCBI确认并编入人体染色体图的定位图5 FKSG1基因的外显子(exon)组成图其中，1、2、3、4、5、6、7分别表示7个外显子，FKSG1 cDNA来自基因组序列片段AC000076和AC000089图6 FKSG1基因在人体不同组织中的表达(Northern blot)其中1-心脏2-脑3-胎盘4-肺5-肝6-骨骼肌
7-肾8-胰腺图7 FKSG1与人体G蛋白β亚基的同源性比较其中-相同性·-相似性图8 FKSG1与谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白在大肠杆菌中的表达(12％SDS-PAGE)其中1-FKSG1与谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白(65kDa)2-GST蛋白(～28kDa)图9 FKSG1在真核细胞中的表达(Western blot)其中1-FKSG1/载体pcDNA3(37kDa)2-载体pcDNA3图10 FKSG1在真核细胞中的定位其中1-FKSG1-HA在细胞质中的定位2-FKSG1-DAPI(4’,6’-diamidine-2-phenylindoledihydrochloride)在细胞核中的定位图11酵母双杂交实验中与FKSG1呈阳性克隆的重组质粒酶切电泳图，其中1-DNA分子量标准2-重组质粒-1BglⅡ酶切3-重组质粒-2BglⅡ酶切4-重组质粒-3BglⅡ酶切5-重组质粒-4BglⅡ酶切图12 FKSG3基因在第22条染色体上的定位及外显子(exon)组成13 FKSG3基因的核苷酸序列及氨基酸序列其中2a-FKSG3基因的核苷酸序列2b-FKSG3基因的氨基酸序列图14 FKSG4基因的核苷酸序列及氨基酸序列其中2a-FKSG4基因的核苷酸序列2b-FKSG4基因的氨基酸序列图15 FKSG3和FKSG4在真核细胞中的表达(Western blot)其中1-标签肽(HA)-FKSG32-标签肽(HA)-FKSG4图16 FKSG3和FKSG4在真核细胞(Hela)中的定位其中1-FKSG3-HA在细胞质中的定位2-FKSG3-DAPI在细胞核中的定位3-FKSG4-HA在细胞质中的定位4-FKSG4-DAP1在细胞核中的定位图17 FKSG3、FKSG4与谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白在大肠杆菌中的表达(SDS-PAGE)其中1-蛋白质分子量标准2-GST蛋白3-GST-FKSG34-GST-FKSG4图18 FKSG1与FKSG3和FKSG4蛋白相互作用(12％SDS-PAGE)其中1-35S蛋氨酸标记的FKSG1产物2-35S-FKSG1与GST反应后的产物3-35S-FKSG1与GST-FKSG3反应后的产物4-35S-FKSG1与GST-FKSG4反应后的产物
权利要求
1．狄乔治氏综合症(DGS)相关新基因及其蛋白，其特征在于所说的新基因FKSG1、FKSG3和FKSG4是从DGS患者染色体缺失区克隆、鉴定出来的；其编码的蛋白之间具有相互作用；基因及其产物在原核细胞和真核细胞中均能进行表达和制备。
2．如权利要求1所述的DGS相关新基因及其蛋白，其特征是FKSG1含有如SEQ ID NO.7所说的核苷酸序列及SEQ ID NO.8所说的氨基酸序列。
3．如权利要求1所述的DGS相关新基因及其蛋白，其特征是FKSG3含有如SEQ ID NO.16所说的核苷酸序列及SEQ ID NO.17所说的氨基酸序列。
4．如权利要求1所述的DGS相关新基因及其蛋白，其特征是FKSG4含有如SEQ ID NO.20所说的核苷酸序列及SEQ ID NO.21所说的氨基酸序列。
5．如权利要求1或2所述的DGS相关新基因及其蛋白，其特征包括FKSG1所编码的蛋白质，或其活性片段，或其活性突变体。
6．如权利要求1或3所述的DGS相关新基因及其蛋白，其特征包括FKSG3所编码的蛋白质，或其活性片段，或其活性突变体。
7．如权利要求1或4所述的DGS相关新基因及其蛋白，其特征包括FKSG4所编码的蛋白质，或其活性片段，或其活性突变体。
8．一组原核表达载体和真核表达载体，其特征是它们含有权利要求1所说的DNA分子。
9．如权利要求8所述载体转化的宿主细胞。
10．如权利要求9所述宿主细胞包含大肠杆菌和真核细胞。
11．如权利要求5或6或7所述蛋白质的制备方法。
12．一组能与权利要求5或6或7所述蛋白质特异性结合的抗体。
13．用权利要求12所述抗体制备的DGS病的诊断试剂或治疗药物或药物组合物。
14．权利要求1或2或3或4所述的新基因FKSG1、FKSG3和FKSG4，或其片段或其突变体，经过适当处理可直接用作DGS病的基因治疗制剂。
全文摘要
本发明涉及小儿先天性心脏病狄乔治氏综合症(DGS)的相关新基因FKSG1、FKSG3和FKSG4及其新蛋白,所说的基因是从DGS患者染色体缺失区克隆、鉴定出来的,其编码的蛋白之间具有相互作用,基因及其产物能在原核细胞和真核细胞中进行表达和制备,本发明还阐述了这些新基因和蛋白在诊断和治疗狄乔治氏综合症中的应用。
文档编号A61K38/17GK1314468SQ0110987
公开日2001年9月26日 申请日期2001年3月22日 优先权日2001年3月22日
发明者王以光, 龔利民, 叶冰冰 申请人:北京丰科盛功能基因技术有限公司